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Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis es técnicamente difícil de detectar en vivo porque las células que se han invertido el proceso de muerte celular pueden ser morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales. Aquí se describen los protocolos para la detección y seguimiento de las células que se someten a la anastasis en animales vivos mediante nuestro sistema de biosensor desarrollado recientemente en vivo CaspaseTracker.

Abstract

Anastasis (griego para "elevar a la vida") es un fenómeno de recuperación celular recientemente descubierto por el que mueren las células puede revertir procesos de muerte celular de fase que se asumen generalmente para ser intrínsecamente irreversible. Promoción de anastasis podría en principio rescate o preservación lesionado las células que son difíciles de reemplazar como cardiomiocitos o neuronas, facilitando la recuperación del tejido. Por el contrario, supresión de la anastasis en células de cáncer, que experimenta apoptosis después de terapias contra el cáncer, puede asegurar la muerte de la célula de cáncer y reducir las posibilidades de recurrencia. Sin embargo, estos estudios se han visto obstaculizados por la falta de herramientas para el seguimiento del destino de las células que experimentan la anastasis en animales vivos. El desafío es identificar las células que se han invertido el proceso de muerte celular a pesar de su aspecto morfológico normal después de la recuperación. Para superar esta dificultad, hemos desarrollado Drosophila y mamíferos CaspaseTracker sistemas de biosensores que pueden identificar y rastrear permanentemente anastática células in vitro o en vivo. Aquí, presentamos en vivo los protocolos para la generación y uso del sistema CaspaseTracker doble biosensor para detectar y rastrear anastasis en Drosophila melanogaster después de la exposición transitoria a los estímulos de la muerte de la célula. Si bien biosensores convencionales y protocolos pueden etiquetar las células activamente en la muerte celular apoptótica, el biosensor CaspaseTracker puede etiquetar permanentemente las células que se han recuperado después de la activación de la caspasa - un rasgo distintivo de la etapa tardía de apoptosis, y al mismo tiempo identificar procesos apoptóticos activo. Este biosensor también puede seguir la recuperación de las células que otras formas de muerte celular que directa o indirectamente afectadas actividad caspasa. Por lo tanto, este protocolo nos permite seguir continuamente el destino de estas células y su progenie, facilitar futuros estudios de las funciones biológicas, mecanismos moleculares, las consecuencias fisiológicas y patológicas e implicaciones terapéuticas de Anastasis. También discutimos los controles adecuados para distinguir las células que se someten a anastasis que mostrar no apoptótica caspasa actividad in vivo.

Introduction

Programan la muerte celular, como la apoptosis, juega un papel esencial en el desarrollo embrionario y la homeostasis normal al eliminar no deseadas, heridas o peligrosas células en organismos multicelulares1,2,3. La pérdida del equilibrio entre la muerte celular y la supervivencia puede conducir a consecuencias fatales como cáncer, insuficiencia cardíaca, autoinmunidad y degeneración4,5,6,7,8. Desencadena la activación de caspasas ha sido considerada tradicionalmente como el "punto de no retorno" en apoptosis9,10,11, que verdugo demolición celular rápida y masiva12, 13,14,15,16. Desafiando este dogma general, hemos demostrado que cultivos de células primarias muertos y las células cancerosas pueden recuperar no sólo después de la activación de caspasas, pero importante también siguientes de la célula características distintivas de la muerte como membrana del plasma blebbing, contracción de la célula, la fragmentación mitocondrial, liberación mitocondrial del citocromo c al citosol, nuclear y condensación de la cromatina, daños en el ADN, fragmentación nuclear, la célula superficial exposición de fosfatidilserina (PS) y la formación de cuerpos apoptóticos 17 , 18 , 19 , 20 , 21. proponemos que anastasis es un fenómeno de recuperación de células intrínsecas, como la muerte de las células pueden recuperar después de la eliminación de la célula muerte estímulos17,18,19,20, 21. acuñó el término "Anastasis" (Αναστάσης)18, que significa "levantamiento a la vida" en griego, para describir este fenómeno de recuperación inesperada de la célula. Nuestra observación de anastasis es apoyado por estudios independientes recientes que revelan también la recuperación de las células después de fosfatidilserina externalización22,23,24, limitado mitocondrial externa permeabilización de membrana25, activación de linaje mixto como quinasa (MLKL) y de contracción celular26.

Caracterización de los mecanismos de regulación de la anastasis tendrá consecuencias fisiológicas, patológicas y terapéuticas cambian paradigmas. Anastasis podría representar un mecanismo previamente desconocido citoprotector para rescatar o preservar importantes postmitotic células y tejidos que son difíciles de reemplazar y posiblemente cuenta de reversión de la insuficiencia cardíaca, ventricular descarga con ventrículo izquierdo ayudar a los dispositivos (VAD)27,28, recuperación de células fotorreceptoras después de la exposición transitoria de excesiva luz29,30,31, o reparación de las neuronas después de lesión de cerebro32. Si es así, promover la anastasis podría mejorar la recuperación de células y tejidos. Por el contrario, anastasis podría ser una táctica de escape inesperado utilizada por las células cancerosas a sobrevivir la terapia de inducción de muerte celular, causando cáncer recurrencia17,18. Por lo tanto, supresión de la anastasis al morir las células de cáncer durante y después de tratamiento contra el cáncer podría ser una nueva estrategia terapéutica para curar el cáncer mediante la prevención de sus recaídas.

Durante el proceso de anastasis, hemos encontrado que algunas células recuperadas adquirieron permanentes alteraciones genéticas y experimentaron la transformación oncogénica, probablemente debido a daños en el ADN que se incurra durante apoptosis18,20,21 . Invertir el proceso de muerte de las células dañadas de ADN podría ser un mecanismo de tumorigénesis, potencialmente subyacente a la observación que se repite la lesión tisular aumenta el riesgo de cáncer en una variedad de tejidos, tales como crónicas lesiones térmicas en el esófago inducida por por el consumo de bebidas muy calientes33,34,35, daño hepático por alcoholismo36,37, evolución del tumor después de genotóxicos cáncer terapia38, 39,40y el desarrollo de nuevos cánceres de los tejidos normales que surgen durante los intervalos entre los ciclos de terapia contra el cáncer41,42,43,44 . Si es true, dirigidos a anastasis podrían prevenir o detener el desarrollo del cáncer y la progresión. Hemos encontrado que inducido por hambre morir células de germen se someten a anastasis en re-fed Drosophila19.  Si anastasis se produce en las células germinales con daño en el ADN, puede ser cuenta para la observación de que prolongado estrés ambiental promueve el desarrollo de enfermedades genéticas. Por ejemplo, las hambrunas contribuyen al desarrollo de enfermedades heredables transgeneracionales como la diabetes y enfermedades coronarias del corazón45. Por lo tanto, comprensión anastasis podría conducir a estrategias para la prevención de enfermedades hereditarias causadas por este mecanismo potencial de desarrollo.

Para aprovechar el descubrimiento de anastasis y dirigirla para desarrollar terapias innovadoras, es esencial para el estudio de la causa y la consecuencia de la anastasis en animales vivos. Sin embargo, es técnicamente difícil para identificar y rastrear anastática células en vivo, porque las células que recuperados del proceso de muerte celular aparecen morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales, y no es ningún biomarcador de anastasis identificado sin embargo17,18,21. Para abordar estos problemas, hemos desarrollado recientemente un nuevo en vivo caspasa biosensor designado "CaspaseTracker"19, para identificar y rastrear las células que sobreviven apoptosis después de la activación de caspasas de19,46, el sello de apoptosis10,14. Distinción de los biosensores de caspasas "tiempo real" como SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52 que detecta actividad caspasa, el biosensor CaspaseTracker además cuenta con la capacidad para etiquetar permanentemente las células esa actividad caspasa expresa incluso transitoriamente. Por lo tanto, el biosensor CaspaseTracker permite seguimiento a largo plazo de anastasis después de reversión de caspase-mediada la célula muerte proceso in vivo.

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Protocol

1) preparación del CaspaseTracker Biosensor vuela

  1. Anestesiar a moscas con CO2y utilizar un pincel para transferir hembras vírgenes de 7 a 10 caspase sensibles Gal4 (DQVD)19 y 7 a 10 G-Trace53 Gal4 reportero joven macho vuela (o viceversa) en la misma cubeta con mosca comida y pasta de levadura fresca.
    Nota: Cruz de moscas Gal4 caspasa-sensible (DQVD) y G-Trace produce moscas de progenie de CaspaseTracker. Cruz de caspasa -ensensible (DQVA)19 Gal4 y moscas G rastro proporcionará control negativo vuela (ver discusión). Levadura fresca pasta sirve como fuente de proteína para mejorar la producción de huevos, por lo aumenta el número de progenie. Seleccionar hembras vírgenes y varón joven vuela según sus fenotipos54.
  2. Incubar las moscas a 18 grados centígrados (oC) en la Cruz por 3 a 7 días y luego se transfieren las moscas a un nuevo vial para configurar una nueva cruz a 18 ° C. Seguir a incubar el frasco original en 18 ° C hasta que la progenie vuela eclose.
    Nota: Transferencia de las moscas de padres nuevos viales para evitar hacinamiento de progenie en el vial original. Padre de moscas pueden producir progenie con alimentos frescos y la pasta de levadura en los primeros 2 a 3 interruptores, y entonces la productividad disminuirá significativamente con el tiempo. Criar moscas 18 ° C puede reducir la señal inespecífica de biosensor CaspaseTracker (ver discusión).
  3. Seleccionar progenie vuela con fenotipos correcta54 para los siguientes experimentos.
    Nota: Los transgenes de Gal4 y G-Trace caspase sensibles aquí se encuentran en el segundo cromosoma, equilibrado con balanceador de CyO. Seleccione la progenie no rizado ala (sin CyO), que tanto los transgenes de caspasa-Gal4 y G-Trace.

2) aplicación de la inducción de muerte celular transitoria a las moscas CaspaseTracker Biosensor

  1. La transferencia de 10 a 20 recién eclosed mujer vuela a un nuevo frasco con mosca alimentos frescos y pasta de levadura fresca por 1 día a 18 ° C para permitir la producción de huevos de la cámara por Oogénesis.
    Nota: Mantener a la hembra con las moscas macho podría mejorar la producción de la cámara de huevos.
  2. Para inducir a huevo las cámaras sufren apoptosis por shock frío, transferencia la hembra vuela a nuevo frasco vacío, que se coloca en-7 ° C por 1 h.
    Nota: shock frío lesiona las células por inducción de plasma membrana ruptura55,56.
  3. Para inducir el huevo las cámaras sufren apoptosis por inanición de proteína, transferencia de las moscas hembra a un nuevo frasco con alimentos del agar de sacarosa y 1% de 8% a 18 ° C durante 3 días.
    Nota: Hambre de proteínas (alimentos sin proteínas) puede activar cámaras de huevo para experimentar apoptosis57,58,59 y autofagia60,61. Interruptor vuela a un nuevo frasco con alimentos de agar de sacarosa y 1% 8% todos los días para mantener condiciones óptimas de la sucrosa alimentos mosca.
  4. Transferir las moscas estresadas a un nuevo frasco con mosca alimentos frescos y pasta de levadura fresca durante 3 días a 18 ° C para que puedan recuperar. Diseccionar la hambrienta y las moscas de hambre-se recuperó para obtener cámaras de huevo en los ovarios como descrito62.
    Nota: Para diseccionar Drosophila para obtener ovarios, anestesiar a moscas con CO2, use 2 pares de pinzas para quitar cabeza de mosca y utilice las pinzas para sacar la base del abdomen para eliminar los ovarios de las moscas.

3) fijación y tinción de huevo disecada salas para la proyección de imagen

  1. Transferencia de las cámaras de huevo disecada junto con alrededor de 0,5 mL fosfato tamponada salino (PBS) a tubos de centrífuga de 1 mL. Permita que los huevos a establecerse.
    Nota: Cubrir las puntas de pipeta de plástico con 1% albúmina de suero bovino (BSA) disuelto en agua o en PBS para evitar que las cámaras de huevo para pegar en la superficie de plástico de las puntas. Realizar los siguientes procedimientos en oscuridad para evitar el fotoblanqueo de proteína fluorescente roja (RFP, también conocido como DsRed) y proteína fluorescente verde (GFP) en la cámara del huevo.
  2. Retirar el PBS mediante pipeteo y luego paraformaldehído al de 4% de 0, 5 mL de PBS para fijar las cámaras de huevo a temperatura ambiente en oscuridad durante 20 a 30 minutos.
    Nota: Aplicar rotación suave en este y los siguientes pasos de incubación.
  3. Retire el paraformaldehido mediante pipeteo y luego se lava la cámara del huevo con 0.5 mL de SAFT (PBS + 0.1% Tritón X-100) para 3 veces.
    Nota: La fijación prolongada podría reducir las señales de RFP y GFP.
  4. Incubar las cámaras huevo con SAFT para 1 a 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C con rotación suave a permeabilizar las cámaras de huevo.
    Nota: Saft también puede evitar cámaras de huevo se adhiera a la superficie de plástico revestida de BSA no.
  5. Quitar el SAFT mediante pipeteo y luego 0,5 mL de 10 μg/mL de colorante Hoechst nuclear azul en SAFT para cámaras de huevo de 1 a 2 h a temperatura ambiente para tinción de núcleo.
    NOTE1: Evitar la incubación prolongada con tinte nuclear como esto aumentará la señal inespecífica.
    Nota 2: Enfoque alternativo para teñir el núcleo sin Hoechst es agregar 200 μL anti blanqueo montaje agente DAPI (ver materiales) e incubar durante la noche63, antes de montar los tejidos en vidrio cubreobjetos, como se describe en el protocolo de 3.8.
    Nota 3: realizar la tinción y los siguientes procedimientos en oscuridad para evitar el fotoblanqueo.
  6. Quitar el tinte nuclear mediante pipeteo y luego aplicar 0.5 mL SAFT para lavar las cámaras de huevo en los tubos de centrífuga de 1 mL por 3 veces, con 10 a 20 min de incubación con rotación suave entre cada paso de lavado.
  7. Quitar todos SAFT con pipeta fina y luego aplicar 200 agente de montaje anti blanqueo μL (ver materiales) al incubar las cámaras de huevo a temperatura ambiente durante 3 horas o durante la noche a 4 ° C hasta que las cámaras de huevo se hunden hasta el fondo del tubo.
    Nota: los tejidos que han absorbido completamente el agente de montaje se hunden hasta el fondo del tubo.
  8. Montaje de las cámaras de huevo manchado transfiriendo con 200 μL anti-blanqueo montaje agente sobre un portaobjeto previamente limpiado para la proyección de imagen mediante pipeteo, cubrir los compartimientos del huevo con un cubreobjetos de vidrio previamente limpiado de 20 x 20 mm y sellado de cubreobjetos en portaobjetos de vidrio, poniendo esmalte de uñas en el borde de la hoja de cubierta.
    NOTE1: Limpieza previa de la diapositiva de cristal y cubreobjetos con el agua o el 70% de etanol.
    Nota 2: Aplicar vaselina entre el portaobjetos de cristal y el cubreobjetos para evitar la destrucción de los compartimientos de huevo al súper.
  9. Imagen de las cámaras de huevo usando fluorescencia o microscopio confocal, usando un 20 x, NA 0.8 objetivo Plan-Apochromat, con excitación luz longitud de onda 405 nm para la tinción nuclear (detectar emisión ~ 461 nm), 561 nm para (señal RFP (actividad caspasa recientes o en curso) detectar emisión ~ 590 nm) y 488 nm para señal GFP (más allá de la actividad de caspasa) (detectar emisión ~ 518nm).
    Nota: Vea nuestros protocolos publicados para la microscopia20,64.

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Representative Results

Microscopía Celular en time-lapse es un método confiable para tracto anastasis en células cultivadas20, es difícil identificar que las células han sufrido anastasis en animales, porque las células recuperadas aparecen morfológicamente indistinguibles a las células sanas normales no han procurado la muerte celular. Por ejemplo, las células de cáncer de cérvix humano HeLa Mostrar características morfológicas de la apoptosis1,2,14, como la contracción celular, condensación nuclear y membrana del plasma blebbing en respuesta a la muerte celular estímulo de 1μm estaurosporina17 (figura 1A, figura 1B i-ii). Después de retirar el estímulo de muerte celular e incubación en medio fresco, las células moribundas revertir el proceso de muerte celular por anastasis17,18, como lo indica recuperación morfológica (figura 1B iii-iv), seguida de proliferación (figura 1B v-vi). Nuestros estudios anteriores también han utilizado biosensores caspasa "tiempo real", como ApoAlert (NES-DEVD-YFP-NLS) para demostrar la inversión de apoptosis después de la activación de caspasa18,20. Este biosensor se localiza en el citosol de las células sanas (figura 1, D 1 ). Sobre la activación de caspasas por la célula muerte estímulo 3,7% de etanol, este biosensor basado en YFP es hendida por caspasas y translocado al núcleo, donde se acumula y la fluorescencia nuclear resultante de su etiqueta YFP identifica células con en curso actividad de caspasa (figura 1 C, 1 D ii-iii). Las células de morir también Mostrar características morfológicas de la apoptosis durante la inducción de etanol1,14,18,20, tales como la fragmentación de las mitocondrias tubulares, nucleares condensación, contracción de la célula y membrana del plasma blebbing (figura 1 ii-iii). Curiosamente, después del retiro del estímulo de muerte celular, las células del mismo pueden recuperar y recuperar la morfología normal (figura 1 iv-viii). En particular, la fluorescencia nuclear de ApoAlert (biosensor hendido) se ha ido dentro de 1 hora en las células recuperadas (figura 1 iv-viii), posiblemente debido a procesos similares que eliminen componentes dañados en anastática células18 , como exfoliados caspasa-3, PARP ICAD generados durante la apoptosis. Por lo tanto, una nueva estrategia es necesaria para el seguimiento de anastasis sobre un marco de tiempo más largo, especialmente en vivo.

Para seguir el destino de las células anastática, hemos desarrollado el sistema mamífero del biosensor de CaspaseTracker, que etiquetas permanentemente las células después de ser troceados por la actividad de caspasa verdugo. Este biosensor se compone de una rtTA caspase sensibles (transactivator de tetraciclina controlado inverso) y un reportero basadas en Cre-LoxP rtTA actividad (figura 2A-B). En las células sanas con ninguna actividad de caspasa, el transactivator rtTA65 está anclado a la membrana plasmática ancla (Lyn11)66,67, señal de exclusión del núcleo (NES) de mapa quinasa quinasa (MAPKK)68, y receptor de estrógeno variante (ERT2)69 por caspasa escindibles enlazadores de70 (DEVD) deriva de PARP (figura 2A, 2B). Como rtTA atada no se translocan desde el citosol al núcleo, puede activar el reportero rtTA. Sin embargo, después de la activación en respuesta a un estímulo de muerte celular, caspasas hienden a los enlazadores DEVD, liberando la rtTA a translocan al núcleo (figura 2B). Una vez en el núcleo, la rtTA se une al elemento de respuesta a tet (TRE) y desencadena la expresión transitoria del recombinase de Cre, que conduce a un evento de recombinación irreversible que elimina el cassette del codón de parada entre el promotor de la CAG y las secuencias de codificación para proteína fluorescente roja (DsRed). Esto resulta en una expresión permanente de DsRed (figura 2B), que sirve como marcador fluorescente permanente de aquellas células que pueden permanecer vivos después de que han experimentado actividad de caspasa, así como de su progenie (figura 2).

Para probar el biosensor CaspaseTracker mamífero, introducido en células HeLa por transfección transitoria, trataron las células con un estímulo de muerte celular (staurosporina 1μm) y controlar recuperación de las células por microscopía confocal en time-lapse de la célula ya que tenemos descrito20. Doxiciclina (concentración final de 1μg/mL), que es esencial para permitir rtTA actividad65,71, se añadió al medio de cultivo celular para encender el biosensor durante todo el experimento. En respuesta al estímulo de muerte celular, las células tratadas muestran características distintivas de la apoptosis, incluyendo la contracción de la célula y la membrana del plasma blebbing como esperado (Figura 2D i-iii). Después de retirar el estímulo de muerte celular, enjuague la célula capa de una vez y agregar medio de cultivo fresco, anastasis se observan las células moribundas, como indicado por su regreso a una morfología normal (Figura 2D iv-vii). De diagnóstico, sólo recuperaron células express el DsRed marcador fluorescente durante y después de anastasis (Figura 2D iv-vii), distinguiéndolos de las células no recuperado (Figura 2D iv-vii) y las células del control no exponerse al estímulo de muerte celular (Figura 2E). Esto demuestra la aplicación y utilidad de lo mamífero CaspaseTracker como una novela nueva herramienta para la identificación y etiquetado permanentemente las células anastática de la activación de caspasas y proporciona una manera de rastrear y estudiar su destino a largo plazo.

Para detectar y rastrear anastasis en animales vivos, animales transgénicos de biosensor CaspaseTracker son necesarios. Por lo tanto, primero utilizamos Drosophila melanogaster como un sistema modelo19, porque como es un importante Organismo genéticamente manejable para el estudio del desarrollo animal y enfermedades humanas72,73,74 ,75. Como modifica el biosensor CaspaseTracker mamífero, Drosophila dual biosensor puede identificar y distinguir "reciente/en curso" de "más allá" de la actividad caspasa. Este biosensor doble se compone de un caspase sensibles Gal419y el reportero de Gal4 G-Trace53 (Figura 3A). En las células sin actividad de caspasa, el factor Gal4 de la transcripción de la levadura es atado a un dominio de anclaje (mCD8) membrana plasmática a través de un enlazador escindibles de caspasa (DQVD) derivado de DIAP1 (figura 3B), teniendo una mutación 21NN/GV22 para evitar la degradación de Gal4 por la regla de N-final con hendidura caspase el vinculador afterAsp2076, y una mutación de D135R para suprimir la función inhibitoria de la caspasa drICE en el dominio de BIR177. Como Gal4 atada no se translocan a núcleo sin escote por caspasas para liberarlo, el reportero de Gal4 G rastro permanece inactivo en las células que no de la actividad de caspasa19. Sobre la activación de caspasas, sin embargo, caspasas activadas desdoblan al vinculador DQVD, liberando Gal4 que translocan en el núcleo para activar el rastro G reportero (Figura 3A)19. Gal4 se une a específicos arriba activar secuencias (UAS) para activar la transcripción transitoria y expresión de la RFP, que luego sirve como un reportero fluorescente de la actividad de caspasa reciente o actual hasta la Gal4 (caspasa) actividad se detiene y luego proteína RFP degradados. Gal4 desencadena también expresión del recombinase FLP del transgén, conduce a un evento de recombinación que quita el cassette del codón de parada entre un promotor ubiquitina (Ubi) y una secuencia de codificación para GFP dirigida por el núcleo (nucGFP). Esto resulta en una expresión permanente de nucGFP, que sirve de marcador permanente de aquellas células que han experimentado actividad caspasa y siguen vivos.

Para probar la Drosophila CaspaseTracker biosensores para la detección de apoptosis y anastasis en vivo, CaspaseTracker vuela de mujer fueron sometidos a estrés fisiológico (figura 3), tales como choque de frío19, que pueden eficientemente muerte de la célula de disparo, incluyendo apoptosis, como se indica por la activación de caspasas, condensación nuclear y celular contracción19,78y también necrosis debido al enfriamiento que causa la pérdida de la integridad de la membrana y salida de citoplásmico contenido55,56. Como era de esperar, CaspaseTracker no se ha activado en el huevo cámaras de moscas control donde no era muerte celular relacionados con el estrés inducido (figura 3D). Por el contrario, las cámaras de huevos de moscas tensionados un día después del choque frío demostraron no sólo contracción de la célula apoptótica característico y condensación nuclear, pero también RFP y GFP expresión, indicando la presencia de los últimos o en curso (RFP +) y últimos (GFP +) caspasa actividad (figura 3E). Sin embargo, a los 3 días después de regresar las moscas estrés a condiciones normales no destacando, GFP, pero sin RFP, expresión fue detectada en las cámaras de huevo recuperado (figura 3F). Esto indica que cámaras de huevo que habían manifestado actividad caspasa después de estrés fueron capaces de superar el proceso de muerte celular y sobrevivir.

Para más prueba de reversibilidad del proceso de muerte celular en huevo cámaras19, CaspaseTracker moscas hembra fueron tensionados por inanición proteína después alimentadas sacarosa al 8% de agar al 1% durante 3 días. Estudios previos demostraron que hambre de proteínas puede desencadenar apoptosis caspase-mediado y autofagia de los tejidos somáticos y las células germinales, incluyendo huevo cámaras57,60,61. Como era de esperar, CaspaseTracker fue activado en cámaras de huevos después de 3 días de hambre de proteínas (figura 3). Las cámaras de huevo muerte exhiben morfologías apoptóticas y expresión de las RFP y GFP biosensor marcadores, indicando recientes o en curso (RFP +) y actividad de caspasa (GFP +) (figura 3). Para demostrar que CaspaseTracker puede rastrear las células recuperadas que experimentaron previamente la activación de caspasas después de un estímulo de muerte, las moscas hambrientos fueron transferidas a la mosca que contienen proteínas normales de los alimentos. Como era de esperar, las cámaras de huevos recuperados de estas moscas nuevamente alimentadas carecen del reportero de caspasa transitoria de RFP, indicando que no hay actividad de caspasa recientes o en curso (figura 3 H). Sin embargo, las cámaras del huevo en las moscas después de aliviar el estrés por volver a la alimentación normal muestra el reportero de caspasa GFP (figura 3 H), lo que indica que las células en estas cámaras de huevo habían invertido el proceso de muerte celular iniciada en un punto después de activación de caspasas. Verificación de que la actividad de biosensor de CaspaseTracker es accionada por la caspasa se obtuvo mediante la sustitución de la secuencia de escote DQVD con la secuencia de DQVA, que caspase es incapaz de unirse y que abolir la actividad de biosensores (figura 3B, 3I ).

Después de la CaspaseTracker Drosophila recuperado de inanición de proteína, encontramos que múltiples tipos de células en la cámara del huevo, como las células somáticas (folículo) y células germinales (células de la enfermera y ovocitos), aparece sólo GFP y RFP no (figura 3J )19, que indica que estas células pueden sufrir anastasis después de la activación de caspasas. Curiosamente, el GFP también etiqueta las células en el germarium (figura 3J)19, que contiene células madre, junto con sus cámaras de huevo asociado en la misma cadena de ovariole. Por lo tanto, estas cámaras de huevo GFP-positivas puedan haber sido derivadas de células que se han recuperado del proceso de muerte celular después de la activación de caspasas. Lo importante, la hembra hambrienta y volver a fed vuela endecha huevos fértiles que pueden producir GFP-expresando progenie moscas19, sugiriendo que potencialmente las células reversible proceso de muerte celular después de la activación de caspasas puede recuperar su función aparentemente normal. Se necesitan estudios futuros para determinar si moscas de progenie que sobreviven como consecuencia de la anastasis presentan secuelas permanentes.

Figure 1
Figura 1 . Recuperación de HeLa células después de la inducción de muerte celular.
(A) diagrama esquemático del enfoque para inducir la muerte celular y posteriormente permitir morir las células para recuperarse después del retiro del inductor de la muerte de la célula.
(B) célula en time-lapse DIC microscopía de células sanas de HeLa (), el mismo grupo de células después de tratar con 1μm de estaurosporina (ii) y luego se lava y más se incubaron con medio de cultivo fresco para remover la estaurosporina ( III-vi). Flecha blanca indica una división celular.
(C) esquema de la proteína de la fusión de biosensor de caspasa NES-DEVD-YFP-NLS y la localización subcelular de YFP durante la inducción de muerte celular y después anastasis.
Microscopia confocal de la célula en time-lapse (D) HeLa células expresando la proteína de la fusión del biosensor de caspasa NES-DEVD-YFP-NLS antes (), durante la exposición a 3.7% etanol (ii - iii) y después de extracción de etanol del medio de cultivo (iv - viii). Aquí se muestran imágenes del biosensor caspasa sólo (fluorescencia verde, fila superior); combina imágenes del núcleo tinción de Hoechst (fluorescencia azul) y mitocondrias (fluorescencia roja) (fila media), e imágenes en la fila del medio más combinan con imágenes DIC (fila inferior). Flechas blancas en fila superior indican nuclear localizada YFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Sistema de biosensor de mamíferos CaspaseTracker.
(A) esquema de lo caspase sensibles rtTA.
(B) esquema del mamífero sistema biosensor CaspaseTracker rtTA.
(C) diagrama de flujo del uso del CaspaseTracker rtTA biosensor para detectar anastasis. Triángulo rojo/amarillo (inductor de muerte celular se aplican) y verde/azul (inductor de lavado apagado) los símbolos son como en la figura 1A.
(D) microscopía confocal de células vivas Time-lapse de un racimo de células HeLa expresando el biosensor de rtTA CaspaseTracker mamífero antes de () y durante la exposición a 1μm estaurosporina (ii - iii) y después de retirar estaurosporina de medio de cultivo (iv - vii). Imágenes combinadas de DIC y DsRed señales. Las flechas indican la celda 1 (amarillo) y 2 (verde) de la célula.
(E) microscopia confocal de células vivas Time-lapse de las células HeLa de biosensor expresando sin tratar. Imágenes combinadas de DIC y DsRed señales. Las flechas blancas indican células divisorias.
Doxiciclina (1ug/mL) estuvo presente en el medio a lo largo de los experimentos que se muestra en los paneles (D) y (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Drosophila Sistema biosensor dual de CaspaseTracker. (Aprobado con el permiso de Tang et al., científica de informes de 2015 9:9015 19 ).
(A) esquema del sistema biosensor Drosophila CaspaseTracker Gal4.
(B) esquema de la caspasa-sensible (DQVD) y el control de caspasa-insensible (DQVA) Gal4.
(C) esquema de ovario del Drosophila y diagrama de flujo para muerte de la célula-inducción en moscas de 1 día de edad, seguido por la recuperación de 3 días en condiciones normales. Imagen de Drosophila proporcionada por Darren Obbard.
Imagen representativa de confocal (D), de cámaras de huevos desde el ovario de una mosca hembra biosensor alimentados con alimento normal volar durante 6 días (sin tratamiento).
(E) imagen confocal representativa de cámaras de huevo desde el ovario de una mosca de frío sorprendido biosensor femenino coloca en-7 ° C por 1 h y luego cambiado a condición normal de la cultura para 1 día (Shock frío, CS).
(F) como el panel E excepto las moscas shock frío fueron cambiados a la condición de la cultura normal durante 3 días (recuperada después de CS).
(G) imagen confocal representativa de huevo cámaras desde el ovario de un biosensor hembra hambrienta operan alimentados con 8% de sacarosa en 1% de agar sin proteínas durante 3 días (subalimentada).
(H) como el panel G excepto las moscas tratadas fueron cambiados a la alimentación normal volar durante 3 días después del tratamiento de hambre de proteínas (re-alimentado).
() Como panel G excepto que muestra el hambre de caspasa enmoscas de mujer biosensor sensible CaspaseTracker (DQVA), que sirvió como control negativo.
(J) imagen confocal representativa de cámaras de huevos de una hembra hambrienta y volver a fed Drosophila. Las flechas indican nuclear GFP expresión en las células de la enfermera (negro), (blanco) de ovocitos y las células del folículo (amarillas) de compartimientos del huevo y en el germarium (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Implicaciones fisiológicas, patológicas y terapéuticas de anastasis. (Aprobado con el permiso de Tang et al., F1000Res 2017, 6:43 21 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El sistema de doble biosensor CaspaseTracker es una novedosa y exclusiva herramienta que permite la detección de los últimos o actividad caspasa continua y seguimiento de las células que se han invertido muerte celular procesan y sobrevivieron después de experimentar actividad caspasa en vivo. Mientras que la actividad de caspasas ha asumido tradicionalmente como una característica distintiva de la apoptosis, cada vez más estudios revelan que no apoptótica caspasa actividad juega un papel potencial en funciones diversas células normales, tales como la regulación de la actividad neuronal79, 80, aprendizaje y memoria81,82,83,84, supresión de necroptotic célula muerte85,86, spermatid individualización87, 88,89, de proliferación celular90y destino celular patrones91procesamiento microARN. Además de apoptosis y anastasis, el sistema de biosensor de CaspaseTracker por lo tanto puede detectar no apoptótica caspasa actividad, que está presente en el cerebro y lóbulos ópticos, cardias, tripa, Malpighi túbulos, tráquea, músculos y otros tejidos de Drosophila19,46,64. Esta señal del biosensor también podría representar la actividad anastática o durante el desarrollo embrionario o la homeostasis normal de estos tejidos. Para estudiar la anastasis después de estrés ambiental induce muerte de la célula transitoria en animales vivos, es fundamental elegir los tejidos con células que no exhiben actividad de caspasa biosensor bajo condiciones fisiológicas normales, pero que puede ser inducida a caspasa activación por la inducción de muerte celular transitoria. Cámaras de huevo son ideales para este propósito, porque no tienen típicamente ninguna actividad de la caspasa de germarium a etapa 10 durante la ovogénesis58,59,92.

Exponer hembra Drosophila a estrés ambiental transitorias, tales como proteína hambre y frío choque, puede eficientemente desencadenar la activación de caspasas y muerte celular en el huevo cámaras19,57,58, 78. Pasos críticos en el protocolo incluyen evitar la inducción de muerte celular prolongada a las moscas. Las condiciones optimizadas de inanición de proteína (8% de sacarosa en agar al 1% durante 3 días) y el choque frío (1 h a-7 oC) a las moscas hembra pueden desencadenar el proceso de muerte celular caspase-activado en cámaras de huevo y permitirles recuperar después las moscas estrés vuelven a condición normal19. El tratamiento prolongado con un estímulo de muerte celular puede desencadenar más cámaras de huevo para someterse al proceso de muerte celular, pero la tasa de recuperación es también reducida, probablemente porque las cámaras de huevo muere experimentan daño masivo más allá de reparación.

Es un paso crítico adicional en este protocolo para reducir la señal de fondo CaspaseTracker en cámaras de huevo por cruzar, criar y mantener que el CaspaseTracker vuela a baja temperatura, como 18 oC. Mientras que la mayoría de las cámaras de huevo de óptimo cría moscas no muestra actividad de caspasa el germarium etapa 10 durante la ovogénesis58, alrededor del 1% de cámaras de huevo podría exhibir actividad de caspasa biosensor sin inducción de muerte celular19 . Esto puede reflejar el índice de desgaste normal debido a los errores innatos o puede ser provocado involuntariamente durante la Oogénesis por condiciones normales de laboratorio. Como Gal4 muestra menos actividad de moscas en baja temperatura93, criar moscas a 18 oC y no a temperatura ambiente, puede reducir la señal endógena que activa el sistema CaspaseTracker. Por otra parte, cambiar moscas a una temperatura más alta, como 29 oC, puede aumentar la sensibilidad del sistema de CaspaseTracker, debido al incremento en la actividad de Gal493y potencialmente otro endógeno dependiente de la temperatura enzimática actividades.

Es importante distinguir las células de CaspaseTracker-positivas que se someten a proceso de muerte celular o anastasis de células que exhiben no apoptótica caspasa actividad. Células apoptóticas expresan RFP (marcador transitorio para la actividad de la caspasa en curso o recientes) y a menudo GFP (fabricante permanente para la actividad de caspasa pasada) en el tratamiento de inducción de apoptosis, como mueren las células tienen actividad caspasa curso eso Gal4 activado hiende, que luego activa el transitorio (Gal4 dependiente de actividad RFP) y permanente (Gal4 activa FLPase-FRT mediada por GFP) Reporteros del sistema G-Trace. Apoptosis de estas células puede confirmarse por morfológica y bioquímica punzones a como condensación nuclear detectada por tinción con colorantes nucleares14,19,58y hendidura caspase detectados por immunostaining19,94. Las células que ya han experimentado el anastasis Mostrar la permanente expresión de GFP por el evento de recombinación mediada por el FLPase del sistema G-Trace. Estas células no expresan RFP como no tienen ninguna actividad caspasa ni otras señas de identidad de apoptosis19. Estas células también presentan morfología nuclear normal. Las células tienen no apoptótica caspasa actividad muestran a menudo expresión de RFP y de GFP, y también tienen una morfología nuclear normal19.

Puede ser difícil distinguir las células que anastasis de aquellas células que habían pasado no apoptótica caspasa actividad, porque ambos Mostrar sólo GFP y ningún sello de la muerte celular. Por lo tanto, experimentos de control de cuidado debe ser incluido19. Por ejemplo, para estudiar la anastasis en cámaras de huevo, es esencial examinar la expresión de GFP en tensiona-recuperada moscas y moscas no tensionado (control negativo). Recuperado moscas deben mostrar células GFP-expresando más que moscas unstressed, si anastasis ha ocurrido después de la activación de caspasas. También es importante distinguir las señales fluorescentes CaspaseTracker de auto-fluorescencia inespecífica, como observado en la cutícula, pigmentos y cuerpos grasos19. Hemos generado control negativo biosensor moscas por mutando el sitio de la hendidura caspase del biosensor (DQVD) a una secuencia no escindibles (DQVA) y en consecuencia por el biosensor de control no responde a la actividad de caspasa19. La señal detectada en el caspase sensible (DQVD) pero no en las moscas de biosensor de control negativo (DQVA) es la señal de interés, provocada por la actividad de caspasa, en lugar de auto fluorescencia.

Nuestro actual Drosophila dual CaspaseTracker biosensor puede identificar las células con actividad de caspasa "reciente" por la expresión de RFP y las células con actividad de caspasa "pasado" por la expresión de GFP19. Tomamos nota de que la RFP no es un indicador de actividad de caspasa "tiempo real", ya que tiene unas horas de tiempo de reacción para Gal4 impulsar la expresión de RFP en respuesta a la actividad de la caspasa. Para agregar una función de "tiempo real", el Drosophila CaspaseTracker biosensor puede ser combinado con el recientemente desarrollado iCasper biosensor52, un "tiempo real" y "oscuro a brillante" en vivo biosensor que sólo muestra su señal far-red cuando es hendida por caspasas.

Además de apoptosis, CaspaseTracker podría también ser activado en tipos alternativos de la muerte celular como las células pueden cambiar vías de muerte celular durante su curso que directa o indirectamente involucra la activación de caspasas, como autofagia después hambre95,96, necrosis de la membrana del plasma inducida por shock frío ruptura19,55,56,78y necroptosis inducidas por staurosporina97, 98. Nuestros estudios actuales y anteriores demostraron que los biosensores de CaspaseTracker pueden etiquetar las células de estas célula muerte inducciones en vitro o en vivo17,18,19 , 20 , 21. como estas inducciones de la muerte de la célula solo pueden activar simultáneamente múltiples vías de muerte celular en las células del mismo, la recuperación de estos mueren células sugiere que anastasis es un fenómeno de recuperación general de la célula que puede revertir la muerte de diferentes células procesos de apoptosis, autofagia, necrosis y necroptosis, individualmente o al mismo tiempo.

El biosensor en vivo CaspaseTracker facilitará la búsqueda de funciones todavía desconocidas, los mecanismos y las implicaciones terapéuticas de la anastasis ()figura 4)21. Para revelar la firma molecular del anastasis, realizamos estudios de microarrays de expresión curso a tiempo entero genoma gen para analizar las células hepáticas primarias de ratón durante la revocación de la apoptosis inducida por el etanol y curiosamente, encontraron cambios llamativos en transcripción de genes implicados en múltiples vías incluyendo pro supervivencia, antioxidación, respuesta de daño de ADN, modificación de histonas, angiogénesis, migración celular y transformación18,21. Este hallazgo es apoyado por nuestro estudio de validación de la recuperación de las células cancerosas humanas de hígado HepG2 de apoptosis18,21y también un estudio reciente de la secuencia de RNA independiente de células HeLa en recuperación de apoptosis99. Curiosamente, para arriba-regulación de algunos factores de pro-supervivencia encuentra en las células anastática se observan también en la reversión de la insuficiencia cardiaca, progresión del tumor y cáncer recurrencia101,de100,102, sugiriendo la potencial participación de anastasis. Para estudiar las potencialidades fisiológicas, patológicas y terapéuticas de la anastasis, es importante identificar las células anastática y rastrear su destino en pequeños animales, como este permitirá estudios mecanísticos y terapéuticos. Nuestro Drosophila y mamíferos CaspaseTracker biosensores serán herramientas útiles para probar las contribuciones potenciales de la anastasis en el desarrollo normal, homeostasis, recuperación de tejido, evolución del tumor, recurrencia del cáncer y metástasis. Hallazgo de estos estudios aumentará nuestra comprensión de la función natural de anastasis y ofrecen un potencial para identificar revolucionario nuevos enfoques terapéuticos para enfermedades intratables por mediar la muerte celular y la supervivencia a través de control anastasis.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Darren Obbard Drosophila imagen en Figura 3 y en manuscrito video; J. Marie Hardwick, Wade Gibson y Heather M. Lamb para la valiosa discusión de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright concede 007-2009 (H.L.T.), beca de la Fundación de investigación de Ciencias de la vida (H.L.T.) y NCI K22 otorga CA204458 (H.L.T.). Ho Tang Lam era un Shurl y Kay Curci Foundation Fellow de la Fundación de investigación de Ciencias de la vida (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

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Medicina número 132 Anastasis apoptosis autofagia biosensor caspasas CaspaseTracker necrosis necroptosis programado muerte celular revocación de la apoptosis
Detección de Anastasis <em>en Vivo</em> por CaspaseTracker Biosensor
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Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

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