Abstract
Här redogör vi en nästa generations RNA sekvense protokoll som möjliggör de novo aggregat och inom värd variant samtal av virala genom som samlats in från kliniska och biologiska källor. Metoden är opartisk och universell; den använder slumpmässiga primrar för cDNA-syntes och kräver ingen tidigare kunskap om virala sekvensen innehåll. Innan bibliotekskonstruktion, är selektiv RNas H-baserad uppslutning som används för att tömma oönskade RNA - inklusive poly (rA) bärare och ribosomalt RNA - från den virala RNA-prov. Selektiv utarmning förbättrar både uppgifternas kvalitet och antalet unika läser i virala RNA sekvense bibliotek. Dessutom är en transposas-baserad "tagmentation" steg som används i protokollet eftersom det minskar den totala biblioteks byggtiden. Protokollet har möjliggjort en snabb djup sekvensering av över 600 Lassa och Ebolavirus prov-inklusive samlingar från både blod och vävnad isolat-och är brett tillämpbar för andra mikrobiella genomik studier.
Introduction
Nästa generations sekvensering av virus från kliniska källor kan informera överföring och epidemiologin av infektioner, liksom bidra till att stödja ny diagnostik, vaccin och terapeutiska utveckling. cDNA syntes med användning slump primers har gjort det möjligt att upptäcka och montering av genomen från divergerande, co-infekterande eller ens nya virus 1,2. I likhet med andra objektiva metoder, oönskade föroreningar upptar många sekvense läser och slagsekvense resultat negativt. Värd och poly (rA) bärar-RNA är föroreningar som förekommer i många befintliga virala provsamlingar.
Protokollet beskriver ett effektivt och kostnadseffektivt sätt djupa sekvense RNA virusgenom baserade på objektiva total RNA-punkter. Metoden utnyttjar en RNas H selektiv utarmning steg 3 för att ta bort oönskade värd ribosomala och bärar-RNA. Selektiv utarmning berikar för viral innehåll (Figur 1) och förbättrar den övergripande kvaliteten på sekvenseringsdata(Figur 2) från kliniska prover. Dessutom är tagmentation tillämpas protokollet som avsevärt minskar bibliotek byggtiden. Dessa metoder har använts för att snabbt generera stora datamängder av Ebola och Lassa virusgenom 2,4,5 och kan användas för att studera ett brett spektrum av RNA-virus. Slutligen är metoden inte begränsad till humana prover; nyttan av selektiv utarmning visades på vävnadsprover som samlats in från Lassa-infekterade gnagare och icke-mänskliga primater sjukdomsmodeller 5,6.
Figur 1. Total RNA innehåll återspeglar Anrikning av Lassa Virus Innehåll Använda Selektiv Depletion. Från övergripande innehåll (RNA ingång) och anrikning av unik Lassa-virus (LASV) läser (bibliotek innehåll) på rRNA utarmning från nio olika kliniska isolat. Denna siffra har ändrats från 6
Figur 2. Högre kvalitet Sequencing Efter Carrier RNA Depletion. Median bas kvaliteter per sekvense cykel av poly (rA) kontaminerad bibliotek Lassa-virus (röd) och kontroll (ingen bärare observerats i bibliotek, svart) från QC rapport 13. Både läsa en och läsa två av parade slut läser slås samman i biblioteket BAM fil och kvalitetsresultat visas vid varje bas. Denna siffra har ändrats från 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den virala RNA-punkter protokoll detaljer konstruktion av bibliotek direkt från extraheradeRNA samlas in från kliniska och biologiska prover. För att garantera personlig säkerhet, bör alla virala serum, plasma och vävnadsprover inaktiveras i lämpliga buffertar före RNA-extraktion. I vissa inaktive och utvinning kit, är bärare poly (rA) RNA ingår; detta kommer att tas bort under den inledande RNas H selektiv utarmning steg. Baserat på fullständig återhämtning, är den förväntade koncentrationen av bärare RNA 100 ng / l. I protokollet, är 110 ng / l oligo dT-RNA (1.1x bärarkoncentration) används för utarmning. Om poly (rA) bärare inte förekommer i provet, bör då oligo (dT) inte tillsättas före utarmning.
Följande protokoll är avsedd för 24 reaktioner i PCR-plattformat (upp till 250 | il volym). En tidigare version av detta protokoll rapporterades i Matranga, et al. 6.
Protocol
Etik uttalande: Lassafeber patienter rekryterades för denna studie med protokoll som godkänts av mänskliga ämnen utskott vid Tulane University, Harvard University, Broad Institute, Irrua Specialist Teaching Hospital (ISTH), Kenema Government Hospital (KGH), Oyo staten hälsovårdsministeriet, Ibadan , Nigeria och Sierra Leone hälsoministeriet. Alla patienter behandlades med en liknande standard av vård och erbjöds läkemedlet ribavirin, oavsett om de har beslutat att delta i studien. För Lassafeber (LF) patienter behandling med ribavirin följt närvarande rekommenderade riktlinjer och allmänhet erbjuds så snart LF var starkt misstänkt.
På grund av den svåra utbrott för Ebolafeber (EVD), kan patienter inte samtyckt genom våra standardprotokoll. Istället användning av kliniska överskott prover från EVD patienter utvärderades och godkändes av Institutional Review Boards i Sierra Leone och vid Harvard University. den Office av Sierra Leone etik och vetenskapliga kommittén, Sierra Leone hälsoministeriet och sanitet, och Harvard kommittén om användningen av mänskliga ämnen har beviljat ett undantag om samtycke att sekvensera och göra offentligt tillgängliga virussekvenser som erhållits från patienter och kontaktprover samlats in under utbrottet Ebola i Sierra Leone. Dessa organ beviljas också användning av kliniska och epidemiologiska data för de identifierade prover som samlats in från alla misstänkta EVD patienter som får vård under utbrottet svar. Sierra Leone ministeriet för hälsa och Sanitation godkände även transporter av icke-smittsamma, icke-biologiska prover från Sierra Leone till Broad Institute och Harvard University för iska studier av utbrott prover.
1. DNas-behandling av prov-RNA (upp till 55 l Extraherade Total RNA, ~ 4 tim)
- Ställa in DNas reaktionen i en 96-brunnars PCR-platta på is i en biosäkerhet skåp som beskrivs i Tabell 1
- Vortex försiktigt och grundligt, centrifugera sedan vid 280 xg vid RT under 1 min.
- Inkubera vid 37 ° C under 30 min.
- Rensning genom att använda RNA-fastfas Reversibel immobilisering (SPRI) pärlor.
- Varma RNA pärlor till RT i 30 min.
- Skaka försiktigt RNA pärlor flaska för att återsuspendera de magnetiska partiklar som kan ha etablerat sig. Lägg 1,8 x volym (126 | j, l) av RNA-pärlor till DNas-behandlade RNA (70 | j, l), blanda med pipett 10 gånger och inkubera under 5 min vid RT (total volym i brunn, 196 | il).
- Placera blandningen på magnetstationen. Vänta på lösningen för att ta bort (5-10 min).
- Ta bort lösning medan på stationen med pipett och kasta. Medan på stationen, tvätta pärlor genom att täcka pelleten med 70% etanol och inkubera i 1 min. Avlägsna etanol med pipett och kasta. Upprepa för totalt två tvättar.
Obs: Använda exakt 70% nygjord ethanol är kritisk, eftersom en större andel kommer att resultera i en ineffektiv tvättning av mindre storlek molekyler, medan <70% etanol kan orsaka förlust av prov 7. - Håll plattan på stationen och lämna öppen för lufttorka. Obs: Var noga med att låta kulorna torka helt tills pärlor börjar spricka.
- Lägg 55 pl nukleasfritt vatten till plattan för att eluera RNA. Ta plattan från stationen för att blanda pärlorna och vatten genom att pipettera noggrant. Obs: Du kan också använda mindre vatten (≤ 10 l) för att koncentrera den totala RNA.
- Placera plattan tillbaka på stationen. Vänta tills lösningen klarnar att överföra med pipett till nya skruvkork rör för långtidslagring (-80 ° C). Placera 5 il RNA i nya 96-väl PCR-platta för utarmning (steg. 2.4).
- Valfritt:. Spara och späd 1 pl i 19 pl vatten (1:20) för QRT-PCR av rRNA (t.ex. 18S, 28S rRNA) (tabell 2) och virusmarkörer 5 </ Li>
2. Selektiv Utarmning av Ribosomal och Carrier RNA från viralt RNA Prov (~ 4 h)
- Göra 5x hybridisering och 10x RNas H reaktionsbuffertar, och nukleasfritt vatten med linjär bärare akrylamid som beskrivs i tabell 1.
- Inrättat hybridiseringsreaktion genom att kombinera RNA med rRNA utarmnings oligos (tabell 3) och oligo (dT) på is i en 96-brunnars PCR-platta som beskrivs i tabell 1.
Obs: En Master Mix kan vara förberedd. 50 femtogram (fg) av en unik syntetisk RNA (ERCCs 8) kan tillsättas för att spåra både den virala sekvenseringsprocessen och potentiella index läsa korskontaminering.- Vortex försiktigt och grundligt, centrifugera sedan vid 280 xg vid RT under 1 min.
Inkubera vid 95 ° C under 2 min, långsam rampning till 45 ° C vid -0,1 ° C per sekund. Pausa termo vid 45 ° C.
- Vortex försiktigt och grundligt, centrifugera sedan vid 280 xg vid RT under 1 min.
- Inrätta RNas H reaktionsblandningen på is som beskriverd i tabell 1, därefter förvärma vid 45 ° C under 2 min. Obs: En Master Mix kan vara förberedd.
- Lägga den förvärmda RNas H mixen till hybridiseringsreaktionen i plattan samtidigt hålla plattan i termocykler vid 45 ° C.
- Blanda väl genom försiktig pipettering 6 - 8 gånger. Inkubera vid 45 ° C under ytterligare 30 min. Placera på is.
- Ställ in DNas reaktionsblandningen på is som beskrivs i Tabell 1 Anm: a. Master Mix kan framställas.
- Lägga till i RNas H reaktionen i plattan, vortex försiktigt och grundligt, centrifugera sedan vid 280 xg vid RT under 1 min. Inkubera vid 37 ° C under 30 min.
- Stoppa DNas reaktionen genom tillsats av 5 | il 0,5 M EDTA. Vortex försiktigt och grundligt, centrifugera sedan vid 280 xg vid RT under 1 min.
- Sanering med hjälp av RNA-pärlor (se steg 1,3) med hjälp av en 1,8 x volym (144 pl) pärlor. Eluera i 11 pl nukleasfritt vatten. Obs: För säker kylförvaring, lagra utarmat RNA proverna vid -80 ° C O / N.
3. cDNA Synthesis (~ 6 tim)
- Mix rRNA / carrier-utarmat RNA med slumpmässiga primers på is i en 96-håls PCR-platta som beskrivs i tabell 1, virvel försiktigt och noggrant, centrifugera sedan vid 280 xg vid rumstemperatur under en minut.
- Värm blandningen till 70 ° C under 10 min i en termocykler. Omedelbart efter värmedenaturering, placera RNA på is i 1-5 minuter. Tillåter inte RNA stå (även på is) under längre tid än 5 min före den första strängen reaktion.
- Inrätta första sträng-syntes-reaktionsblandningen på is, såsom beskrivs i Tabell 1.
Obs: En master-mix kan vara förberedd.- Lägg till RNA / random primer mix i plattan, virvel försiktigt och noggrant, centrifugera sedan vid 280 xg vid rumstemperatur under en minut. Inkubera vid 22-25 ° C under 10 min.
- Inkubera vid 55 ° C i en luftinkubator under 60 minuter. Placera plattan på is för att avsluta reaktionen. Intee: Användningen av en luftinkubator rekommenderas att skapa gradvisa uppvärmningen av den första strängen reaktion under vilken primers glödgning och den första strängen börjar att förlänga.
- Inrätta andrasträng-syntes-reaktionsblandningen på is, såsom beskrivs i Tabell 1.
Obs: En master-mix kan vara förberedd.- Lägga till den första-strängsyntes-reaktion i plattan, vortexa varsamt och grundligt, centrifugera sedan vid 280 xg vid RT under 1 min. Inkubera i 2 h vid 16 ° C (hålla locket vid 25 ° C). Låt inte temperaturen att stiga över 16 ° C.
- Placera plattan på is, därefter inaktivera reaktionen genom tillsats av 5 pl av 0,5 M EDTA, blanda försiktigt och grundligt, centrifugera sedan vid 280 xg vid RT under 1 min.
- Sanering med DNA-pärlor (se steg 1,3 för protokoll) med hjälp av 1,8 x volym (153 pl) av pärlor. Eluera i 9 pl elueringsbuffert (EB). Spara 1 pl för kvantifiering. Använd en ng cDNA för subsequent steg. Om cDNA koncentrationen är för låg för att upptäcka, använda 4 pl cDNA för tagmentation (se steg 4,1).
- För säker kylförvaring, lagra dubbelsträngad cDNA vid 4 ° CO / N eller -20 ° C för långtidsförvaring.
4. Bibliotek Förberedelser - DNA Library Construction (~ 4 tim)
- Överföring 4 pl av cDNA till en 96-brunnars platta och spara den återstående cDNA för ett andra försök om det behövs.
- Ställa in tagmentation reaktionen på is, såsom beskrivs i Tabell 1.
Obs: En master-mix kan vara förberedd. För att minska bakgrund och totalkostnad, är den totala volymen av den tagmentation reaktionen minskas från 20 till 10 | j, l. Som cDNA är den begränsande faktorn, är mängden av ATM (dvs transposome) som används i reaktionen reduceras även för att minska antalet integrationsställen.- Lägg tagmentation mix till cDNA i plattan, vortex försiktigt och grundligt och centrifugera vid 280 xg (vid RT) under 1 min.Inkubera vid 55 ° C under 5 min, paus vid 10 ° C.
- En gång vid 10 ° C, omedelbart lägga 2,5 pl Neutralisera Tagment Buffer (NT) för att avsluta reaktionen. Blanda genom att pipettera upp och ner, centrifugera sedan vid 280 xg (vid RT) under 1 min.
- Inkubera vid RT i 5 min.
- Inrättat PCR-amplifieringsreaktion på is som beskrivs i tabell 1.
- Vortex försiktigt och grundligt, centrifugera sedan vid 280 xg vid RT under 1 min.
- Utför PCR på termo användning av de betingelser som beskrivs i tabell 1.
Notera: 12 cykler av PCR föreslås för ett ng av tagmented cDNA; emellertid virala kliniska prover har ofta ej detekterbara mängder av cDNA. För låga mängder av cDNA (<1 ng), använda upp till 18 cykler av PCR för att skapa tillräckligt bibliotek för sekvensering.
- Bibliotek förberedelse - sanering och sammanslagning för sekvensering
- Ta prov upp till 50 pl med EB.
- sanering medDNA-pärlor (se steg 1,3 för protokoll) med hjälp av 0,6x volym (30 ul) pärlor. Eluera i 15 | il EB.
- Avgör koncentrationen i biblioteket (Figur 3) genom att utföra region analys (150 till 1000 bp) med hjälp av Bioanalyzer programvara 9, med undantag av primerdimerer (~ 120 bp) från regionen analys. Obs: Alternativt kan qPCR användas för att kvantifiera bibliotek 10.
- Pool bibliotek vid det lägsta molära koncentration av 1 nM eller större. Om biblioteket är under 1 nM, tillsätt en liten volym av bibliotek till pool (~ 1x volym andra bibliotek) för att fånga sekvensinformation från dessa bibliotek.
- Sanering pool med 0,7x DNA pärlor enligt ovan (se steg 2). Eluera i 15 | il EB. Obs: Volymen av pärlor kommer att bero på den slutliga volymen av poolen.
- Analysera pool 9. Bestäm molar koncentration genom att utföra region analys (150 till 1000 bp) 9. Obs: Alternativt kan qPCR användas för att kvantifiera bibliotek pool 10 </ Sup>.
- Last sequencer på 10:00 bibliotek koncentration för att generera 101 bp, läser parade slut med dubbla streckkod läser 11.
Figur 3. bibliotek konstruerade från ebolaviruset kliniska prover. Gel bild av fyra företrädare Ebolavirus (EBOV) bibliotek. Regioner biblioteks och primerdimerer visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Den beskrivna protokollet möjliggör generering av hög kvalitet sekvensering läser från snåla virala RNA-prover samtidigt berikande för unika viral innehåll. Som visas i figur 1, protokollet berikade unikt Lassa-virus innehåll åtminstone fem gånger i alla prover (jämfört med icke-utarmade kontroller) med minst en miljon kopior av 18S rRNA (~ 100 pg totalt RNA). Likaså sekvense framgång korrelerade också med mängden av viruset inom ett givet prov. Med användning av QRT-PCR som ett surrogat för viralt kvantitet, prover som innehöll ~ 1000 eller flera virala genomkopior oftast skapade fulla patroner (data ej visade). Dessutom utarmning av poly (rA) bärare minskar homo sekvenser av A och T i bibliotek, vilket resulterar i renare preparat och säkerställa bättre kvalitet sekvensering läser (Figur 2). Slut bibliotek från låg ingångsvirus kliniska prover har ofta en bred fragment längd från 150 till 1000 bp(Figur 3).
Efter sekvensering, för att minska prov felidentifiering och överhörning mellan biblioteken inom en pool 12, läser endast index med en bas kvalitetsresultat på 25 (Q25) och se till noll felpassningar hålls under demultiplexering processen. Virala genom monteras med hjälp av en bioinformatik pipeline är specifik för olika virus 2,4,6. Dessa verktyg finns tillgängliga på https://github.com/broadinstitute/viral-ngs eller genom kommersiella molnplattformar 4.
| Steg 1.1: DNase reaktion | |||
| Reagens | Volym per reaktion (l) | ||
| 10x DNas-buffert | 7 | ||
| Nukleasfritt vatten | 6 | ||
| Extraherad viralt RNA | 55 | ||
| DNas (2 U / & #181; l) | 2 | ||
| Total volym | 70 | ||
| Steg 2.1: 5x hybridiseringsbuffert | |||
| Reagens | Volymen för 1 ml (l) | ||
| 5 M NaCl | 200 | ||
| 1 M Tris-HCl (pH 7,4) | 500 | ||
| Nukleasfritt vatten | 300 | ||
| Total volym | 1000 | ||
| Steg 2.1: 10x RNas H reaktionsbuffert | |||
| Reagens | Volymen för 1 ml (l) | ||
| 5 M NaCl | 200 | ||
| 1 M Tris-HCl (pH 7,5) | 500 | ||
| 1 M MgCl2 | 200 | ||
| Nukleasfritt vatten | 500 | ||
| Total volym | 1000 | ||
| Steg 2.1: Vatten wed linjär akrylamid | |||
| Reagens | Volymen för en ml buffert (l) | ||
| Nukleasfritt vatten | 992 | ||
| Linjär akrylamid (5 mg / ml) | 8 | ||
| Total volym | 1000 | ||
| Steg 2.2: hybridiseringsreaktion för selektiv utarmning | |||
| Reagens | Volym per reaktion (l) | ||
| 5x Hybridiseringsbuffert | 2 | ||
| rRNA-utarmning oligo blandning (100 ^ M) | 1,22 | ||
| Oligo (d) T (550 ng / | il) | 1 | ||
| DNas-behandlade total-RNA | upp till 5 | ||
| Spike-i RNA (Detta är valfritt) | 0,5 | ||
| Vatten (med linjär akrylamid) | ta upp till totalt 10 | ||
| totala VOLUmig | 10 | ||
| Steg 2.3: RNas H reaktion för selektiv utarmning | |||
| Reagens | Volym per reaktion (l) | ||
| 10x RNas H Reaction Buffer | 2 | ||
| Vatten (med linjär akrylamid) | 5 | ||
| Termostabilt RNas H (5 U / | il) | 3 | ||
| Total volym | 10 | ||
| Steg 2.4: DNase reaktions post selektiv utarmning | |||
| Reagens | Volym per reaktion (l) | ||
| 10x DNas Buffert | 7,5 | ||
| Vatten (med linjär akrylamid) | 44,5 | ||
| RNas-inhibitor (20 U / | il) | 1 | ||
| RNas-fritt DNas I (2,72 U / ^ il) | 2 | Total volym (med RNas H-reaktion) | 75 |
| Steg 3.1: cDNA syntes, slumpmässig primerhybridisering | |||
| Reagens | Volym per reaktion (l) | ||
| rRNA / carrier-utarmat RNA | 10 | ||
| 3 ^ g slumpmässig primer | 1 | ||
| Total volym | 11 | ||
| Steg 3.2: Första sträng cDNA-syntesreaktionen | |||
| Reagens | Volym (il) | ||
| 5x First-Strand Reaction Buffer | 4 | ||
| 0,1 M DTT | 2 | ||
| 10 mM dNTP-blandning | 1 | ||
| RNas-inhibitor (20 U / | il) | 1 | ||
| Omvänt transkriptas (lägg sist) | 1 | ||
| Total volym (med RNA ovan) </ Td> | 20 | ||
| Steg 3.3: Andra sträng cDNA-syntesreaktionen | |||
| Reagens | Volym (il) | ||
| RNas-fritt vatten | 43 | ||
| 10x Second Strand Reaction Buffer | 8 | ||
| 10 mM dNTP-blandning | 3 | ||
| E. coli DNA-ligas (10 U / | il) | 1 | ||
| E. coli DNA-polymeras I (10 U / | il) | 4 | ||
| E. coli-RNas H (2 U / | il) | 1 | ||
| Total volym (med 1: a sträng reaktion) | 80 | ||
| Steg 4.2: Tagmentation reaktion | |||
| Reagens | Volym (il) | ||
| Amplikonen Tagment Mix (ATM) | 1 | ||
| Tagment DNA Buffer (TD) 5 | |||
| Total volym (med cDNA) | 10 | ||
| Steg 4.3: Bibliotek PCR-reaktion | |||
| Reagens | Volym (il) | ||
| PCR Master Mix (NPM) | 7,5 | ||
| Index en primer (i7) | 2,5 | ||
| Index 2 primer (i5) | 2,5 | ||
| Total volym (med tagmented cDNA) | 25 | ||
| Steg 4.3.2: Biblioteks PCR-betingelser | |||
| 72 ° C, 3 min | |||
| 95 ° C, 30 sek | |||
| upp till 18 cykler-10 sek vid 95 ° C, 30 sek vid 55 ° C, 30 sek vid 72 ° C | |||
| 72 ° C, 5 min | |||
| 10 ° C, för evigt | |||
Tabell 1:. Reaktion set-up och buffertar Steg-för-steg tabeller med innehållet i alla buffertar och reaktionsblandningar.
| oligo Namn | Sekvensen (5 'till 3') | ||
| Ebola KGH FW | GTCGTTCCAACAATCGAGCG | ||
| Ebola KGH RV | CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT | ||
| Ebola KULESH FW | TCTGACATGGATTACCACAAGATC | ||
| Ebola KULESH RV | GGATGACTCTTTGCCGAACAATC | ||
| Lassa SL FW | GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC | ||
| Lassa SL RV | AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A | ||
| 18S rRNA FW | TCCTTTAACGAGGATCCATTGG | ||
| 18S rRNA RV | CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plates | VWR | 47743-953 | |
| Strips of Eight Caps | VWR | 47745-512 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | 50 ml bottle |
| TURBO DNase | Ambion | AM2238 | post RNA extraction step, 2 U/µl, buffer included |
| PCR cycler | any PCR cyclers | ||
| Agencourt RNAClean XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63987 | beads for RNA cleanup |
| Real Time qPCR system | any system | ||
| DynaMag-96 Side Skirted Magnet | Invitrogen | 12027 | |
| 70% Ethanol | prepare fresh | ||
| qRT-PCR primers | IDT DNA | see Table 2 | |
| 5 M NaCl | Ambion | AM9760G | |
| 1 M Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T2663-1L | |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
| Linear acrylamide | Ambion | AM9520 | |
| DNA oligos covering entire rRNA region | IDT DNA | see Table 3, order lab-ready at 100 µM | |
| Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt long, desalted | |
| Hybridase Thermostable RNase H | Epicentre | H39100 | |
| RNase-free DNase Kit | Qiagen | 79254 | post selective depletion step |
| SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
| Random Primers | Invitrogen | 48190-011 | mostly hexamers |
| 10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | with first-strand buffer, DTT |
| Air Incubator | any air incubator cyclers | ||
| NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer | New England Biolabs | B6117S | 10x |
| E. coli DNA Ligase | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μl |
| E. coli DNA Polymerase I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μl |
| E. coli RNase H | New England Biolabs | M0297L | 2 U/μl |
| 0.5 M EDTA | Ambion | AM9261 | |
| Agencourt AMPure XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63881 | beads for DNA cleanup |
| Elution Buffer | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8.5 | |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32857 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
| Nextera XT DNA Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
| High Sensitivity DNA reagents | Agilent | 5067-4626 | |
| Library Quantification Complete kit (Universal) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification |
References
- Stremlau, M. H., et al. Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa. PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631 (2015).
- Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345, 1369-1372 (2014).
- Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue. PLoS One. 7, e42882 (2012).
- Park, D. J., et al. Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone. Cell. 161, 1516-1526 (2015).
- Andersen, K. G., et al. Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus. Cell. 162, 738-750 (2015).
- Matranga, C. B., et al. Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples. Genome Biol. 15, 519 (2014).
- Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
- Jiang, L., et al. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).
- Agilennt Technologies. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf. (2015).
- Kapa Biosystems. , Available from: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2015).
- Illumina Technologies. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf. (2015).
- Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Res. 40, 3 (2012).
- Andrews, S. Babraham Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Hu, Y., et al. Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing. Clin Microbiol Infect. 21, e1-4 713 (2015).
- Simon-Loriere, E., et al. Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic. Nature. 524, 102-104 (2015).
- Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. Empowering African genomics for infectious disease control. Genome Biol. 15, 515 (2014).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39, 19 (2011).
- Malboeuf, C. M., et al. Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification. Nucleic Acids Res. 41, 13 (2013).
- Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny. Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nat Methods. 10, 623-629 (2013).
Tags
Medicin RNA-virus Ebolavirus Lassavirus intra-värd varianter Lassafeber poly (rA) bärare rRNA RNas H RT-PCR View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
