热火预防应激在大鼠不利影响枯草芽孢杆菌应变

Summary

我们描述了一种通过有益细菌口服预处理来预防大鼠热应激影响的方案。该方案可以修改并用于各种给药途径和不同化合物的分析。

Abstract

此研究的目的是评估对热应力有关的并发症的枯草芽孢杆菌菌株的保护作用。三十二个的Sprague-Dawley大鼠用于该研究。动物口服治疗，一天两次两天与B枯草芽孢杆菌菌株BSB3或PBS。第二天在最后一次治疗后，各组被划分和两个实验组（一个用PBS处理和一个与枯草芽孢杆菌处理的）被放置在^45℃下25分钟。两个对照组留在室温下25分钟。所有大鼠安乐死，并在各组不同的参数进行了分析。热应力的不良影响是由绒毛高度，并在肠上皮细胞总粘膜厚度的减小登记;从管腔细菌易位;增加红细胞的囊泡和仰角的脂多糖（LPS）在血液中的水平。治疗的保护效力是通过预评估这些副作用公约。该协议被设定为大鼠细菌预防热应力并发症的口服治疗，但该协议可以被修改，并用于其它给药途径和不同的化合物的分析。

Introduction

不同的压力源会影响人类和动物的健康。温度是压力最大的因素之一，会导致慢性、急性甚至致命的疾病¹。在许多情况下，热应激后肠道形态的变化和肠道屏障完整性的丧失被记录下来^2,3。这种保护屏障负责防御肠道细菌及其毒素，特别是脂多糖 （LPS） 从管腔到内循环的易位^4,5。肠道微生物群的稳定性显着影响肠道屏障功能、宿主的免疫反应和对压力条件的耐受性⁶。因此，肠道微生物群的调节可以为预防与压力相关的不良反应提供一种新的方法。

有益细菌已被用作一种很有前途的策略，可以改变肠道微生物群，以成功管理各种临床病症，如腹泻、炎症性肠病、特应性皮炎、代谢紊乱^7-10。有益细菌的益生菌作用包括产生支持肠道健康的必需代谢物、刺激免疫系统、促进乳糖耐受、恢复上皮功能障碍。益生菌在体外和动物模型中可有效预防与压力相关的并发症^11,12。

研究人员更加关注芽孢杆菌作为益生菌，因为这些细菌支持肠道稳态¹³ 并对宿主有有益作用¹⁴。我们之前的数据表明，芽孢杆菌益生菌在体外和临床试验中对病原体具有很高的疗效 ^15,16 和^17,18。在这里，我们旨在评估枯草芽孢杆菌....

Protocol

所有的实验程序，由奥本大学IACUC，阿拉巴马州奥本市批准。

1，文化传媒，餐具和细菌培养的制备

1. 接种10毫升营养肉汤的与枯草芽孢杆菌 BSB3培养物的单个菌落，在营养琼脂平板上生长过夜的烧瓶中。
2. 使500毫升孢子形成介质^19（每升:细菌用营养肉汤，8克10％（重量/体积）的KCl，10毫升，1.2％（重量/体积）用MgSO _{4×7H 2} O，10毫升，琼脂，15克），在^121℃下20分钟的高压釜。允许冷却至^50℃，并添加以下无菌溶液:1米的Ca（NO _3）2，1毫升， 0.01M的氯化锰_2,1毫升， 1 mM的_硫酸亚铁₁毫升。
3. 至^40℃，在室温下20分钟凉爽准备介质和将25 ml接种入各在无菌柜20的无菌培养皿中。让中等固化过夜。
4. 传播0.5毫升的B过夜培养芽孢杆菌BSB3到在培养皿中的介质的表面上。文化孵育在^37℃5天，直到90％孢子。显示高分辨率显微镜相亮孢子。
5. 收获细菌加入1毫升无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）的到板，并使用无菌细胞吊具从表面刮细菌。直到需要存储该悬浮液在冰箱中。
6. 在^37℃。24

Results

热应激后的动物之前，立即的平均体温为^{36.7±0.07℃，40.3±0.17℃，}分别为（P <0.05）。大鼠暴露于热（第3组）导致绒毛高度的显著抑制和总粘膜厚度（图2,3）。 BSB3应变口服从热量的有害影响的应力保护肠道之前。

从肠道细菌易位通过肠系膜淋巴结的细菌分析（MLN），肝脏和各大鼠的脾脏来确定。在1.7×10 ^{3±4.6×10 2} CFU / g组织（图4）的浓度的细菌培养物从MLN只分离和大鼠肝脏用PBS预处理并暴露于热（组3）。从对照大鼠所有测试样品（组1，2）和从热应激动物接到BSB3株（4组）共育。没有细菌从脾样品中分离。

IL-1β无明显变化; I.......

Discussion

暴露在高温下会导致严重的健康状况^29。预防和早期发现与热应激的并发症是至关重要的^30。 所提出的协议可以用来评估用于预防热应力的不良影响的各种方法的功效。

这个协议中的关键步骤包括:在热处理过程^{（45℃，25}分钟）;无热原的材料的收集和血液以防止肠毒素污染处理期间的使用;保持血清等分在^-20℃至避免反复冻融;和细菌易位的分析过程如下无菌操作。该协议建立了与细菌进行预防热应激的副作用口服治疗大鼠。施用和其它化合物的其它途径，该协议可以被修改。例如，TR的时间热应激前eatment可以延长。口服给药可改为直肠给药。被用于通过暴露于升高的温度之前口服治疗动物的预防热应力并发症枯草杆菌细菌。为了固化热应力的并发症，该协议可以通过使用细菌暴露于热治疗后的动物进行修改。

结果表明，体温度的升高而引起的红细胞囊泡的增加，并且这完全被预处理与B防止枯草芽孢杆菌的细菌。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma-Aldrich， 密苏里州圣路易斯	P4417
乙醇	Pharmco products Inc. 美国康涅狄格州布鲁克菲尔德	64-17-5
琼脂	VWR	97064-334
麦康凯琼脂平板	VWR	470180-742
5% 血琼脂平板	VWR	89405-024
含血红素和维生素 K 的布鲁氏菌血琼脂平板	VWR	89405-032
Bouin's 固定	电子显微镜科学，美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德	15990
IL-10 大鼠 ELISA 试剂盒	Invitrogen，美国加利福尼亚州卡马里奥	KRC0101
IL-1β 大鼠 ELISA 试剂盒	Invitrogen，美国加利福尼亚州卡马里奥	KRC0011
IL-6 大鼠 ELISA 试剂盒	Invitrogen，美国加利福尼亚州卡马里奥	KRC0061
INF-γ 大鼠 ELISA 试剂盒	Invitrogen，美国加利福尼亚州卡马里奥
TNF-α 大鼠 ELISA 试剂盒	Invitrogen，美国加利福尼亚州卡马里奥	KRC3011
大鼠 LPS ELISA 试剂盒	NeoBioLab，美国马萨诸塞	RL0275
环境室 6020-1	卡隆，玛丽埃塔，俄亥俄州，美国	6020-1
离心机	贝克曼库尔特，美国印第安纳波利斯	Optima L-90K
Ultra 离心
机光学显微镜光学系统	CitoViva Technology Inc.，阿拉巴马州奥本
Colony 柜台	Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡	RE-3325
冷冻机	海尔，美国纽约州布鲁克林	HCMO50LA
Ultra 微孔板reader	Bio-Tek 仪器，美国佛蒙特州 Winooski	ELx 808
自动洗浆机	Bio-Tek 仪器，美国佛蒙特州 Winooski	ELx50
移液器	Gilson，Pipetman，法国	P100、P200、P1000
C24 培养摇床	New Brunswick Scientific，美国康涅狄格州恩菲尔德	Classic C24
摇摇摇床	Reliable Scientific， Inc.，美国密西西比州内斯比	55
培养皿	Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡	875713	100 mm x 15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company，美国缅因州桑福德	SG403
培养培养培养瓶	康宁公司，美国纽约州康宁	4995	PYREX 250 ml 锥形瓶
光谱仪 Genesys 20	Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆。	4001
Sony DXC-33 摄像机	Sony
Richardson 测试玻片	电子显微镜科学，美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德	80303
Millipore 净水系统	Millipore	Direct-Q
Image-Pro Plus 软件	美国马里兰州
重光束天平	奥豪斯公司，美国新泽西州帕西帕尼