Abstract
यहाँ हम एक अगली पीढ़ी आरएनए अनुक्रमण प्रोटोकॉल सक्षम बनाता है कि नए सिरे से विधानसभाओं और नैदानिक और जैविक स्रोतों से एकत्र वायरल जीनोम की इंट्रा-मेजबान संस्करण कॉल रूपरेखा। विधि निष्पक्ष और सार्वभौमिक है; यह सीडीएनए संश्लेषण के लिए यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग करता है और वायरल अनुक्रम सामग्री का कोई पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है। सहित पाली (आरए) वाहक और ribosomal शाही सेना - - वायरल शाही सेना नमूना से पुस्तकालय निर्माण से पहले, चयनात्मक RNase एच-आधारित पाचन अवांछित आरएनए चूस लेना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। चयनात्मक कमी दोनों डेटा की गुणवत्ता और अद्वितीय की संख्या वायरल शाही सेना अनुक्रमण पुस्तकालयों में पढ़ता में सुधार। इसके अलावा, एक Transposase-आधारित 'tagmentation' कदम प्रोटोकॉल में इस्तेमाल के रूप में यह समग्र पुस्तकालय निर्माण के समय को कम कर देता है। प्रोटोकॉल के तेजी से गहरी अनुक्रमण के लिए सक्षम है और 600 से अधिक लासा इबोला वायरस के नमूने सहित दोनों के रक्त और ऊतकों को अलग-और मोटे तौर पर अन्य माइक्रोबियल जीनोमिक्स के अध्ययन के लिए लागू है से संग्रह।
Introduction
नैदानिक स्रोतों से वायरस की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पारेषण और संक्रमण के महामारी विज्ञान, साथ ही मदद समर्थन उपन्यास निदान, टीका और चिकित्सीय विकास को सूचित कर सकते हैं। सीडीएनए यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग संश्लेषण का पता लगाने और अलग-अलग, सह-संक्रमण से जीनोम या यहां तक कि उपन्यास वायरस 1,2 के विधानसभा अनुमति दी गई है। अन्य निष्पक्ष तरीकों के साथ के रूप में, अवांछित दूषित पदार्थों को कई अनुक्रमण पढ़ता है और नकारात्मक अनुक्रमण परिणामों को प्रभावित कब्जा करना था। होस्ट और पाली (आरए) वाहक आरएनए कई मौजूदा वायरल नमूना संग्रह में मौजूद दूषित पदार्थों को कर रहे हैं।
प्रोटोकॉल गहरी अनुक्रमण आरएनए वायरस निष्पक्ष कुल शाही सेना-सेक के आधार पर जीनोम के एक कुशल और लागत प्रभावी तरीके से वर्णन करता है। विधि अवांछित मेजबान ribosomal और वाहक आरएनए को हटाने के लिए एक RNase एच चयनात्मक कमी चरण 3 का इस्तेमाल करता है। चयनात्मक कमी वायरल सामग्री (चित्रा 1) के लिए समृद्ध करती और अनुक्रमण डेटा के समग्र गुणवत्ता में सुधार(चित्रा 2) नैदानिक नमूनों से। इसके अलावा, tagmentation प्रोटोकॉल के रूप में यह काफी पुस्तकालय निर्माण के समय को कम कर देता लिए आवेदन किया है। इन तरीकों में तेजी से इबोला और लासा वायरस जीनोम 2,4,5 के बड़े डेटासेट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और आरएनए वायरस की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्त में, दृष्टिकोण मानव नमूनों तक सीमित नहीं है; चयनात्मक कमी की उपयोगिता लासा संक्रमित मूषक और गैर मानव प्राइमेट रोग मॉडल 5,6 से एकत्र ऊतकों के नमूनों पर प्रदर्शन किया गया।
चित्रा 1. कुल शाही सेना सामग्री लासा वायरस चयनात्मक कमी का उपयोग कर सामग्री के संवर्धन को दर्शाता है। नौ विभिन्न नैदानिक वियोजन से समग्र सामग्री (आरएनए इनपुट) और अद्वितीय लासा वायरस (LASV) के संवर्धन पढ़ता (लाइब्रेरी सामग्री) rRNA कमी पर शुरू। यह आंकड़ा 6 से संशोधित किया गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण के बाद कैरियर आरएनए कमी। पाली की अनुक्रमण चक्र (आरए) प्रति माध्य आधार गुणों लासा वायरस पुस्तकालयों (लाल) और QC रिपोर्ट 13 से नियंत्रण (कोई वाहक पुस्तकालय में मनाया, काला) -contaminated। दोनों 1 पढ़ें और पढ़ें बनती अंत के 2 पुस्तकालय बेम फ़ाइल में विलय कर रहे हैं और गुणवत्ता स्कोर के प्रत्येक आधार पर दिखाए जाते हैं पढ़ता है। यह आंकड़ा 6 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वायरल शाही सेना seq प्रोटोकॉल विवरण निकाली से सीधे पुस्तकालयों का निर्माणआरएनए नैदानिक और जैविक नमूने से एकत्र की। व्यक्तिगत सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए, सभी वायरल सीरम, प्लाज्मा और ऊतकों के नमूनों आरएनए निकासी करने से पहले उचित buffers में निष्क्रिय किया जाना चाहिए। कुछ निष्क्रियता और निकासी किट में, वाहक पाली (आरए) आरएनए भी शामिल है; इस प्रारंभिक RNase एच चयनात्मक कमी चरण के दौरान हटा दिया जाएगा। पूरी तरह ठीक होने के आधार पर, वाहक आरएनए की उम्मीद है और एकाग्रता 100 एनजी / μl है। प्रोटोकॉल में, 110 एनजी / μl oligo डीटी आरएनए (1.1X वाहक एकाग्रता) की कमी के लिए प्रयोग किया जाता है। अगर पाली (आरए) वाहक नमूने में मौजूद नहीं है, तो oligo (डीटी) कमी करने से पहले नहीं जोड़ा जाना चाहिए।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल (250 μl मात्रा तक) पीसीआर थाली प्रारूप में 24 प्रतिक्रियाओं के लिए बनाया गया है। इस प्रोटोकॉल के पुराने संस्करण Matranga, एट अल में बताया गया था। 6।
Protocol
आचार बयान: लासा बुखार रोगियों Tulane विश्वविद्यालय, हार्वर्ड विश्वविद्यालय, ब्रॉड संस्थान, Irrua विशेषज्ञ शिक्षण अस्पताल (ISTH), Kenema सरकारी अस्पताल (KGH), स्वास्थ्य, लागोस की Oyo राज्य मंत्रालय में मानव विषयों समितियों द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग इस अध्ययन के लिए भर्ती किया गया , नाइजीरिया और स्वास्थ्य सिएरा लियोन मंत्रालय। सभी रोगियों की देखभाल के लिए एक समान मानक के साथ इलाज किया गया और दवा Ribavirin, या नहीं, वे अध्ययन में भाग लेने का फैसला किया है की पेशकश कर रहे थे। लासा बुखार (वामो) रोगियों के लिए, Ribavirin के साथ इलाज वर्तमान में सिफारिश की दिशा निर्देशों का पालन किया और आम तौर पर के रूप में जल्द ही वामो दृढ़ता से संदेह था के रूप में की पेशकश की थी।
इबोला वायरस (ईवीडी) के लिए गंभीर फैलने के कारण, रोगियों हमारे मानक प्रोटोकॉल के माध्यम से सहमति नहीं किया जा सकता है। इसके बजाय ईवीडी रोगियों से नैदानिक अतिरिक्त नमूने के उपयोग का मूल्यांकन किया और सियरा लियोन में और हार्वर्ड विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। अधिकारीसिएरा लियोन नैतिकता और वैज्ञानिक समीक्षा समिति, स्वास्थ्य और स्वच्छता के सिएरा लियोन मंत्रालय और मानव विषयों के उपयोग पर हार्वर्ड समिति के सीई अनुक्रम और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध वायरल रोगी और संपर्क नमूनों से प्राप्त दृश्यों बनाने के लिए सहमति की छूट दे दी है सिएरा लियोन में इबोला प्रकोप के दौरान एकत्र की। इन निकायों का भी प्रकोप प्रतिक्रिया के दौरान देखभाल प्राप्त सभी संदिग्ध ईवीडी रोगियों से एकत्र de-पहचान के नमूने के लिए नैदानिक और महामारी विज्ञान के डेटा के उपयोग के लिए दी गई। स्वास्थ्य और स्वच्छता के सिएरा लियोन मंत्रालय ने भी प्रकोप नमूनों की जीनोमिक अध्ययन के लिए ब्रॉड संस्थान और हार्वर्ड विश्वविद्यालय के लिए सिएरा लियोन से गैर-संक्रामक, गैर जैविक नमूने के लदान को मंजूरी दे दी।
नमूना शाही सेना (अप करने के लिए 55 μl निकाले कुल शाही सेना, ~ 4 घंटा) की 1. DNase उपचार
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में बर्फ पर एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में DNase प्रतिक्रिया सेट अप तालिका 1 में वर्णित के रूप में
- भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- सफाई आरएनए ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (SPRI) मनकों का उपयोग।
- गर्म आरएनए मोती 30 मिनट के लिए आरटी के लिए।
- धीरे आरएनए मोती बोतल हिला किसी भी चुंबकीय कणों कि बसे हो सकता है resuspend। DNase इलाज आरएनए (70 μl) के लिए आरएनए मोतियों की 1.8x मात्रा (126 μl) जोड़ें, 10 बार पिपेट द्वारा मिश्रण और अच्छी तरह से (196 μl में कुल मात्रा) आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- चुंबकीय स्टेशन पर मिश्रण रखें। (- 10 मिनट 5) समाधान स्पष्ट करने के लिए प्रतीक्षा करें।
- जबकि पिपेट और त्यागने से स्टेशन पर मंजूरी दे दी समाधान निकालें। जबकि स्टेशन पर, 70% इथेनॉल के साथ गोली कवर द्वारा मोती धोने और 1 मिनट के लिए सेते हैं। पिपेट और त्यागने के साथ इथेनॉल निकालें। दो washes के एक कुल के लिए दोहराएँ।
नोट: ठीक 70% हौसले से तैयार एट का प्रयोगhanol महत्वपूर्ण है, के रूप में एक उच्च प्रतिशत, छोटे आकार के अणुओं का अकुशल धोने में परिणाम होगा जबकि <70% इथेनॉल नमूना 7 का नुकसान हो सकता है। - स्टेशन पर थाली रखें और हवा शुष्क करने के लिए खुला छोड़ दें। नोट: मोती पूरी तरह से सूखे के लिए जब तक मोती दरार करने के लिए शुरू की अनुमति देने के लिए सुनिश्चित करें।
- elute शाही सेना की थाली के लिए nuclease मुक्त पानी के 55 μl जोड़ें। स्टेशन से थाली निकालें अच्छी तरह से pipetting द्वारा माला और पानी के मिश्रण करने के लिए। नोट: वैकल्पिक रूप से, क्रम में कुल शाही सेना को ध्यान केंद्रित करने में (10 μl ≤) कम पानी का उपयोग करें।
- प्लेट स्टेशन पर वापस प्लेस। जब तक समाधान लंबी अवधि के भंडारण के लिए नए पेंच टोपी ट्यूब के लिए पिपेट द्वारा हस्तांतरण करने के लिए साफ करता है रुको (-80 डिग्री सेल्सियस)। नया 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में कमी के लिए जगह 5 μl आरएनए (कदम। 2.4)।
- वैकल्पिक:। सहेजें और rRNA की QRT- पीसीआर के लिए 19 μl पानी (1:20) में 1 μl पतला (जैसे, 18S, 28S rRNA) (तालिका 2) और वायरल मार्कर 5 </ Li>
वायरल शाही सेना नमूना से Ribosomal और कैरियर शाही सेना के 2 चयनात्मक कमी (~ 4 घंटा)
- तालिका 1 में वर्णित के रूप में रेखीय एक्रिलामाइड वाहक के साथ 5x संकरण और 10x RNase एच प्रतिक्रिया buffers, और nuclease मुक्त पानी बनाओ।
- एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में बर्फ पर साथ rRNA कमी ओलिगोस (3 टेबल) और oligo (डीटी) आरएनए के संयोजन तालिका 1 में वर्णित के रूप में द्वारा संकरण प्रतिक्रिया सेट करें।
नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार हो सकता है। एक अनूठा सिंथेटिक आरएनए (ERCCs 8) का 50 femtograms (FG) पर नज़र रखने के लिए दोनों वायरल अनुक्रमण प्रक्रिया और संभावित सूचकांक पढ़ पार संदूषण के लिए जोड़ा जा सकता है।- भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
प्रति सेकंड -0.1 डिग्री सेल्सियस पर 45 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 मिनट, धीमी गति से ramping के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 45 डिग्री सेल्सियस पर thermocycler रोकें।
- भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- बर्फ पर RNase एच प्रतिक्रिया मिश्रण सेट अप के रूप में वर्णनतालिका 1 में घ, तो 2 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम। नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार हो सकता है।
- थाली में संकरण प्रतिक्रिया करने के लिए पूर्व गर्म RNase एच मिश्रण जोड़ें, जबकि 45 डिग्री सेल्सियस पर thermocycler में प्लेट रखते हुए।
- 8 बार - कोमल pipetting 6 से अच्छी तरह मिला लें। एक और 30 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। बर्फ पर रखें।
- तालिका 1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर DNase प्रतिक्रिया मिश्रण सेट अप नोट:। एक मास्टर मिश्रण तैयार किया जा सकता है।
- थाली में RNase एच प्रतिक्रिया को जोड़ें, भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- 5 μl 0.5 एम EDTA जोड़कर DNase प्रतिक्रिया बंद करो। भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- सफाई आरएनए मोती (1.3 चरण देखें) एक 1.8x मात्रा (144 μl) मनकों का उपयोग कर का उपयोग कर। nuclease मुफ्त पानी के 11 μl में Elute। नोट: सुरक्षित कोल्ड स्टोरेज के लिए, स्टोर आर.एन. समाप्त-80 डिग्री सेल्सियस हे / एन ए नमूने हैं।
3. सीडीएनए संश्लेषण (~ 6 घंटा)
- मिक्स rRNA / एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में बर्फ पर यादृच्छिक प्राइमरों के साथ वाहक समाप्त आरएनए तालिका 1 में वर्णित के रूप में, भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- thermocycler में 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस के मिश्रण गर्मी। 5 मिनट - तुरंत गर्मी विकृतीकरण के बाद, 1 के लिए बर्फ पर शाही सेना को जगह है। आरएनए पहली कतरा प्रतिक्रिया करने से पहले की तुलना में अब 5 मिनट के लिए (यहां तक कि बर्फ पर) खड़े करने की अनुमति न दें।
- तालिका 1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर पहली कतरा संश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण सेट करें।
नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार किया जा सकता।- थाली में शाही सेना / यादृच्छिक प्राइमर मिश्रण में जोड़ने, भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस - 22 पर सेते हैं।
- 60 मिनट के लिए एक हवाई इनक्यूबेटर में 55 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए बर्फ पर थाली रखें। नहींई: एक हवा इनक्यूबेटर का उपयोग पहली कतरा प्रतिक्रिया के दौरान जो प्राइमरों पानी रखना और पहली कतरा बढ़ाना शुरू होता है के क्रमिक वार्मिंग बनाने के लिए सिफारिश की है।
- तालिका 1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर दूसरी कतरा संश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण सेट करें।
नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार किया जा सकता।- थाली में पहली कतरा संश्लेषण प्रतिक्रिया में जोड़े, भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। 16 डिग्री सेल्सियस (25 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन रखने के लिए) पर 2 घंटे के लिए सेते हैं। तापमान 16 डिग्री सेल्सियस से ऊपर उठकर अनुमति न दें।
- बर्फ पर थाली प्लेस, तो 0.5 एम EDTA के 5 μl जोड़कर प्रतिक्रिया निष्क्रिय, धीरे और अच्छी तरह मिक्स, तो 1 मिनट के लिए आरटी पर 280 XG पर अपकेंद्रित्र।
- डीएनए मोती (प्रोटोकॉल के लिए कदम 1.3 देखें) मोतियों की 1.8x मात्रा (153 μl) का उपयोग कर के साथ सफाई। क्षालन बफर के 9 μl (ईबी) में elute। मात्रा का ठहराव के लिए 1 μl बचाओ। subseque के लिए सीडीएनए के 1 एनजी का प्रयोग करेंNT कदम। अगर सीडीएनए एकाग्रता का पता लगाने के लिए tagmentation सीडीएनए के 4 μl का उपयोग करने के लिए बहुत कम है (4.1 कदम देखें)।
- सुरक्षित कोल्ड स्टोरेज के लिए, दुकान पर डबल असहाय सीडीएनए 4 डिग्री सीओ / एन -20 डिग्री या लंबी अवधि के भंडारण के लिए सी।
4. पुस्तकालय तैयारी - डीएनए पुस्तकालय निर्माण (~ 4 घंटा)
- एक 96 अच्छी तरह से थाली पर स्थानांतरण सीडीएनए के 4 μl और एक दूसरे प्रयास के लिए शेष सीडीएनए बचाने के लिए अगर जरूरत है।
- तालिका 1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर tagmentation प्रतिक्रिया सेट करें।
नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार किया जा सकता। पृष्ठभूमि और कुल लागत को कम करने के लिए, tagmentation प्रतिक्रिया की कुल मात्रा 20 से 10 μl से कम हो जाता है। सीडीएनए के रूप में सीमित कारक है, प्रतिक्रिया में इस्तेमाल एटीएम (यानी, transposome) की राशि भी एकीकरण साइटों की संख्या कम करने के लिए कम है।- tagmentation मिश्रण 1 मिनट के लिए 280 XG (आरटी पर) पर धीरे और अच्छी तरह से और सेंट्रीफ्यूज की थाली, भंवर में सीडीएनए में जोड़े।5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
- एक बार 10 डिग्री सेल्सियस पर, तुरंत प्रतिक्रिया को समाप्त करने को बेअसर Tagment बफर (एनटी) के 2.5 μl जोड़ें। ऊपर pipetting द्वारा मिक्स और नीचे, तो 1 मिनट के लिए 280 XG (आरटी पर) पर अपकेंद्रित्र।
- 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
- तालिका 1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया सेट करें।
- भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- की स्थिति तालिका 1 में वर्णित का उपयोग कर thermocycler पर पीसीआर प्रदर्शन करना।
नोट: पीसीआर की 12 चक्र tagmented सीडीएनए के 1 एनजी के लिए सुझाव दिया है; हालांकि, वायरल नैदानिक नमूनों अक्सर सीडीएनए की undetectable मात्रा में है। सीडीएनए (<1 एनजी) की कम मात्रा के लिए, अनुक्रमण के लिए पर्याप्त पुस्तकालय बनाने के लिए पीसीआर की 18 चक्र अप करने के लिए इस्तेमाल करते हैं।
- पुस्तकालय तैयारी - सफाई और अनुक्रमण के लिए पूलिंग
- ईबी के साथ 50 μl के लिए नमूना ऊपर लाओ।
- साथ सफाईडीएनए मोती (प्रोटोकॉल के लिए कदम 1.3 देखें) 0.6x मात्रा (30 μl) मनकों का उपयोग। 15 μl ईबी में elute।
- क्षेत्र विश्लेषण (150 1,000 बीपी के लिए) bioanalyzer सॉफ्टवेयर 9, क्षेत्र के विश्लेषण से प्राइमर dimers (~ 120 बीपी) को छोड़कर उपयोग करते हुए आयोजन द्वारा पुस्तकालय (चित्रा 3) की एकाग्रता का निर्धारण। नोट: वैकल्पिक रूप से, qPCR पुस्तकालयों 10 यों इस्तेमाल किया जा सकता है।
- 1 एनएम या अधिक की सबसे कम दाढ़ एकाग्रता में पूल पुस्तकालयों। अगर पुस्तकालय 1 एनएम से नीचे है, इन पुस्तकालयों से अनुक्रम जानकारी पर कब्जा करने के लिए पूल (अन्य पुस्तकालयों की ~ 1x मात्रा) को पुस्तकालय की एक छोटी मात्रा में जोड़ें।
- 0.7x डीएनए मोती के रूप में ऊपर उल्लिखित के साथ सफाई पूल (चरण 2 देखें)। 15 μl ईबी में elute। नोट: मोतियों की मात्रा पूल के अंतिम मात्रा पर निर्भर करेगा।
- पूल 9 विश्लेषण। क्षेत्र विश्लेषण (150 1,000 बीपी के लिए) 9 का आयोजन द्वारा दाढ़ एकाग्रता का निर्धारण। नोट: वैकल्पिक रूप से, qPCR पुस्तकालय पूल 10 <यों इस्तेमाल किया जा सकता है/ Sup>।
- 10 pM पुस्तकालय एकाग्रता में लोड sequencer 101 बीपी उत्पन्न करने के लिए, बनती अंत पढ़ता दोहरी बारकोड के साथ पढ़ता है 11।
3. पुस्तकालय इबोला वायरस नैदानिक नमूनों से निर्मित चित्रा। 4 प्रतिनिधि इबोला वायरस (EBOV) पुस्तकालयों की जेल छवि। पुस्तकालय और प्राइमर dimers के क्षेत्र दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Representative Results
वर्णित प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण की पीढ़ी के हैं, जबकि अद्वितीय वायरल सामग्री के लिए समृद्ध बनाने के लिए कम इनपुट वायरल शाही सेना के नमूने से पढ़ता सक्षम बनाता है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, प्रोटोकॉल अद्वितीय लासा वायरस सामग्री समृद्ध कम से कम (गैर समाप्त नियंत्रण की तुलना में) सभी नमूनों में पांच गुना 18S rRNA (~ 100 पीजी की कुल आरएनए) के कम से कम एक लाख प्रतियों के साथ। इसी तरह, अनुक्रमण सफलता भी किसी नमूने के भीतर वायरस की राशि के साथ सहसंबद्ध। वायरल मात्रा के लिए एक किराए, नमूने कि ~ निहित 1000 या अधिक वायरल जीनोम प्रतियां सबसे अधिक बार पूर्ण विधानसभाओं बनाया के रूप में QRT- पीसीआर का उपयोग करना (डेटा) नहीं दिखाया। इसके अलावा, पाली (आरए) वाहक की कमी एक और टी की homopolymer दृश्यों पुस्तकालयों में, चित्रा (2) कम कर देता है क्लीनर की तैयारी में है, जिसके परिणामस्वरूप और बेहतर गुणवत्ता सुनिश्चित अनुक्रमण पढ़ता है। कम इनपुट वायरल नैदानिक नमूनों से अंतिम पुस्तकालयों अक्सर 150 से 1,000 बीपी के लिए एक व्यापक टुकड़ा लंबाई है(चित्रा 3)।
अनुक्रमण के बाद, एक पूल 12 के भीतर नमूना गलत पहचान और पुस्तकालयों के बीच crosstalk को कम करने के लिए, केवल सूचकांक 25 (Q25) का एक आधार गुणवत्ता स्कोर के साथ पढ़ता है और यह सुनिश्चित शून्य बेमेल demultiplexing प्रक्रिया के दौरान रखा जाता है। वायरल जीनोम एक जैव सूचना विज्ञान पाइप लाइन अलग-अलग वायरस 2,4-6 के लिए विशिष्ट का उपयोग कर इकट्ठा कर रहे हैं। इन उपकरणों https://github.com/broadinstitute/viral-ngs पर या वाणिज्यिक बादल प्लेटफार्मों 4 माध्यम से उपलब्ध हैं।
1.1 कदम: DNase प्रतिक्रिया | |
अभिकर्मक | प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) |
10x DNase बफर | 7 |
Nuclease मुक्त पानी | 6 |
निकाले वायरल शाही सेना | 55 |
DNase (2 यू / & #181; एल) | 2 |
कुल मात्रा | 70 |
5x संकरण बफर: 2.1 कदम | |
अभिकर्मक | 1 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम (μl) |
5 एम NaCl | 200 |
1 एम Tris एचसीएल (पीएच 7.4) | 500 |
Nuclease मुक्त पानी | 300 |
कुल मात्रा | 1,000 |
2.1 कदम: 10x RNase एच प्रतिक्रिया बफर | |
अभिकर्मक | 1 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम (μl) |
5 एम NaCl | 200 |
1 एम Tris एचसीएल (पीएच 7.5) | 500 |
1 एम 2 MgCl | 200 |
Nuclease मुक्त पानी | 500 |
कुल मात्रा | 1,000 |
2.1 चरण: जल with रेखीय एक्रिलामाइड | |
अभिकर्मक | 1 मिलीलीटर बफर के लिए वॉल्यूम (μl) |
Nuclease मुक्त पानी | 992 |
रैखिक एक्रिलामाइड (5 मिलीग्राम / एमएल) | 8 |
कुल मात्रा | 1,000 |
कदम 2.2: चयनात्मक कमी के लिए संकरण प्रतिक्रिया | |
अभिकर्मक | प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) |
5x संकरण बफर | 2 |
rRNA कमी oligo मिश्रण (100 माइक्रोन) के | 1.22 |
Oligo (घ) टी (550 एनजी / μl) | 1 |
DNase इलाज कुल शाही सेना | 5 तक |
कील में शाही सेना (यह वैकल्पिक है) | 0.5 |
जल (रैखिक एक्रिलामाइड के साथ) | कुल 10 तक लाना |
कुल voluमैं | 10 |
2.3 कदम: चयनात्मक कमी के लिए RNase एच प्रतिक्रिया | |
अभिकर्मक | प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) |
10x RNase एच प्रतिक्रिया बफर | 2 |
जल (रैखिक एक्रिलामाइड के साथ) | 5 |
थर्मास्टाइबल RNase एच (5 यू / μl) | 3 |
कुल मात्रा | 10 |
2.4 कदम: DNase प्रतिक्रिया पोस्ट चयनात्मक कमी | |
अभिकर्मक | प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) |
10x DNase बफर | 7.5 |
जल (रैखिक एक्रिलामाइड के साथ) | 44.5 |
RNase अवरोध करनेवाला (20 यू / μl) | 1 |
RNase मुक्त DNase मैं (2.72 यू / μl) | 2 | कुल मात्रा (RNase एच प्रतिक्रिया के साथ) | 75 |
3.1 चरण: सीडीएनए संश्लेषण, यादृच्छिक प्राइमर संकरण | |
अभिकर्मक | प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) |
rRNA / वाहक समाप्त आरएनए | 10 |
3 माइक्रोग्राम यादृच्छिक प्राइमर | 1 |
कुल मात्रा | 1 1 |
3.2 कदम: पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया | |
अभिकर्मक | मात्रा (μl) |
5x पहले किनारा प्रतिक्रिया बफर | 4 |
0.1 एम डीटीटी | 2 |
10 मिमी dNTP मिश्रण | 1 |
RNase अवरोध करनेवाला (20 यू / μl) | 1 |
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (पिछले जोड़) | 1 |
कुल मात्रा (ऊपर शाही सेना के साथ) </ Td> | 20 |
3.3 कदम: दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया | |
अभिकर्मक | मात्रा (μl) |
RNase मुक्त पानी | 43 |
10x दूसरा किनारा प्रतिक्रिया बफर | 8 |
10 मिमी dNTP मिश्रण | 3 |
ई कोलाई डीएनए Ligase (10 यू / μl) | 1 |
ई कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ मैं (10 यू / μl) | 4 |
ई कोलाई RNase एच (2 यू / μl) | 1 |
कुल मात्रा के साथ (1 सेंट कतरा प्रतिक्रिया) | 80 |
4.2 कदम: Tagmentation प्रतिक्रिया | |
अभिकर्मक | मात्रा (μl) |
Amplicon Tagment मिक्स (एटीएम) | 1 |
Tagment डीएनए बफर (टीडी) 5 | |
कुल मात्रा (सीडीएनए के साथ) | 10 |
4.3 चरण: लाइब्रेरी पीसीआर प्रतिक्रिया | |
अभिकर्मक | मात्रा (μl) |
पीसीआर मास्टर मिक्स (एनपीएम) | 7.5 |
सूचकांक 1 प्राइमर (i7) | 2.5 |
सूचकांक 2 प्राइमर (i5) | 2.5 |
कुल मात्रा (tagmented सीडीएनए के साथ) | 25 |
चरण 4.3.2: लाइब्रेरी पीसीआर की स्थिति | |
72 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट | |
95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड | |
18 चक्र-10 95 डिग्री सेल्सियस पर सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 30 सेकंड तक 72 डिग्री सेल्सियस पर | |
72 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट | |
10 डिग्री सेल्सियस, हमेशा के लिए |
तालिका 1:। रिएक्शन सेट-अप और buffers कदम-दर-कदम सभी buffers और प्रतिक्रिया घोला जा सकता है की सामग्री के साथ टेबल।
oligo नाम | अनुक्रम (5 '3' के लिए) | ||
इबोला KGH परिवार कल्याण | GTCGTTCCAACAATCGAGCG | ||
इबोला KGH आर.वी. | CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT | ||
इबोला Kulesh परिवार कल्याण | TCTGACATGGATTACCACAAGATC | ||
इबोला Kulesh आर.वी. | GGATGACTCTTTGCCGAACAATC | ||
लासा SL परिवार कल्याण | जीटीए एजीसी सीसीए GCD GYA AAB सीसी | ||
लासा SL आर.वी. | आग सीसीए कैग एएए RCT GGS एजीसी एक | ||
18S rRNA परिवार कल्याण | TCCTTTAACGAGGATCCATTGG | ||
18S rRNA आर.वी. | CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
96-well PCR Plates | VWR | 47743-953 | |
Strips of Eight Caps | VWR | 47745-512 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | 50 ml bottle |
TURBO DNase | Ambion | AM2238 | post RNA extraction step, 2 U/µl, buffer included |
PCR cycler | any PCR cyclers | ||
Agencourt RNAClean XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63987 | beads for RNA cleanup |
Real Time qPCR system | any system | ||
DynaMag-96 Side Skirted Magnet | Invitrogen | 12027 | |
70% Ethanol | prepare fresh | ||
qRT-PCR primers | IDT DNA | see Table 2 | |
5 M NaCl | Ambion | AM9760G | |
1 M Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T2663-1L | |
1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Linear acrylamide | Ambion | AM9520 | |
DNA oligos covering entire rRNA region | IDT DNA | see Table 3, order lab-ready at 100 µM | |
Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt long, desalted | |
Hybridase Thermostable RNase H | Epicentre | H39100 | |
RNase-free DNase Kit | Qiagen | 79254 | post selective depletion step |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Random Primers | Invitrogen | 48190-011 | mostly hexamers |
10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | with first-strand buffer, DTT |
Air Incubator | any air incubator cyclers | ||
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer | New England Biolabs | B6117S | 10x |
E. coli DNA Ligase | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μl |
E. coli DNA Polymerase I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μl |
E. coli RNase H | New England Biolabs | M0297L | 2 U/μl |
0.5 M EDTA | Ambion | AM9261 | |
Agencourt AMPure XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63881 | beads for DNA cleanup |
Elution Buffer | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8.5 | |
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32857 | |
Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT DNA Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
High Sensitivity D1000 reagents | Agilent | 5067-5585 | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
High Sensitivity DNA reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Library Quantification Complete kit (Universal) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification |
References
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