Abstract
Cette étude a été conçue pour évaluer l'effet protecteur de la souche de Bacillus subtilis contre les complications liées au stress thermique. Trente-deux rats Sprague-Dawley ont été utilisés dans cette étude. Les animaux ont été traités par voie orale deux fois par jour pendant deux jours avec B. subtilis souche BSB3 ou PBS. Le lendemain , après le dernier traitement, chaque groupe a été divisé et les deux groupes expérimentaux (une traités avec du PBS et traitées avec un B. subtilis) ont été placés à 45 ° C pendant 25 min. Deux groupes témoins sont restés pendant 25 min à température ambiante. Tous les rats ont été euthanasiés et différents paramètres ont été analysés dans tous les groupes. Les effets néfastes du stress thermique sont enregistrées par la diminution de la hauteur des villosités et de l'épaisseur totale de la muqueuse dans l'épithélium intestinal; la translocation des bactéries à partir de la lumière; (LPS) niveau dans le sang augmenté vesiculation des érythrocytes et de l'élévation des lipopolysaccharides. L'efficacité protectrice du traitement est évaluée par un prévention de ces effets secondaires. Le protocole a été mis en place pour le traitement oral de rats avec des bactéries pour la prévention des complications de stress de chaleur, mais ce protocole peut être modifié et utilisé pour d'autres voies d'administration et pour l'analyse de différents composés.
Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par IACUC de l'Université d'Auburn, Auburn, Alabama.
1. Préparation de la Culture Media, Vaisselle et culture bactérienne
- Inoculer 10 ml de bouillon nutritif dans un flacon avec une colonie unique de la culture BSB3 Bacillus subtilis cultivées pendant une nuit sur une plaque de gélose nutritive.
- Faire 500 ml de milieu de sporulation 19 (par litre: Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (p / v) de KCl, 10 ml; 1,2% (p / v) de MgSO 4 x 7H 2 O, 10 ml; agar, 15 g) et de l' autoclave à 121 ° C pendant 20 min. Laisser refroidir à 50 ° C et d' ajouter les solutions stériles suivantes: 1 M de Ca (NO 3) 2, 1 ml; 0,01 M MnCl2, 1 ml; 1 mM FeSO 4, 1 ml.
- Laisser refroidir le milieu préparé à 40 ° C pendant 20 min à température ambiante et verser dans 25 ml de chacune des 20 boîtes de Pétri stériles dans l'enceinte stérile. Que le milieu se solidifier pendant la nuit.
- Étaler 0,5 ml de culture de nuit de Bacillus subtilis BSB3 sur la surface du milieu dans les boîtes de Petri. Incuber la culture à 37 ° C pendant 5 jours jusqu'à 90% sporulation. Révéler phase lumineuse spores par microscopie à haute résolution.
- Récolte des bactéries par addition de 1 ml de phosphate de solution saline stérile tamponnée (PBS) à la plaque de raclage et les bactéries à partir d'une surface à l'aide d'un épandeur cellulaire stérile. Conserver la suspension dans le réfrigérateur jusqu'à ce que nécessaire.
- Confirmer la viabilité des bactéries par placage de 0,1 ml de la dilution appropriée (10 -5 à 10 -6) d'une suspension bactérienne sur des plaques de milieu de sporulation , suivie d' une incubation pendant 18-24 heures à 37 ° C.
- Compter les colonies bactériennes sur des plaques en utilisant un compteur de colonies et calculer le titre de bactéries dans la suspension de test. Préparer une suspension bactérienne à la concentration finale de 1 x 10 8 UFC / ml dans du PBS.
2. Animaux
- Utiliser 32 des rats mâles Sprague-Dawley (250-300 g). Maintenir les animaux dans des conditions exempts d'agents pathogènes spécifiques avec un accès gratuit à chow à granulés standard et l'eau. Établir une température moyenne (21 ± 1 ° C), l' humidité (50 ± 5%) et un cycle de lumière-obscurité de 12 h.
3. Conception expérimentale
- Démarrer le traitement des animaux par gavage oral 11, après 2 jours d'acclimatation. Utiliser la seringue avec l'aiguille de gavage oral. Traiter 16 rats avec B. subtilis BSB3 suspension (1 ml par rat) deux fois par jour pendant deux jours (groupe B. subtilis). Traiter les 16 rats avec du PBS (1 ml par rat) deux fois par jour pendant deux jours (groupe PBS) (figure 1).
- Après le traitement, subdiviser chaque groupe (8 rats par groupe): Groupe 1- contrôle (PBS / pas de stress), Groupe 2- B. subtilis (B. subtilis / pas de stress), Groupe 3- contrainte (PBS / stress thermique) et le groupe 4- B. subtilis + le stress (B. subtilis stress / chaleur).
- Mesurer la température rectale de chaque rat en utilisant un electronic thermomètre numérique. Gardez les rats des groupes 1 et 2 à la température ambiante pendant 25 min. Placer les animaux des groupes 3 et 4 dans une chambre climatique à 45 ° C et une humidité relative de 55% pendant 25 min.
- Ensuite, mesurer la température rectale de chaque rat dans tous les groupes à l'aide d'un thermomètre numérique électronique. Placez tous les animaux à la température ambiante pendant 4 heures.
- Anesthetize rats avec isoflurane (2-4%) dans un bocal d'anesthésie refermable et observer jusqu'à ce que les rats sont profondément anesthésiés (absence de réponse à pincement de l'orteil). Euthanasier rats par décapitation rapide avec une guillotine.
- Recueillir le sang du tronc de chaque rat 20 (15 - 16 ml) avec les pipettes apyrogènes dans des tubes apyrogènes pour obtenir le sérum et immédiatement prélever des échantillons de sang (7 pi de chaque rat) avec une pipette pour l' examen microscopique.
- Placer les tubes avec le sang dans un réfrigérateur pendant au moins 30 minutes pour permettre la coagulation. Tubes à centrifuger à 20 o C, 7000 xg pendant 10 min et rapidementretirer le sérum avec une pipette. Sérum aliquote obtenu à partir de chaque rat dans des volumes de 50 et conserver à -20 ° C jusqu'au dosage.
4. Procédure chirurgicale
- Couper / garniture tout fourrure de l'abdomen et du thorax de la face inférieure de la carcasse avec des cisailles électriques. Placer la carcasse dans une enceinte stérile et de traiter la surface rasée de la carcasse avec 70% d'alcool.
- Utilisation d'un scalpel stérile pour créer une incision médiane de l'abdomen. Enlever le foie, les ganglions lymphatiques mésentériques, la rate et l'intestin grêle de chaque rat en utilisant des pinces stériles.
5. Analyse de la translocation bactérienne
- Placer chaque échantillon de foie, des ganglions lymphatiques mésentériques et la rate dans des tubes stériles pré-pesées et peser. Calculer le poids de l'échantillon en tant que différence entre le poids d'un tube à échantillon et le poids d'un tube vide.
- Ajouter du PBS stérile dans le tube pour obtenir une dilution de 1:10 (p / v) de l'échantillon et homonize chaque échantillon avec un homogénéiseur de tissu de verre stérile pour obtenir une suspension 21 homogène.
- Faire des dilutions en série (10 -1 à 10 -4) de chaque échantillon dans du PBS stérile. Plaque 0,1 ml de toutes les dilutions de chaque soie sur la surface de MacConkey et de la gélose au sang à 5% et la gélose au sang avec Brucella hémine (0,005 g / L) et de la vitamine K1 (0,01 g / L) des plaques.
- Incuber MacConkey et de 5% des plaques de gélose au sang en milieu aérobie et Brucella plaques de gélose au sang en anaérobiose à 37 ° C 22.
- Nombre de colonies de bactéries aérobies après 24 h, et les colonies de bactéries anaérobies, après 48 heures d'incubation en utilisant un compteur de colonies. Exprimer les résultats, le nombre d'unités formant des colonies (UFC) dans un gramme de tissu.
6. Analyse histologique
- Retirer de petits échantillons d'intestin de chaque rat par l'intervention chirurgicale (étapes 4/1 à 4/2). Fixer des échantillons dans le fixateur de Bouin, incorporer dans de la paraffine,préparer 6 um sections et des sections de tache avec de l' hématoxyline et de l' éosine en utilisant des procédures standard 23.
- Utiliser un système de microscope à haute résolution pour mesurer la hauteur des villosités intestinales et de l' épaisseur totale de la muqueuse dans chaque échantillon (grossissement 100X) 24. Analyser 4 échantillons de chaque rat et de faire au moins vingt mesures dans chaque échantillon. Exprimez les résultats en micromètres.
7. Cytokine Assay
- Utilisez des kits commerciaux rat ELISA pour IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ et l'IL-10 pour mesurer les niveaux de cytokines dans le sérum selon le protocole du fabricant.
- Générer des courbes standard pour chaque ensemble d'échantillons analysés en utilisant des normes pour le kit pertinent. Définir le niveau de cytokines dans chaque échantillon par comparaison des données expérimentales avec la courbe standard appropriée.
8. lipopolysaccharide Assay
- Analyser le niveau de LPS dans le sérum en utilisant un kit de LPS chez le rat selon la méthode ELISAle protocole du fabricant. Estimer la concentration de LPS dans des échantillons par comparaison des valeurs obtenues avec les valeurs de la courbe standard.
9. Haute Résolution Lumière Microscopie du sang
- Utilisez le système de microscope décrit précédemment 25,26. Utiliser une plate - forme d'isolation de vibration en tant que base pour le système de microscope et une caméra vidéo et un ordinateur 25 pour enregistrer les images en temps réel. Calibrer images de test en utilisant une diapositive Richardson comme décrit précédemment 27.
- Placez 7 pi de sang fraîchement prélevé sur chaque rat sur une lame de verre, lamelle, photographier et enregistrer dix trames d' image de 72 × 53,3 um 2 dans chaque échantillon (grossissement 1,700X).
- Mesurer la concentration de vésicules en utilisant un logiciel qui fournit à haute résolution à vision directe des images optiques en temps réel. Examiner un minimum de 20 trames d' image pour chaque condition expérimentale 28.
10. Statistics
- Exprimez toutes les valeurs que la moyenne et l'écart type. Effectuer une analyse statistique et graphique tracé. Analyser les résultats obtenus avec le test t de deux échantillons, réglez le niveau de signification de 0,05 pour définir la signification statistique.
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Representative Results
La température corporelle moyenne des animaux avant et immédiatement après le stress thermique était de 36,7 ± 0,07 o C et 40,3 ± 0,17 ° C, respectivement (P <0,05). L' exposition des rats à la chaleur (groupe 3) a entraîné une inhibition significative de la hauteur de villosités et de l' épaisseur totale de la muqueuse (figures 2, 3). L'administration orale de la souche BSB3 avant le stress protégé intestin de l'effet nocif de la chaleur.
Translocation des bactéries de l'intestin a été déterminée par une analyse bactériologique des ganglions lymphatiques mésentériques (MLN), le foie et la rate de chaque rat. Cultures bactériennes présentes dans une concentration de 1,7 x 10 3 ± 4,6 x 10 2 UFC / g de tissu (figure 4) ont été isolés uniquement à partir MLN et foie de rats prétraités avec du PBS et exposés à la chaleur (groupe 3). Tous les échantillons testés à partir de rats témoins (groupes 1, 2) et des animaux de stress thermiquea reçu une souche BSB3 (groupe 4) étaient stériles. Aucune bactérie n'a été isolées à partir d'échantillons de rate.
Aucun changement de l'IL-1β; IL-6, le TNF-α, INF-y des niveaux de cytokines ont été enregistrés chez des rats de stress thermique. Dans le sérum des animaux traités avec du PBS avant l' exposition à la chaleur élévation significative des taux d' IL-10 et le LPS n'a été trouvée (groupe 3) - (figures 5, 6). Pré-traitement avec B. BSB3 subtilis (groupe 4) a empêché l'augmentation de l' IL-10 et le LPS dans le sérum des animaux de stress thermique.
Une augmentation significative de la concentration des vésicules libres de (1,4 ± 0,2) × 10 6 à (3,8 ± 0,3) × 10 6 vésicules ul -1 (p <0,001) a été trouvé dans le sang des rats qui ont reçu du PBS avant le stress thermique (figures 7 , 8). Dans un groupe d'animaux prétraités avec BSB3 aucun changement dans le nombre de vésicules libres a été trouvée à l'arrièreer exposition à la chaleur (figure 7).
Figure 1. Conception de l' étude. Deux groupes de rats (16 rats dans chaque groupe) ont été traités par gavage oral avec B. BSB3 subtilis (B. subtilis groupe) ou avec du PBS (groupe PBS) deux fois par jour. Au jour 3 de chaque groupe a été subdivisé en 8 rats dans chaque groupe. Les rats du groupe 3 et 4 ont été placés à 45 ° C pendant 25 min. Les animaux témoins (groupes 1 et 2) ont été maintenus à température ambiante. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Mesure de Intestinal Villi Hauteur (A) et l' épaisseur de la muqueuse (B) chez le rat. Les rats prétraités avec du PBS ouB.subtilis BSB3 ont été exposés à 45 ° C (stress) ou à la température ambiante (témoin). Chaque groupe était composé de 8 rats. Vingt mesures de chaque paramètre dans chaque échantillon ont été prises. Les valeurs sont présentées comme la moyenne et l'écart-type. Les résultats ont été analysés avec le test t échantillon au niveau de signification de 0,05 pour définir la signification statistique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Images histologiques de la muqueuse intestinale colorées à l' hématoxyline et de l' éosine. Les rats ont été pré-traitées avec du PBS ou B. BSB3 subtilis et exposé à 45 ° C (stress) ou à la température ambiante (témoin) A. PBS / aucune contrainte;. B. PBS pression / chaleur; C. B. subtilis / pas de stress; D. B. subtilis contrainte / chaleur. hauteur Villi est indiquée par des flèches. Bar 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Nombre total de bactéries dans les tissus de rats. Les rats pré-traitée avec du PBS ou B. BSB3 subtilis ont été exposés à 45 ° C (stress) ou à la température ambiante (témoin). Chaque groupe était composé de 8 rats. nœuds lymphatiques mésentériques, le foie et la rate ont été enlevés aseptiquement de chaque rat, homogénéisé et étalées sur des milieux d'agar pour récupérer les bactéries aérobies et anaérobies. Nombre total de bactéries translocation (aérobies et anaérobies) est présenté sous forme d'unités formant des colonies (UFC) par gramme de tissu. Les valeurs sont présentées sous forme la moyenne et l'écart - type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Niveau d'IL-10 dans le sérum des rats. Les rats pré-traitée avec du PBS ou B. BSB3 subtilis ont été exposés à 45 ° C (stress) ou à la température ambiante (témoin). Chaque groupe était composé de 8 rats. Le sérum sanguin a été obtenu à partir de chaque rat et analysé avec un kit ELISA de rat commercial. Les valeurs sont présentées comme la moyenne et l'écart-type. Les résultats ont été analysés avec le test t échantillon au niveau de signification de 0,05 pour définir la signification statistique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. LPS dans le sérum des rats. Les rats pré-traitée avec du PBS ou B. BSB3 subtilis ont été exposés à 45 ° C (stress) ou à la température ambiante (témoin). Chaque groupe était composé de 8 rats. Le sérum sanguin a été obtenu à partir de chaque rat et analysé avec un kit ELISA de rat commercial. Les valeurs sont présentées comme la moyenne et l'écart-type. Les résultats ont été analysés avec le test t échantillon au niveau de signification de 0,05 pour définir la signification statistique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Nombre de vésicules dans le sang des rats. Les rats prétraitésavec du PBS ou B. BSB3 subtilis ont été exposés à 45 ° C (stress) ou à la température ambiante (témoin). Une petite goutte (7 pi) de sang fraîchement prélevé a été placé sur une lame de verre, sous une lamelle, photographié et enregistré dix trames d'image dans chaque échantillon (grossissement 1,700X). La concentration des vésicules a été mesurée en utilisant un logiciel qui fournit à haute résolution à vision directe des images optiques en temps réel. Vingt trames d'image ont été examinées pour chaque condition expérimentale. Les valeurs sont présentées comme la moyenne et l'écart-type. Les résultats ont été analysés avec le test t échantillon au niveau de signification de 0,05 pour définir la signification statistique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8. Augmentation de la Vesicles Concentration dans le sang après le stress thermique. image vidéo du sang des rats prétraités avec PBS avant l' exposition à la température ambiante (A) ou à 45 o C (B). Une petite goutte (7 pi) de sang fraîchement prélevé a été placé sur une lame de verre, sous une lamelle, photographié et enregistré dix trames d'image dans chaque échantillon (grossissement 1,700X). La vésicule est indiquée comme V. Bar 6 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L' exposition à haute température dans des conditions de santé graves 29. Prévention et détection précoce des complications liées au stress thermique sont d' une importance vitale 30. Le protocole présenté peut être utilisé pour évaluer l'efficacité de diverses approches pour la prévention des effets nocifs de stress thermique.
Les étapes critiques au sein de ce protocole comprennent: la procédure de traitement thermique (45 ° C, 25 min); l'utilisation de matériaux apyrogènes pendant la collecte et le traitement du sang pour éviter la contamination par entérotoxines; en gardant aliquotes de sérum à -20 ° C pour éviter la congélation et décongélation; et en suivant la procédure stérile lors de l'analyse de la translocation bactérienne. Le protocole a été mis en place pour le traitement oral de rats avec des bactéries pour la prévention des effets secondaires du stress thermique. Pour d'autres voies d'administration et d'autres composés, ce protocole peut être modifié. Par exemple, le temps de traitement avant le stress thermique peut être prolongée. L' administration orale peut être modifiée pour l' administration rectale. Bactérie Bacillus subtilis ont été utilisées pour la prévention des complications de contrainte thermique par un traitement par voie orale des animaux avant l' exposition à une température élevée. Afin de remédier à des complications de stress thermique, ce protocole peut être modifié par l'utilisation de bactéries pour le traitement des animaux après exposition à la chaleur.
Il a été montré que l'élévation de la température corporelle a provoqué une augmentation de vésiculation érythrocytaire, ce qui était complètement empêchée par un prétraitement avec B. bactéries subtilis. Ainsi, l'augmentation de la concentration des vésicules dans le sang lors d'une exposition à la chaleur peut indiquer le niveau de stress thermique et fournit une preuve de diagnostic pour la stabilité des globules rouges et leur résistance à la chaleur. Il est également un test très utile et rapide pour l'évaluation de l'efficacité du traitement préventif contre les complications de stress thermique. L'induction of protéines de choc thermique comme un marqueur de stress thermique a été précédemment discuté 30, mais cette approche est longue et ne peuvent pas être utilisés pour le diagnostic en temps réel de la réponse au stress thermique.
L'approche présentée pour la prévention des effets néfastes du stress thermique est simple, rentable et ne nécessite pas de matériel supplémentaire ou des installations spéciales. Les futures applications de ce travail aidera à comprendre les mécanismes de protection contre les complications de stress de chaleur et de caractériser les nouvelles procédures de cette protection. Cette méthode est d' une importance pour les travailleurs de la route, le personnel militaire, les athlètes - groupes de personnes qui sont à risque de coup de chaleur pendant l' activité physique en plein air intense 29. L'approche proposée permet d'examiner le niveau de stress de chaleur et d'évaluer diverses méthodes pour protéger la santé des personnes qui travaillent dans des conditions extrêmes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA | 64-17-5 | |
| Agar | VWR | 97064-334 | |
| MacConkey agar plates | VWR | 470180-742 | |
| 5% blood agar plates | VWR | 89405-024 | |
| Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K | VWR | 89405-032 | |
| Bouin’s Fixative | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 15990 | |
| IL-10 Rat ELISA kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0101 | |
| IL-1beta Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0011 | |
| IL-6 Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0061 | |
| INF-gamma Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC4021 | |
| TNF-alpha Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC3011 | |
| Rat LPS ELISA Kit | NeoBioLab, MA, USA | RL0275 | |
| Environmental Chamber 6020-1 | Caron, Marietta, OH, USA | 6020-1 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Optima L-90K | |
| Ultra Centrifuge | |||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| Colony counter | Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA | RE-3325 | |
| Freezer | Haier, Brooklyn, NY, USA | HCMO50LA | |
| Ultra microplate reader | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx 808 | |
| Auto Strip Washer | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx50 | |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA | Classic C24 | |
| Rocking Shaker | Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA | 55 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, Sanford, ME, USA | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, Corning, NY, USA | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer Genesys 20 | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA. | 4001 | |
| Sony DXC-33 Video camera | Sony | ||
| Richardson test slide | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA | 80303 | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Image-Pro Plus software | Media Cybernetics, MD, USA | ||
| Triple Beam Balance | OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA | ||
| Tissue Homogenizer, Dounce | VWR | 71000-518 |
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