Abstract
Questo studio è stato disegnato per valutare l'effetto protettivo del ceppo Bacillus subtilis contro complicazioni legate allo stress da calore. Trentadue ratti Sprague-Dawley sono stati utilizzati in questo studio. Gli animali sono stati trattati per via orale due volte al giorno per due giorni con B. subtilis ceppo BSB3 o PBS. Il giorno dopo l'ultimo trattamento, ciascun gruppo è stato diviso e due gruppi sperimentali (uno trattato con PBS e uno trattato con B. subtilis) sono stati posti a 45 ° C per 25 min. Due gruppi di controllo alloggiato per 25 min a temperatura ambiente. Tutti i ratti sono stati sacrificati e diversi parametri sono stati analizzati in tutti i gruppi. Gli effetti avversi di stress da calore sono registrati dalla diminuzione di altezza villi e lo spessore della mucosa totale a livello dell'epitelio intestinale; traslocazione di batteri dal lume; aumento vescicolazione degli eritrociti ed elevazione dei lipopolisaccaridi (LPS) concentrazione nel sangue. L'efficacia protettiva di trattamento viene valutata preintervento di questi effetti collaterali. Il protocollo è stato istituito per il trattamento orale di ratti con batteri per la prevenzione delle complicanze di stress termico, ma questo protocollo può essere modificato e utilizzato per altre vie di somministrazione e per l'analisi di composti diversi.
Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal IACUC della Auburn University, Auburn, in Alabama.
1. Preparazione della Cultura Media, Piatti e coltura batterica
- Seminare 10 ml di brodo nutritivo in un pallone con una singola colonia della cultura BSB3 Bacillus subtilis, cresciuto durante la notte su una piastra di agar nutriente.
- Rendere 500 ml di terreno di sporulazione 19 (per litro: Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (w / v) KCl, 10 ml; 1,2% (w / v) MgSO 4 x 7H 2 O, 10 ml, agar, 15 g) e in autoclave a 121 ° C per 20 min. Lasciare raffreddare a 50 ° C e aggiungere le seguenti soluzioni sterili: 1 M Ca (NO3) 2, 1 ml; 0.01 M MnCl 2, 1 ml; 1 mM FeSO 4, 1 ml.
- Raffreddare medio disposti a 40 ° C per 20 min a temperatura ambiente e versare 25 ml in ciascuna delle 20 piastre di Petri sterili nell'armadio sterile. Lasciate che il mezzo di solidificare durante la notte.
- Stendere 0,5 ml di cultura durante la notte di Bacillus subtilis BSB3 sulla superficie del terreno in piastre Petri. Incubare coltura a 37 ° C per 5 giorni fino al 90% sporulazione. Rivela spore di fase luminosa di microscopia ad alta risoluzione.
- batteri Harvest aggiungendo 1 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS) alla piastra e raschiando batteri da una superficie utilizzando una spatola cellulare sterile. Conservare la sospensione in frigorifero fino al momento.
- Conferma vitalità dei batteri placcatura 0,1 ml della diluizione appropriata (10 -5 a 10 -6) di una sospensione batterica su piastre di terreno sporulazione seguita da incubazione per 18 - 24 ore a 37 ° C.
- Contare le colonie batteriche sulle piastre utilizzando un contatore di colonie e calcolare il titolo di batteri in sospensione testato. Preparare sospensione batterica con la concentrazione finale 1 x 10 8 UFC / ml in PBS.
2. Gli animali
- Utilizzare 32 ratti maschi Sprague-Dawley (250-300 g). Mantenere gli animali sotto specifiche condizioni esenti da organismi patogeni, con libero accesso a chow pellet standard ed acqua. Stabilire una temperatura media (21 ± 1 ° C), umidità (50 ± 5%) e un ciclo luce-buio 12 hr.
3. Progettazione sperimentale
- Inizia trattamento degli animali mediante sonda gastrica 11, dopo 2 giorni di acclimatazione. Usare la siringa con l'ago sonda gastrica. Trattare 16 ratti con B. sospensione subtilis BSB3 (1 ml per topo) due volte al giorno per due giorni (B. subtilis gruppo). Trattare 16 ratti con PBS (1 ml per topo) due volte al giorno per due giorni (gruppo PBS) (Figura 1).
- Dopo il trattamento, suddividere ogni gruppo (8 ratti per gruppo): Gruppo 1- controllo (PBS / no stress), Gruppo 2- B. subtilis (B. subtilis / no stress), Gruppo 3- lo stress (PBS / stress da calore) e Gruppo B. 4- subtilis + lo stress (B. subtilis lo stress / calore).
- Misurare la temperatura rettale ogni ratto utilizzando un elettronic termometro digitale. Mantenere ratti dei gruppi 1 e 2 a temperatura ambiente per 25 min. Luogo animali dei gruppi 3 e 4 in una camera climatica a 45 ° C e umidità relativa del 55% per 25 min.
- Successivamente, misurare la temperatura rettale di ogni ratto in tutti i gruppi con un termometro elettronico digitale. Mettere tutti gli animali a temperatura ambiente per 4 ore.
- Anestetizzare ratto con isoflurano (di 2 - 4%) in un vaso anestesia sigillabile e osservare finché i ratti sono profondamente anestetizzati (assenza di risposta a pinch tep). Eutanasia ratti da una rapida decapitazione con una ghigliottina.
- Raccogliere il sangue del tronco da ogni ratto 20 (15 - 16 ml) con le pipette apirogena in provette apirogena per ottenere siero e immediatamente prelevare campioni di sangue (7 microlitri da ogni ratto) con una pipetta per l'esame microscopico.
- Mettere provette con il sangue in frigorifero per almeno 30 minuti per consentire la coagulazione. Provette da centrifuga a 20 ° C, 7.000 xg per 10 min e rapidamenterimuovere siero con una pipetta. Siero Aliquota ottenuti da ogni ratto in 50 volumi microlitri e conservare a -20 ° C fino al dosaggio.
4. Procedura chirurgica
- Cut / tagliare tutta pelliccia dall'addome e del torace della parte inferiore della carcassa con cesoie elettriche. Posizionare la carcassa in un armadio sterile e trattare la superficie rasata di carcassa con il 70% di alcol.
- Utilizzare un bisturi sterile per creare un'incisione mediana dell'addome. Rimuovere il fegato, linfonodi mesenterici, milza e intestino tenue da ogni ratto con una pinzetta sterile.
5. Analisi di traslocazione batterica
- Posizionare ogni campione di fegato, linfonodi mesenterici e la milza in provette sterili pre-pesati e pesare. Calcolare il peso del campione come una differenza tra il peso di un tubo con un campione e il peso di un tubo vuoto.
- Aggiungere PBS sterile al tubo per ottenere una diluizione 1:10 (w / v) del campione e omogenize ciascun campione con un omogeneizzatore tessuto di vetro sterile per ottenere una sospensione omogenea 21.
- Effettuare diluizioni seriali (10 -1 a 10 -4) di ogni campione in PBS sterile. Piatto 0,1 ml di tutte le diluizioni di ciascun tessuto sulla superficie del MacConkey e di 5% agar sangue e Brucella agar sangue con emina (0.005 g / L) e vitamina K1 (0.01 g / L) piastre.
- Incubare MacConkey e di 5% piastre di agar sangue aerobico e piastre di agar sangue Brucella in condizioni anaerobiche a 37 ° C 22.
- Contare le colonie di batteri aerobici dopo 24 ore, e le colonie di batteri anaerobici dopo 48 ore di incubazione con un contatore di colonie. Esprimere i risultati come il numero di unità formanti colonie (CFU) in un grammo di tessuto.
6. analisi istologica
- Rimuovere piccoli campioni intestino da ogni ratto dalla procedura chirurgica (passi 4,1-4,2). Fissare i campioni in fissativo di Bouin, incorporare in paraffina,preparare 6 sezioni micron e sezioni macchia con ematossilina eosina utilizzando le procedure standard 23.
- Utilizzare un sistema di microscopia ad alta risoluzione per la misurazione dell'altezza dei villi intestinali e spessore totale della mucosa in ciascun campione (ingrandimento 100X) 24. Analizzare i 4 campioni provenienti da ogni ratto e fare almeno una ventina di misure in ogni campione. Esprimere i risultati in micrometri.
7. citochine Assay
- Utilizzare kit commerciali ratto ELISA per IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ e IL-10 per misurare i livelli di citochine nel siero secondo il protocollo del produttore.
- Generare curve standard per ogni set di campioni analizzati utilizzando standard per il kit in questione. Definire il livello di citochine in ciascun campione mediante confronto dei dati sperimentali con la curva standard appropriato.
8. Lipopolisaccaride Assay
- Analizzare il livello di LPS nel siero usando un topo kit ELISA LPS in base alleprotocollo del produttore. Stima concentrazione di LPS in campioni per confronto dei valori ottenuti con i valori della curva standard.
9. Alta Risoluzione microscopia ottica di Sangue
- Utilizzare il sistema del microscopio descritto in precedenza 25,26. Utilizzare una piattaforma isolamento delle vibrazioni come base per il sistema di microscopio e telecamera e il computer 25 per registrare le immagini in diretta. Calibrare immagini di prova utilizzando una diapositiva Richardson come descritto in precedenza 27.
- Mettere 7 ml di sangue appena prelevato da ogni ratto su un vetrino, vetrino, fotografia e registrare dieci fotogrammi di immagine di 72 × 53,3 micron 2 in ciascun campione (ingrandimento 1,700X).
- Misurare la concentrazione di vescicole usando il software che fornisce immagini ottiche con vista diretta ad alta risoluzione in tempo reale. Esaminare un minimo di 20 fotogrammi per ogni condizione sperimentale 28.
10. Statistic
- Esprimere tutti i valori come media e deviazione standard. Effettuare analisi statistiche e grafico tracciato. Analizzare i risultati con i due campioni t-test, impostare il livello di significatività a 0.05 per definire la significatività statistica.
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Representative Results
La temperatura corporea media degli animali prima e subito dopo lo stress da calore era 36,7 ± 0,07 ° C e 40,3 ± 0,17 ° C, rispettivamente (P <0,05). L'esposizione di ratti a calore (gruppo 3) ha determinato una significativa inibizione di altezza villi e spessore della mucosa totale (figure 2, 3). La somministrazione orale di ceppo BSB3 prima lo stress protetto intestino dagli effetti dannosi del calore.
Traslocazione di batteri dall'intestino è stata determinata mediante analisi batteriologiche dei linfonodi mesenterici (MLN), fegato e milza di ogni ratto. Le colture batteriche in una concentrazione di 1,7 x 10 3 ± 4,6 x 10 2 UFC / g di tessuto (Figura 4) sono stati isolati solo MLN e nel fegato di ratti pretrattati con PBS ed esposti al calore (gruppo 3). Tutti i campioni testati da ratti di controllo (gruppi 1, 2) e da animali calore sottolineatoha ricevuto un ceppo BSB3 (gruppo 4) erano sterili. Senza batteri sono stati isolati da campioni milza.
Nessun cambiamento di IL-1β; IL-6, TNF-α, INF-g livelli di citochine sono stati registrati nei ratti di calore-ha sottolineato. Nel siero di animali trattati con PBS prima dell'esposizione al calore significativo aumento dei livelli di IL-10 e LPS è stato trovato (gruppo 3) - (figure 5, 6). Il pre-trattamento con B. subtilis BSB3 (gruppo 4) ha impedito l'aumento di IL-10 e LPS nel siero degli animali di calore-ha sottolineato.
Un aumento significativo della concentrazione di vescicole libera da (1.4 ± 0.2) × 10 6 a (3.8 ± 0.3) × 10 6 vescicole ml -1 (p <0,001) è stato trovato nel sangue di ratti che hanno ricevuto PBS prima di stress da calore (figure 7 , 8). In un gruppo di animali pretrattati con BSB3 alcun cambiamento nel numero di vescicole libere è stato trovato poppaer esposizione al calore (figura 7).
Figura 1. Studio del progetto. Due gruppi di ratti (16 ratti di ogni gruppo) sono stati trattati mediante sonda gastrica con B. subtilis BSB3 (B. subtilis gruppo) o con PBS (gruppo PBS) due volte al giorno. Il giorno 3 ogni gruppo è stato suddiviso da 8 ratti di ciascun gruppo. Ratti appartenenti al gruppo 3 e 4 sono stati collocati a 45 o C per 25 min. Gli animali di controllo (gruppi 1 e 2) sono stati tenuti a temperatura ambiente. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Misura della intestinale Villi Altezza (A) e della mucosa spessore (B) nei ratti. Ratti pretrattati con PBS oB. subtilis BSB3 sono stati esposti a 45 o C (stress) oppure a temperatura ambiente (controllo). Ogni gruppo era composto di 8 ratti. sono state prese venti misurazioni di ciascun parametro in ciascun campione. I valori sono presentati come media e la deviazione standard. I risultati sono stati analizzati con i due campioni t-test a livello di significatività 0.05 per definire la significatività statistica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. istologici Immagini di mucosa intestinale colorate con ematossilina eosina. I ratti sono stati pre-trattati con PBS o B. subtilis BSB3 ed esposto a 45 ° C (stress) oppure a temperatura ambiente (Control) A. PBS / no stress;. B. PBS sforzo / calore; C. B. subtilis / no stress; D. B. subtilis lo stress / calore. altezza Villi è indicato da frecce. Bar 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Numero totale di batteri nei tessuti di topi. I topi pre-trattati con PBS o B. subtilis BSB3 sono stati esposti a 45 o C (stress) oppure a temperatura ambiente (controllo). Ogni gruppo era composto di 8 ratti. linfonodi mesenterici, fegato e la milza sono stati asetticamente rimossi da ogni ratto, omogeneizzato e placcato su un supporto agar di recuperare batteri aerobi e anaerobi. Conteggio totale di batteri traslocati (aerobici ed anaerobici) si presenta come unità formanti colonie (CFU) per grammo di tessuto. I valori sono presentati come la media e la deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Livello di IL-10 in siero di ratti. Ratti pre-trattati con PBS o B. subtilis BSB3 sono stati esposti a 45 o C (stress) oppure a temperatura ambiente (controllo). Ogni gruppo era composto di 8 ratti. siero del sangue è stato ottenuto da ogni ratto e analizzata con un ratto commerciale kit ELISA. I valori sono presentati come media e la deviazione standard. I risultati sono stati analizzati con i due campioni t-test a livello di significatività 0.05 per definire la significatività statistica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. LPS nel siero di ratti. Ratti pre-trattati con PBS o B. subtilis BSB3 sono stati esposti a 45 o C (stress) oppure a temperatura ambiente (controllo). Ogni gruppo era composto di 8 ratti. siero del sangue è stato ottenuto da ogni ratto e analizzata con un ratto commerciale kit ELISA. I valori sono presentati come media e la deviazione standard. I risultati sono stati analizzati con i due campioni t-test a livello di significatività 0.05 per definire la significatività statistica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Numero di vescicole nel sangue di ratti. Ratti pretrattatocon PBS o B. subtilis BSB3 sono stati esposti a 45 o C (stress) oppure a temperatura ambiente (controllo). Una piccola goccia (7 ml) di sangue appena prelevato è stato posto su un vetrino, coprioggetto, fotografato e registrato dieci fotogrammi dell'immagine in ogni campione (ingrandimento 1,700X). Concentrazione di vescicole è stata misurata utilizzando il software che fornisce immagini ottiche con vista diretta ad alta risoluzione in tempo reale. Venti fotogrammi sono stati esaminati per ogni condizione sperimentale. I valori sono presentati come media e la deviazione standard. I risultati sono stati analizzati con i due campioni t-test a livello di significatività 0.05 per definire la significatività statistica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. Aumento della Vesicli Concentrazione nel sangue dopo stress termico. immagine video di sangue dei ratti pretrattati con PBS prima dell'esposizione a temperatura ambiente (A) o 45 ° C (B). Una piccola goccia (7 ml) di sangue appena prelevato è stato posto su un vetrino, coprioggetto, fotografato e registrato dieci fotogrammi dell'immagine in ogni campione (ingrandimento 1,700X). La vescicola è indicato come V. Bar 6 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'esposizione a risultati di alta temperatura in gravi condizioni di salute 29. La prevenzione e la diagnosi precoce delle complicanze legate allo stress termico sono di vitale importanza 30. Il protocollo presentato può essere utilizzato per valutare l'efficacia di vari approcci per la prevenzione degli effetti avversi tensione termica.
Passaggi critici all'interno di questo protocollo sono: la procedura di trattamento termico (45 ° C, 25 min); l'utilizzo di materiali apirogena durante la raccolta e il trattamento di sangue per prevenire la contaminazione con enterotossine; mantenendo aliquote di siero a -20 ° C per evitare ripetuti di congelamento e scongelamento; e seguente procedura sterile durante l'analisi di traslocazione batterica. Il protocollo è stato istituito per il trattamento orale di ratti con i batteri per la prevenzione degli effetti collaterali dello stress termico. Per le altre vie di somministrazione e di altri composti, questo protocollo può essere modificato. Ad esempio, il tempo di treatment prima che lo stress da calore può essere esteso. La somministrazione orale può essere modificato per somministrazione rettale. Bacillus subtilis batteri sono stati usati per la prevenzione delle complicanze tensione termica mediante trattamento orale di animali prima esposizione a temperature elevate. Per curare complicanze di stress termico, questo protocollo può essere modificato con l'uso di batteri per il trattamento di animali dopo esposizione al calore.
È stato dimostrato che l'innalzamento della temperatura corporea causato un aumento di eritrociti vescicolazione, e questo è stato completamente impedito da pre-trattamento con B. batteri subtilis. Pertanto, l'aumento della concentrazione vescicole nel sangue durante l'esposizione al calore può indicare il livello di stress termico e fornisce la prova diagnostica per la stabilità degli eritrociti e la loro resistenza al calore. E 'anche un test molto utile e rapido per la valutazione dell'efficacia di un trattamento preventivo contro complicazioni tensione termica. L'induzione of heat shock proteins come marker di stress termico è stato precedentemente discusso 30, ma questo approccio richiede molto tempo e non possono essere utilizzati per la diagnosi in tempo reale della risposta a stress termico.
L'approccio presentato per la prevenzione degli effetti negativi dello stress termico è semplice, conveniente e non richiede ulteriori attrezzature o strutture speciali. La futura applicazione di questo lavoro aiuterà a comprendere i meccanismi di protezione contro le complicanze stress da calore e caratterizzare le nuove procedure per questa protezione. Questo metodo è di importanza per i lavoratori della strada, il personale militare, atleti - gruppi di persone che sono a rischio di colpo di calore durante l'intensa attività fisica all'aperto 29. L'approccio proposto permette di esaminare il livello di stress da calore e di valutare i vari metodi per proteggere la salute delle persone che lavorano in condizioni estreme.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA | 64-17-5 | |
| Agar | VWR | 97064-334 | |
| MacConkey agar plates | VWR | 470180-742 | |
| 5% blood agar plates | VWR | 89405-024 | |
| Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K | VWR | 89405-032 | |
| Bouin’s Fixative | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 15990 | |
| IL-10 Rat ELISA kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0101 | |
| IL-1beta Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0011 | |
| IL-6 Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0061 | |
| INF-gamma Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC4021 | |
| TNF-alpha Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC3011 | |
| Rat LPS ELISA Kit | NeoBioLab, MA, USA | RL0275 | |
| Environmental Chamber 6020-1 | Caron, Marietta, OH, USA | 6020-1 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Optima L-90K | |
| Ultra Centrifuge | |||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| Colony counter | Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA | RE-3325 | |
| Freezer | Haier, Brooklyn, NY, USA | HCMO50LA | |
| Ultra microplate reader | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx 808 | |
| Auto Strip Washer | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx50 | |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA | Classic C24 | |
| Rocking Shaker | Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA | 55 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, Sanford, ME, USA | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, Corning, NY, USA | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer Genesys 20 | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA. | 4001 | |
| Sony DXC-33 Video camera | Sony | ||
| Richardson test slide | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA | 80303 | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Image-Pro Plus software | Media Cybernetics, MD, USA | ||
| Triple Beam Balance | OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA | ||
| Tissue Homogenizer, Dounce | VWR | 71000-518 |
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