Abstract
Her skisserer vi en neste-generasjons RNA sekvense protokoll som muliggjør de novo forsamlinger og intra-verts variant samtaler av virale genomer innhentet fra kliniske og biologiske kilder. Metoden er saklig og universell; den bruker tilfeldige primere for cDNA syntese og krever ingen forkunnskaper i viral sekvens innhold. Før bibliotek konstruksjon er selektiv RNase H-baserte fordøyelse anvendes for å utarme uønskede RNA - inklusive poly (rA) bærer og ribosomale RNA - fra det virale RNA-prøven. Selektiv uttømming forbedrer både datakvalitet og antallet unike står i virale RNA-sekvenserings biblioteker. Videre er en transposase-baserte "tagmentation 'trinn anvendt i protokollen som det reduserer den samlede bibliotek byggetid. Protokollen har gjort rask dyp sekvensering av over 600 Lassa og Ebola virus prøver-inkludert samlinger fra både blod og vev isolerer-og er bredt gjeldende for andre mikrobielle genomiske studier.
Introduction
Neste generasjon sekvensering av virus fra kliniske kilder kan informere overføring og epidemiologi av infeksjoner, samt bidra til støtte roman diagnostisk, vaksine og terapeutisk utvikling. cDNA syntese ved hjelp av tilfeldige primere har tillatt påvisning og montering av genomer fra avvikende, co-infiserer eller nye virus 1,2. Som med andre objektive metoder, uønskede forurensninger opptar mange sekvense leser og negativ innvirkning sekvense resultater. Host og poly (rA) bærer-RNA er miljøgifter som finnes i mange eksisterende virusprøve samlinger.
Protokollen beskriver en effektiv og kostnadseffektiv måte dype sekvense RNA virus genomet basert på objektiv total RNA-seq. Fremgangsmåten benytter en RNase H selektiv uttømming trinn 3 for å fjerne uønsket vert ribosomalt og bærer-RNA. Selektiv uttømming beriker for viral innhold (figur 1) og forbedrer den generelle kvaliteten på sekvensering av data(Figur 2) fra kliniske prøver. Videre er tagmentation tilføres til protokollen som det i betydelig grad reduserer bibliotek byggetid. Disse metoder har blitt brukt til å raskt generere store datasett av Ebola og Lassa virusgenomer 2,4,5 og kan brukes til å undersøke et bredt spekter av RNA-virus. Endelig er den tilnærmingen ikke begrenset til humane prøver; nytten av selektive uttømming ble demonstrert på vevsprøver hentet fra Lassa-infiserte gnagere og ikke-menneskelige primater sykdomsmodeller 5,6.
Figur 1. Total RNA innholdet gjenspeiler Anriking av Lassa Virus innhold ved hjelp av Selective Nedbryting. Starter samlede innhold (RNA-inngang) og berikelse av unike Lassa virus (LASV) leser (Library innhold) ved rRNA uttømming fra ni forskjellige kliniske isolater. Dette tallet har blitt forandret fra 6
Figur 2. Høyere kvalitet Sekvense Etter Carrier RNA Nedbryting. Median grunn kvaliteter per sekvense syklus av poly (rA) kontaminerte Lassa virus biblioteker (rød) og kontroll (ingen bærer observert i biblioteket, svart) fra QC rapport 13. Både lese en og lese to av paret slutten leser er slått sammen i biblioteket BAM-filen og kvalitetspoeng vises på hver base. Dette tallet har blitt forandret fra 6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Viral RNA-seq protokoll detaljer bygging av biblioteker direkte fra utvinnesRNA samlet fra kliniske og biologiske prøver. For å sikre personlig sikkerhet, bør alle virus serum, plasma og vevsprøver inaktiveres i passende buffere før RNA ekstraksjon. I noen inaktivering og utvinning kits, er bære poly (rA) RNA inkludert; dette vil bli fjernet under den første RNase H selektiv uttømming trinn. Basert på fullstendig gjenoppretting, forventet konsentrasjon av bære RNA er 100 ng / mL. I protokollen, er 110 ng / ul oligo dT-RNA (1,1x bærerkonsentrasjon) som benyttes for trykkavlastning. Hvis poly (rA) bærer ikke er til stede i prøven, bør da oligo (dT) ikke tilsettes før uttømming.
Følgende protokoll er beregnet for 24 reaksjoner i PCR-plateformat (opp til 250 ul volum). En tidligere versjon av denne protokollen ble rapportert i Matranga, et al. 6.
Protocol
Etikk uttalelse: Lassa feber pasienter ble rekruttert til studien ved hjelp av protokoller godkjent av mennesker komiteer ved Tulane University, Harvard University, Broad Institute, Irrua Specialist Teaching Hospital (ISTH), Kenema Regjeringen Hospital (KGH), Oyo State Helsedepartementet, Ibadan , Nigeria og Sierra Leone Helsedepartementet. Alle pasientene ble behandlet med en lignende standard vare og ble tilbudt narkotika Ribavirin, om ikke de bestemte seg for å delta i studien. For Lassa feber (LF) pasienter, behandling med Ribavirin fulgt tiden anbefalte retningslinjer og ble generelt tilbys så snart LF var sterkt mistenkt.
På grunn av den alvorlige utbrudd for Ebola virus sykdom (EVD), kan pasienter ikke samtykket gjennom våre standardprotokoller. Istedenfor bruk av kliniske overflødige prøver fra EVD pasienter ble evaluert og godkjent av Institutional Review Boards i Sierra Leone og ved Harvard University. den Office fra Sierra Leone Etikk og Scientific Review komiteen, Sierra Leone Helsedepartementet og sanitær, og Harvard komité for bruk av bilder av mennesker har gitt en fraskrivelse av samtykke å sekvensere og gjøre offentlig tilgjengelig virale sekvenser hentet fra pasient og kontaktprøver samlet i løpet av Ebola-utbruddet i Sierra Leone. Disse organene også innvilget bruk av kliniske og epidemiologiske data for avidentifiserte prøver samlet inn fra alle antatte EVD pasienter som får behandling under utbruddet respons. Sierra Leone Helse- og Sanitation godkjent også leveranser av ikke-smittsomme, ikke-biologiske prøver fra Sierra Leone til Broad Institute og Harvard University for genomisk studier av utbrudds prøver.
1. DNase-behandling av Sample RNA (Opp til 55 mL Ekstraherte Total RNA, ~ 4 timer)
- Sett opp DNase reaksjonen i en 96-brønners PCR-plate på is i en biosikkerhet skap som beskrevet i tabell 1
- Vortex forsiktig og grundig, deretter sentrifuger ved 280 xg ved romtemperatur i 1 min.
- Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter.
- Opprydding bruker RNA Solid Phase Reversibel Immobilisering (SPRI) perler.
- Varme RNA perler til RT i 30 minutter.
- Rist RNA perler flasken for å suspendere eventuelle magnetiske partikler som kan ha avgjort. Legge til 1,8 ganger volum (126 ul) av RNA perler på DNase-behandlede RNA (70 ul), bland ved hjelp av pipette 10 ganger og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur (totalvolum i brønnen, 196 ul).
- Sett blandingen på den magnetiske stasjonen. Vent til løsning for å fjerne (5-10 min).
- Fjern ryddet løsning mens du er på stasjonen med pipette og kast. Mens du er på stasjonen, vaske perler ved å dekke pellet med 70% etanol og inkuberes i 1 min. Fjern etanol med pipette og kast. Gjenta for totalt to vasker.
Merk: Bruk av nøyaktig 70% nylaget etMetanol er kritisk, da en høyere prosentandel vil resultere i ineffektiv vasking av mindre størrelse molekyler, mens <70% etanol kunne føre til tap av prøve 7. - Hold plate på stasjonen og la åpne lufttørke. Merk: Sørg for å la perlene tørke helt før perler begynner å sprekke.
- Legg 55 mL av nuklease-fritt vann til platen for å eluere RNA. Fjern platen fra stasjonen for å blande perler og vann ved å pipettere grundig. Merk: Du kan også bruke mindre vann (≤ 10 mL) for å konsentrere det totale RNA.
- Sett platen tilbake på stasjonen. Vent til løsning klarner å overføre med pipette til ny skrukork for langtidslagring (-80 ° C). Plasser 5 mL RNA i ny 96-brønns PCR plate for tømming (trinn. 2.4).
- Valgfritt:. Lagre og fortynne 1 mL i 19 mL vann (1:20) for QRT-PCR av rRNA (f.eks 18S, 28S rRNA) (tabell 2) og viral markører 5 </ Li>
2. Selektiv Nedbryting av Ribosomalt og Carrier RNA fra Viral RNA Sample (~ 4 timer)
- Gjøre 5x hybridisering og 10x RNase H reaksjons buffere, og nuklease-fri vann med lineær akrylamid bærer som beskrevet i Tabell 1.
- Sett opp hybridiseringsreaksjonen ved å kombinere RNA med rRNA uttømming oligoer (tabell 3) og oligo (dT) på is i en 96-brønners PCR-platen som beskrevet i tabell 1.
Merk: En mester mix kan være forberedt. 50 femtograms (FG) av en unik syntetisk RNA (ERCCs 8) kan legges for å spore både viral sekvensering prosessen og potensial index lese krysskontaminering.- Vortex forsiktig og grundig, deretter sentrifuger ved 280 xg ved romtemperatur i 1 min.
Inkuber ved 95 ° C i 2 minutter, sakte jevne overgang til 45 ° C ved -0,1 ° C per sekund. Pause thermocycler ved 45 ° C.
- Vortex forsiktig og grundig, deretter sentrifuger ved 280 xg ved romtemperatur i 1 min.
- Sett opp RNase H reaksjonsblandingen på is som beskriverd i tabell 1, deretter forvarmes ved 45 ° C i 2 min. Merk: En mester mix kan være forberedt.
- Legge til den forvarmede RNase H blanding til hybridiseringsreaksjonen i platen, samtidig som platen i thermocycler ved 45 ° C.
- Bland godt ved forsiktig pipettering 6 - 8 ganger. Inkuber ved 45 ° C i ytterligere 30 min. Plasser på is.
- Sett opp DNase reaksjonsblandingen på is som beskrevet i tabell 1. Merk: En master mix kan være forberedt.
- Legg til RNase H reaksjonen i platen, vortex forsiktig og grundig, deretter sentrifuger ved 280 xg ved romtemperatur i 1 min. Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter.
- Stoppe DNase reaksjonen ved å tilsette 5 ul 0,5 M EDTA. Vortex forsiktig og grundig, deretter sentrifuger ved 280 xg ved romtemperatur i 1 min.
- Opprydding bruker RNA perler (se trinn 1.3) ved hjelp av en 1,8x volum (144 mL) perler. Elueres i 11 mL av nukleasefritt vann. Merk: For sikker kjølelager, butikk utarmet RNEn prøvene ved -80 ° C O / N.
3. cDNA Synthesis (~ 6 timer)
- Mix rRNA / bærer-RNA utarmet med tilfeldige primere på is i en 96-brønners PCR-platen som beskrevet i tabell 1, vortex forsiktig og grundig, deretter sentrifuger ved 280 xg ved romtemperatur i 1 min.
- Varm blandingen til 70 ° C i 10 minutter i en termocykler. Umiddelbart etter varme denaturering, plasserer RNA på is i 1-5 min. Ikke la RNA til å stå (selv på is) i mer enn fem minutter før første-strand reaksjon.
- Sett opp første-strand syntese reaksjonsblandingen på is som beskrevet i tabell 1.
Merk: En master-mix kan være forberedt.- Legg til RNA / tilfeldig primer blanding i en plate, vortex forsiktig og grundig, deretter sentrifuger ved 280 xg ved romtemperatur i 1 min. Inkuber ved 22 til 25 ° C i 10 min.
- Inkuber ved 55 ° C i en luftinkubator i 60 minutter. Sett platen på is for å avslutte reaksjonen. Ikkee: Bruken av en luftinkubator anbefales å skape en gradvis oppvarming av den første-tråd reaksjon under hvilken primerne glødning og den første tråd begynner å forlenge.
- Sette opp andre-trådsyntese reaksjonsblandingen på is som beskrevet i tabell 1.
Merk: En master-mix kan være forberedt.- Legg til den første-tråd syntesereaksjon i platen, vortex forsiktig og grundig, deretter sentrifuger ved 280 xg ved romtemperatur i 1 min. Inkuber i 2 timer ved 16 ° C (holde lokk ved 25 ° C). Ikke la temperaturen til å stige over 16 ° C.
- Sett platen på is, og deretter inaktivere reaksjonen ved tilsetning av 5 ul 0,5 M EDTA, bland forsiktig og grundig, deretter sentrifuger ved 280 xg ved romtemperatur i 1 min.
- Opprydding med DNA-perler (se trinn 1.3 for protokoll) som bruker 1,8x volum (153 mL) av perler. Elueres i 9 mL av elusjonsbuffer (EB). Spar 1 mL for kvantifisering. Bruk 1 ng av cDNA for subsequent trinn. Hvis cDNA konsentrasjonen er for lav til å oppdage, bruke 4 mL av cDNA for tagmentation (se trinn 4.1).
- For sikker kald lagring, lagre dobbelt cDNA ved 4 ° CO / N eller -20 ° C for langtidslagring.
4. Bibliotek Forberedelse - DNA Bibliotek Anlegg (~ 4 timer)
- Overføring 4 pl av cDNA til en 96-brønns plate og lagre de resterende cDNA for et nytt forsøk, om nødvendig.
- Sett opp tagmentation reaksjon på is som beskrevet i tabell 1.
Merk: En master-mix kan være forberedt. For å redusere bakgrunn og totale kostnader, er det totale volumet av den tagmentation reaksjons redusert fra 20 til 10 pl. Når cDNA er den begrensende faktoren, blir mengden av ATM (dvs. transposome) som anvendes ved omsetningen også redusert for å redusere antallet integrasjons områder.- Legg tagmentation blanding til cDNA i platen, vortex forsiktig og grundig og sentrifuger ved 280 xg (ved RT) i 1 min.Inkuber ved 55 ° C i 5 min, hold ved 10 ° C.
- Når på 10 ° C, umiddelbart legge 2,5 mL Nøytraliser Tagment Buffer (NT) for å avslutte reaksjonen. Bland ved å pipettere opp og ned, og sentrifuger ved 280 xg (ved RT) i 1 min.
- Inkuber ved RT i 5 min.
- Sett opp PCR-amplifisering reaksjon på is som beskrevet i tabell 1.
- Vortex forsiktig og grundig, deretter sentrifuger ved 280 xg ved romtemperatur i 1 min.
- Utføre PCR med termosykler ved anvendelse av betingelsene beskrevet i tabell 1.
Merk: 12 sykluser på PCR er foreslått for en ng tagmented cDNA; Men virus kliniske prøver har ofte ikke målbare mengder av cDNA. For lave mengder av cDNA (<1 ng), bruk opp til 18 sykluser av PCR for å skape nok bibliotek for sekvensering.
- Bibliotek forberedelse - opprydding og pooling for sekvense
- Ta prøven opp til 50 ml med EB.
- opprydding medDNA-perler (se trinn 1.3 for protokoll) som bruker 0,6x volum (30 mikroliter) perler. Elueres i 15 mL EB.
- Bestem konsentrasjonen av biblioteket (figur 3) ved å gjennomføre region analyse (150 til 1000 bp) ved anvendelse av Bioanalyzer programvare 9, med unntak av primer-dimerer (~ 120 bp) fra region analyse. Merk: Alternativt kan qPCR brukes til å kvantifisere biblioteker 10.
- Pool bibliotekene til lavest molar konsentrasjon på 1 nM eller høyere. Hvis biblioteket er under 1 nM, legge til et lite volum av biblioteket til bassenget (~ 1x volum av andre bibliotek) for å fange opp sekvensinformasjon fra disse bibliotekene.
- Opprydding basseng med 0,7x DNA-perler som er skissert ovenfor (se trinn 2). Elueres i 15 mL EB. Merk: Volum av kulene vil være avhengig av det endelige volum av bassenget.
- Analyser basseng ni. Bestem molar konsentrasjon ved å gjennomføre region analyse (150 til 1000 bp) 9. Merk: Alternativt kan qPCR brukes til å kvantifisere bibliotek bassenget 10 </ Sup>.
- Load sequencer på 22:00 bibliotek konsentrasjon til å generere 101 bp, leser sammen-end med dual strekkode leser 11.
Figur 3. Biblioteker konstruert fra Ebola-viruset kliniske prøver. Gel bilde av fire representative Ebola-virus (EBOV) biblioteker. Regioner av bibliotek og primer dimerer vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Den beskrevne protokollen muliggjør generering av høy kvalitet sekvense leser fra lav inngangs virale RNA prøver samtidig berikende for unike viral innhold. Som vist i figur 1, protokollen anrikede unikt Lassa virusinnhold på minst fem ganger i alle prøver (sammenlignet med ikke-utarmet kontroller) med minst én million kopier av 18S rRNA (~ 100 pg totalt RNA). Likeledes sekvensering lykkes også korrelert med mengden av viruset i løpet av en gitt prøve. Ved hjelp av QRT-PCR som et surrogat for viral mengde, prøver som inneholdt ~ 1000 eller flere virale genomet kopier som oftest laget fullstendig sammenstillinger (data ikke vist). Videre uttømming av poly (rA) bæreren reduserer homopolymere sekvenser av A og T i biblioteker, noe som resulterer i renere preparater og som sikrer bedre kvalitet sekvense leser (figur 2). Endelige biblioteker fra lav inngangsvirus kliniske prøver ofte har en bred fragment lengde fra 150 til 1000 bp(Figur 3).
Etter sekvensering, for å redusere prøve forveksling og crosstalk mellom bibliotekene i en pool 12, leser bare indeksen med en base kvalitet score på 25 (Q25) og sikre null uoverensstemmelser holdes under demultiplexing prosessen. Viral genomer er satt sammen ved hjelp av en bioinformatikk rørledning bestemt for avvikende virus 2,4-6. Disse verktøyene er tilgjengelig på https://github.com/broadinstitute/viral-ngs eller gjennom kommersielle cloud plattformer 4.
| Trinn 1.1: DNase reaksjon | |||
| reagens | Volum pr reaksjon (pl) | ||
| 10x DNase buffer | 7 | ||
| Nukleasefritt vann | 6 | ||
| Trukket ut viral RNA | 55 | ||
| DNase (2 U / & #181; l) | 2 | ||
| totalt volum | 70 | ||
| Trinn 2.1: 5x Hybridisering buffer | |||
| reagens | Volum til 1 ml (il) | ||
| 5 M NaCl | 200 | ||
| 1 M Tris-HCl (pH 7,4) | 500 | ||
| Nukleasefritt vann | 300 | ||
| totalt volum | 1000 | ||
| Trinn 2.1: 10x RNase H reaksjonsbuffer | |||
| reagens | Volum til 1 ml (il) | ||
| 5 M NaCl | 200 | ||
| 1 M Tris-HCl (pH 7,5) | 500 | ||
| 1 M MgCl2 | 200 | ||
| Nukleasefritt vann | 500 | ||
| totalt volum | 1000 | ||
| Trinn 2.1: Vann wed lineær akrylamid | |||
| reagens | Volum for en ml buffer (pl) | ||
| Nukleasefritt vann | 992 | ||
| Lineær akrylamid (5 mg / ml) | 8 | ||
| totalt volum | 1000 | ||
| Trinn 2.2: Hybridisering reaksjon for selektiv utarming | |||
| reagens | Volum pr reaksjon (pl) | ||
| 5x Hybridisering Buffer | 2 | ||
| rRNA-uttømming oligo mix (100 mm) | 1,22 | ||
| Oligo (d) T (550 ng / mL) | 1 | ||
| DNase-behandlet total RNA | opp til fem | ||
| Spike-in RNA (Dette er valgfritt) | 0.5 | ||
| Vann (med lineær akrylamid) | få opp til 10 totalt | ||
| Total volumeg | 10 | ||
| Trinn 2.3: RNase H reaksjon for selektiv utarming | |||
| reagens | Volum pr reaksjon (pl) | ||
| 10x RNase H Reaction Buffer | 2 | ||
| Vann (med lineær akrylamid) | 5 | ||
| Termostabile RNase H (5 U / mL) | 3 | ||
| totalt volum | 10 | ||
| Trinn 2.4: DNase reaksjon post selektive uttømming | |||
| reagens | Volum pr reaksjon (pl) | ||
| 10x DNase Buffer | 7.5 | ||
| Vann (med lineær akrylamid) | 44.5 | ||
| RNase inhibitor (20 U / mL) | 1 | ||
| RNase-fri DNase I (2,72 U / mL) | 2 | Totalt volum (med RNase H reaksjon) | 75 |
| Trinn 3.1: cDNA syntese, tilfeldig primer hybridisering | |||
| reagens | Volum pr reaksjon (pl) | ||
| rRNA / carrier-utarmet RNA | 10 | ||
| 3 mikrogram tilfeldig primer | 1 | ||
| totalt volum | 11 | ||
| Trinn 3.2: Første tråd cDNA syntese reaksjon | |||
| reagens | Volum (mL) | ||
| 5x First-Strand reaksjonsbuffer | 4 | ||
| 0,1 M DTT | 2 | ||
| 10 mM dNTP mix | 1 | ||
| RNase inhibitor (20 U / mL) | 1 | ||
| Revers transkriptase (legg siste) | 1 | ||
| Totalt volum (med RNA ovenfor) </ Td> | 20 | ||
| Trinn 3.3: Second cDNA syntese reaksjon | |||
| reagens | Volum (mL) | ||
| RNase-fritt vann | 43 | ||
| 10x Andre Strand reaksjonsbuffer | 8 | ||
| 10 mM dNTP mix | 3 | ||
| E. coli DNA Ligase (10 U / mL) | 1 | ||
| E. coli DNA-polymerase I (10 U / mL) | 4 | ||
| E. coli RNase H (2 U / mL) | 1 | ||
| Totalt volum (med 1 m tråd reaksjon) | 80 | ||
| Trinn 4.2: Tagmentation reaksjon | |||
| reagens | Volum (mL) | ||
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | 1 | ||
| Tagment DNA Buffer (TD) 5 | |||
| Totalt volum (med cDNA) | 10 | ||
| Trinn 4.3: Library PCR-reaksjon | |||
| reagens | Volum (mL) | ||
| PCR Master Mix (NPM) | 7.5 | ||
| Indeks 1 primer (i7) | 2,5 | ||
| Indeks 2 primer (i5) | 2,5 | ||
| Totalt volum (med tagmented cDNA) | 25 | ||
| Trinn 4.3.2: Bibliotek PCR-forhold | |||
| 72 ° C, 3 min | |||
| 95 ° C, 30 sek | |||
| opp til 18 sykluser-10 sek ved 95 ° C, 30 sek ved 55 ° C, 30 sek ved 72 ° C | |||
| 72 ° C, 5 min | |||
| 10 ° C, for alltid | |||
Tabell 1:. Reaksjon oppsett og buffere Step-by-step tabeller med innholdet i alle buffere og reaksjonsblandinger.
| oligo Name | Sekvens (5 'til 3') | ||
| Ebola KGH FW | GTCGTTCCAACAATCGAGCG | ||
| Ebola KGH RV | CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT | ||
| Ebola KULESH FW | TCTGACATGGATTACCACAAGATC | ||
| Ebola KULESH RV | GGATGACTCTTTGCCGAACAATC | ||
| Lassa SL FW | GTA AGC CCA GCD Gya AAB CC | ||
| Lassa SL RV | AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A | ||
| 18S rRNA FW | TCCTTTAACGAGGATCCATTGG | ||
| 18S rRNA RV | CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plates | VWR | 47743-953 | |
| Strips of Eight Caps | VWR | 47745-512 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | 50 ml bottle |
| TURBO DNase | Ambion | AM2238 | post RNA extraction step, 2 U/µl, buffer included |
| PCR cycler | any PCR cyclers | ||
| Agencourt RNAClean XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63987 | beads for RNA cleanup |
| Real Time qPCR system | any system | ||
| DynaMag-96 Side Skirted Magnet | Invitrogen | 12027 | |
| 70% Ethanol | prepare fresh | ||
| qRT-PCR primers | IDT DNA | see Table 2 | |
| 5 M NaCl | Ambion | AM9760G | |
| 1 M Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T2663-1L | |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
| Linear acrylamide | Ambion | AM9520 | |
| DNA oligos covering entire rRNA region | IDT DNA | see Table 3, order lab-ready at 100 µM | |
| Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt long, desalted | |
| Hybridase Thermostable RNase H | Epicentre | H39100 | |
| RNase-free DNase Kit | Qiagen | 79254 | post selective depletion step |
| SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
| Random Primers | Invitrogen | 48190-011 | mostly hexamers |
| 10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | with first-strand buffer, DTT |
| Air Incubator | any air incubator cyclers | ||
| NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer | New England Biolabs | B6117S | 10x |
| E. coli DNA Ligase | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μl |
| E. coli DNA Polymerase I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μl |
| E. coli RNase H | New England Biolabs | M0297L | 2 U/μl |
| 0.5 M EDTA | Ambion | AM9261 | |
| Agencourt AMPure XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63881 | beads for DNA cleanup |
| Elution Buffer | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8.5 | |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32857 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
| Nextera XT DNA Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
| High Sensitivity DNA reagents | Agilent | 5067-4626 | |
| Library Quantification Complete kit (Universal) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification |
References
- Stremlau, M. H., et al. Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa. PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631 (2015).
- Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345, 1369-1372 (2014).
- Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue. PLoS One. 7, e42882 (2012).
- Park, D. J., et al. Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone. Cell. 161, 1516-1526 (2015).
- Andersen, K. G., et al. Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus. Cell. 162, 738-750 (2015).
- Matranga, C. B., et al. Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples. Genome Biol. 15, 519 (2014).
- Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
- Jiang, L., et al. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).
- Agilennt Technologies. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf. (2015).
- Kapa Biosystems. , Available from: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2015).
- Illumina Technologies. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf. (2015).
- Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Res. 40, 3 (2012).
- Andrews, S. Babraham Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Hu, Y., et al. Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing. Clin Microbiol Infect. 21, e1-4 713 (2015).
- Simon-Loriere, E., et al. Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic. Nature. 524, 102-104 (2015).
- Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. Empowering African genomics for infectious disease control. Genome Biol. 15, 515 (2014).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39, 19 (2011).
- Malboeuf, C. M., et al. Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification. Nucleic Acids Res. 41, 13 (2013).
- Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny. Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nat Methods. 10, 623-629 (2013).
Tags
Medisin RNA-virus Ebola-viruset Lassa virus intra-vert varianter Lassa feber poly (rA) carrier rRNA RNase H RT-PCR View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
