Abstract
この研究は、熱ストレスに関連する合併症に対するバチルス・ズブチリス株の保護効果を評価するために設計しました。 32個のSprague-Dawleyラットをこの研究で使用しました。動物は、経口Bとの 2日間、1日2回処理しました。 サブチリス BSB3株またはPBS。最後の処置後の翌日、各グループを分割し、2つの実験群（PBS及び枯草菌で処理したものと処理したもの）25分間、45°Cのに置きました。 2つの対照群は、室温で25分間滞在しました。全てのラットを安楽死させ、別のパラメータは、すべての群で分析しました。熱ストレスの悪影響が絨毛の高さと腸上皮における総粘膜の厚さの減少により登録されています。内腔からの細菌の転。赤血球および血液中のリポ多糖（LPS）レベルの上昇の小胞形成を増加させました。治療の予防効果は、事前によって評価されますこれらの副作用の発明。プロトコルは、熱ストレスの合併症の予防のための細菌とラットの経口治療のために設立されたが、このプロトコルは、他の投与経路のために、異なる化合物の分析のために修正して使用することができます。
Protocol
全ての実験手順は、オーバーン大学のIACUC、オーバーン、アラバマ州によって承認されました。
文化メディア、食器や細菌培養の作製
- 栄養寒天プレート上で一晩増殖させた枯草菌 BSB3文化の単一コロニー、フラスコに栄養培地の10ミリリットルを接種します。
- バクト栄養ブロス、8グラム1.2％（v）の硫酸マグネシウム4×7H 2 O、10ミリリットル/ワット;寒天、15;（v）の塩化カリウム、10ミリリットル/ wの10％：リットル当たり（19培地胞子形成の500ミリリットルを作りますg）を、20分間121°Cのオートクレーブ。 50°Cのに冷却し、以下の滅菌溶液を追加することを許可する：1 MのCa（NO 3）2、1ミリリットルを、 0.01 MのMnCl 2、1ミリリットル。 1 mMのは4、1ミリリットルをのFeSO。
- 室温で20分間40°Cのに準備された培地を冷却し、滅菌キャビネットに20の滅菌ペトリ皿のそれぞれに25ミリリットルを注ぎます。媒体は一晩固化してみましょう。
- Bの一晩培養物0.5ミリリットルを広めますacillusサブチリスBSB3ペトリ皿中の培地の表面上に。 90％の胞子形成するまで、5日間37°Cの時に文化をインキュベートします。高解像度の顕微鏡による位相明るい胞子を明らかにしました。
- プレートに無菌のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を1ml添加し、無菌細胞スプレッダーを用いて表面から細菌を掻き取ることによって収穫細菌。必要になるまで冷蔵庫にサスペンションを保管してください。
- 37 O℃で24時間- 18のためのインキュベーションに続いて胞子形成培地プレート上の細菌懸濁液の適切な希釈（10 -5〜10 -6）の0.1ミリリットルをメッキすることにより細菌の生存能力を確認
- コロニーカウンターを用いて、プレート上の細菌コロニーをカウントし、テストした懸濁液中の細菌の力価を計算します。最終濃度が1×10 8 CFU / PBS中のmlの細菌懸濁液を準備します。
2.動物
- 300グラム - 32オスのSprague-Dawleyラット（250を使用します）。標準のペレット餌と水に自由にアクセスできる特定の病原体を含まない条件下で動物を維持します。平均温度（21±1 O℃）、湿度（50±5％）と12時間の明暗サイクルを確立します。
3.実験計画
- 順化の2日後、強制経口投与11により、動物の治療を開始します。強制経口投与針で注射器を使用してください。 Bで16匹のラットを扱いますズブチリス BSB3懸濁液（ラット当たり1ミリリットル）2日間一日二回（ 枯草菌群 ）。 PBSで16匹のラットの治療（ラット当たり1ミリリットル）一日二回2日間（PBS群）（図1）。
- グループ1-コントロール（PBS /ストレス無し）、グループ2位B.：処理後、各グループ（グループ当たり8匹のラット）を細分化枯草菌 （ 枯草菌 /ストレスなし）、グループ、3-ストレス（PBS /熱ストレス）とグループの4- B.枯草菌 +ストレス（ 枯草菌 /熱ストレス）。
- ELECを使用して、各ラットの直腸温度を測定デジタル温度計をTRONIC。 25分間室温でグループ1と2のラットを保管してください。 25分間、45 O Cと相対湿度55％での人工気象室に入れグループ3と4の動物を。
- その後、電子デジタル体温計を使用して、すべてのグループ内の各ラットの直腸温度を測定します。 4時間室温ですべての動物を配置します。
- 密閉可能な麻酔ジャー中 - （4％2）とラットを深く（つま先のピンチへの応答の欠如）を麻酔されるまで観察イソフルランでラットを麻酔。ギロチンで迅速な断頭によりラットを安楽死させます。
- 血清を取得し、すぐに顕微鏡検査のためのピペットを用いて血液のサンプル（各ラットから7μl）を取るために非発熱性のチューブに非発熱性ピペットで- （16ミリリットル15）各ラット20からトランク血液を採取します。
- 凝固を可能にするために、少なくとも30分間、冷蔵庫で血液を試験管に入れてください。 20°Cの時の遠心分離管、7,000×gで10分間、迅速にピペットで血清を除去。一定分量の血清をアッセイまで-20 O Cで50μlのボリュームとストアに各ラットから得られました。
4.手術手順
- カット/電気ハサミでカーカスの下の腹部と胸部からすべての毛皮をトリミング。滅菌キャビネットにカーカスを配置し、70％アルコールでカーカスの毛を剃っ表面を処理。
- 腹部の正中切開を作成するために、滅菌メスを使用してください。滅菌ピンセットを用いて、各ラットから肝臓、腸間膜リンパ節、脾臓、および小腸を削除します。
細菌転移の5分析
- 予め秤量した滅菌チューブに肝臓、腸間膜リンパ節および脾臓の各サンプルを置き、重量を量ります。サンプルとチューブの重量と空のチューブの重量の差として試料の重量を計算します。
- 1:10希釈液を得るためにチューブに無菌PBSを加える（w / v）のサンプルとhomoge均一な懸濁液21を得るために、滅菌ガラス組織ホモジナイザーで各サンプルをnize。
- 滅菌PBSで各サンプルの連続希釈（10 -1〜10 -4）を作成します。プレートヘミン（0.005グラム/ L）とビタミンK1（0.01グラム/ L）プレートとマッコンキーの表面および5％血液寒天とブルセラ血液寒天上に各組織のすべての希釈の0.1ミリリットル。
- 37°Cの 22で嫌気性条件下マッコンキー、5％血液寒天プレート好気的およびブルセラ血液寒天プレートをインキュベートします。
- 24時間後に好気性細菌のコロニー、およびコロニーカウンターを用いて、インキュベーションの48時間後の嫌気性細菌のコロニーを数えます。組織のグラムでのコロニー形成単位（CFU）の数として結果を表しています。
6.組織学的解析
- （ - 4.2 4.1ステップ）、外科的処置によって、各ラットから小腸サンプルを削除します。ブアン固定液、パラフィン中に埋め込み、内のサンプルを修正しました。標準的な手順23を使用して、ヘマトキシリンおよびエオシンで6μmのセクションおよび染色切片を作製。
- 各サンプル（倍率100X）24で腸絨毛と総粘膜の厚さの高さを測定するための高解像度の顕微鏡システムを使用してください。各ラットからの4つのサンプルを分析し、各試料中の少なくとも20の測定を行います。マイクロメートルで結果を表現します。
7.サイトカインアッセイ
- IL-1βのための商業用ラットのELISAキットを使用します。 IL-6。 TNF-α;製造業者のプロトコールに従って血清中のサイトカインのレベルを測定するためのINF-γ、およびIL-10。
- 関連するキットの標準を使用してアッセイしたサンプルの各セットのための標準曲線を生成します。適切な標準曲線と実験データを比較することにより、各サンプル中のサイトカインのレベルを定義します。
8.リポ多糖アッセイ
- に従ってラットLPS ELISAキットを用いて血清中のLPSのレベルを分析製造業者のプロトコル。標準曲線の値で得られた値と比較することにより試料中のLPSの濃度を推定します。
血液の9高解像度光学顕微鏡
- 以前に25,26説明した顕微鏡システムを使用してください。ライブ画像を記録する顕微鏡システムの基本とビデオカメラとコンピュータ25として防振プラットフォームを使用します。以前に27を説明したようにリチャードソンのスライドを使用してテスト画像を調整します。
- スライドガラス、カバーガラス、写真上の各ラットから新たに採取した血液の7μLを置 き、各サンプル（倍率1,700X）で72×53.3ミクロン2の10の画像フレームを記録します。
- リアルタイムで高解像度の直視光学像を提供するソフトウェアを使用して、小胞の濃度を測定します。各実験条件28のための20の画像フレームの最小値を調べます。
10. STATISチック
- 平均と標準偏差としてすべての値を表現します。統計分析とグラフ描画を実行します。 2標本t検定を用いた結果を分析し、統計的有意性を定義するために0.05で有意水準を設定します。
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Representative Results
熱ストレス前後とすぐに動物の平均体温は、それぞれ36.7±0.07 O Cと40.3±0.17°Cの 、（P <0.05）でした。熱への暴露ラット（群3）は、絨毛の高さおよび全粘膜の厚さ（図2、図3）の有意な阻害をもたらしました。ストレス前BSB3株の経口投与は、熱の有害な影響から腸を保護しました。
腸からの細菌のトランスロケーションは、腸間膜リンパ節（MLN）、各ラットの肝臓および脾臓の細菌学的分析により決定しました。 1.7×10 3±4.6×10 2 CFU / g組織（図4）の濃度の細菌培養をPBSで前処理し、熱（グループ3）にさらさのみMLNから単離され、ラットの肝臓でした。対照ラット（グループ1、2）からと熱ストレスを受けた動物からの全ての試験されたサンプル滅菌したBSB3株（グループ4）を受けました。いいえ細菌は脾臓サンプルから単離されませんでした。
IL-1βの変更はありません。 IL-6、TNF-αは、INF-Γのサイトカインレベルは、熱ストレスを受けたラットに登録されました。 IL-10及びLPSレベルの熱暴露有意な上昇の前にPBSで処置した動物の血清中に見出された（グループ3） - （ 図5、図6）。 B.による前処理枯草菌 BSB3（グループ4）は、熱ストレスを受けた動物の血清中のIL-10及びLPSの上昇を防止しました。
（1.4±0.2）から無料で小胞の濃度の有意な増加は（3.8±0.3）に10 6×μlの10 6小胞-1（P <0.001）は、熱ストレスの前にPBSを受けたラットの血液中に見出された（図7を × 、8）。 BSB3で前処理した動物の群では無料の小胞の数に変化は後方に見られませんでしたER熱暴露（図7）。
図1.研究デザイン。ラットの二つのグループ（各グループの16匹のラット）Bと強制経口投与によって治療されましたズブチリス BSB3（ 枯草菌群 ）または一日二回PBS（PBS群）を持ちます。 3日目に、各グループは、各グループ内の8匹のラットによって細分されました。群3および4からのラットを25分間、45°Cのに置きました。対照動物（グループ1および2）を室温で維持した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ラットにおける図2腸絨毛の高さ（A）の測定と粘膜の厚さ（B）ラットをPBSで前処理または枯草菌 BSB3は45°Cの （ストレス）または室温（コントロール）に暴露しました。各群は、8匹のラットから成りました。各試料の各パラメータの二十の測定値を採取しました。値は、平均値と標準偏差として提示されています。結果は統計的有意性を定義するには有意水準0.05での2標本t検定を用いて分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ヘマトキシリン及びエオシンラットで腸粘膜染色の 図3. 組織学的画像は、PBSまたはBで前処理しましたサブチリス BSB3と45°Cの （ストレス）または室温（コントロール）にさらさA. PBS /ノーストレス; B. PBS /熱ストレス; C。B.枯草菌 /ノーストレス; D. B.サブチリス /熱ストレス。絨毛高さは、矢印で示されています。 200μmでバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ラットの組織中の細菌の 図4. 総数。ラットPBSまたはBで前処理サブチリス BSB3は、45°Cの （ストレス）または室温（コントロール）に暴露しました。各群は、8匹のラットから成りました。腸間膜リンパ節、肝臓、および脾臓を無菌的に、各ラットから取り出し均質化し、好気性および嫌気性細菌を回収するために、寒天培地上にプレーティングしました。転位細菌（好気性および嫌気性）の総数は、組織のグラムあたりのコロニー形成単位（CFU）として提示されます。値は以下のように提示されています平均値と標準偏差。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ラットの血清中のIL-10の 図5 レベルラット PBSまたはBで前処理サブチリス BSB3は、45°Cの （ストレス）または室温（コントロール）に暴露しました。各群は、8匹のラットから成りました。血清を各ラットから得られ、商業ラットELISAキットで分析しました。値は、平均値と標準偏差として提示されています。結果は統計的有意性を定義するには有意水準0.05での2標本t検定を用いて分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ラットの血清中の 図6 のLPS濃度ラット PBSまたはBで前処理サブチリス BSB3は、45°Cの （ストレス）または室温（コントロール）に暴露しました。各群は、8匹のラットから成りました。血清を各ラットから得られ、商業ラットELISAキットで分析しました。値は、平均値と標準偏差として提示されています。結果は統計的有意性を定義するには有意水準0.05での2標本t検定を用いて分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ラットの血液中の小胞の 図7. 数。ラット前処理されましたPBSまたはBとサブチリス BSB3は、45°Cの （ストレス）または室温（コントロール）に暴露しました。新たに採取した血液の小滴（7μl）を各サンプル（倍率1,700X）に10画像フレームを、スライドガラス上に載置されたカバーガラスを、撮影して記録しました。小胞の濃度をリアルタイムで高解像度の直視光学像を提供するソフトウェアを使用して測定しました。二十の画像フレームは、各実験条件について調べました。値は、平均値と標準偏差として提示されています。結果は統計的有意性を定義するには有意水準0.05での2標本t検定を用いて分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Veとの 図8. 増加熱ストレス後の血中sicles濃度。室温（A）または45°Cの （B）への曝露の前にPBSで前処理したラットの血液のビデオ画像。新たに採取した血液の小滴（7μl）を各サンプル（倍率1,700X）に10画像フレームを、スライドガラス上に載置されたカバーガラスを、撮影して記録しました。小胞はV.バー6ミクロンとして示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
深刻な健康状態29内の高温の結果への暴露。予防と熱ストレスに関連する合併症の早期発見は極めて重要30です。 提示されたプロトコルは、熱ストレスの有害作用の防止のための様々なアプローチの有効性を評価するために使用することができます。
このプロトコル内の重要なステップは次のとおり熱処理手順（45°Cの 、25分）。エンテロトキシンによる汚染を防止するために、血液の収集および処理の間に非発熱性の材料の使用。凍結融解の繰り返しを避けるために、-20 O Cに血清のアリコートを保持します。および細菌転移の解析中に、滅菌手順を以下に示します。プロトコルは、熱ストレスの副作用の防止のための細菌とラットの経口治療のために設立されました。投与および他の化合物の他の経路については、このプロトコルを修正することができます。 TRの例について、時間熱ストレス前eatmentを延ばすことができます。経口投与、直腸投与に変更することができる。 枯草菌は、高温への曝露の前に、動物の経口治療による熱応力合併症の予防のために使用しました。熱応力の合併症を治療するために、このプロトコルは、熱への暴露後の動物の治療のための細菌の使用によって、改変することができます。
これは、体温の上昇は、赤血球の小胞の増加したことが示され、これは完全にB.で前処理することによって防止されましたサブチリス菌 。したがって、熱への暴露時に、血液中の小胞の濃度の増加は、熱ストレスのレベルを示し、赤血球の安定性や熱に対する耐性の診断の証拠を提供してもよいです。また、熱ストレス合併症に対する予防治療の有効性評価のために非常に有用かつ迅速なテストです。誘導O熱ストレスのマーカーとしてのFの熱ショックタンパク質は、先30を議論したが、この方法は時間がかかり、ストレスを加熱するために応答をリアルタイムで診断するために使用することができません。
熱ストレスの悪影響の防止のための提示のアプローチは単純で、費用効果的であり、追加の機器や特別な設備を必要としません。この作品の今後のアプリケーションは、熱ストレスの合併症に対する保護のメカニズムを理解し、この保護のための新しい手順を特徴づけるのに役立ちます。激しい屋外身体活動29中に熱中症のリスクがある人のグループ-このメソッドは、道路の労働者、軍人、アスリートのために重要です。提案されたアプローチは1つが熱ストレスのレベルを調べるために、極端な条件で働く人々の健康を守るために様々な方法を評価することができます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA | 64-17-5 | |
| Agar | VWR | 97064-334 | |
| MacConkey agar plates | VWR | 470180-742 | |
| 5% blood agar plates | VWR | 89405-024 | |
| Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K | VWR | 89405-032 | |
| Bouin’s Fixative | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 15990 | |
| IL-10 Rat ELISA kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0101 | |
| IL-1beta Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0011 | |
| IL-6 Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0061 | |
| INF-gamma Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC4021 | |
| TNF-alpha Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC3011 | |
| Rat LPS ELISA Kit | NeoBioLab, MA, USA | RL0275 | |
| Environmental Chamber 6020-1 | Caron, Marietta, OH, USA | 6020-1 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Optima L-90K | |
| Ultra Centrifuge | |||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| Colony counter | Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA | RE-3325 | |
| Freezer | Haier, Brooklyn, NY, USA | HCMO50LA | |
| Ultra microplate reader | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx 808 | |
| Auto Strip Washer | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx50 | |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA | Classic C24 | |
| Rocking Shaker | Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA | 55 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, Sanford, ME, USA | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, Corning, NY, USA | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer Genesys 20 | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA. | 4001 | |
| Sony DXC-33 Video camera | Sony | ||
| Richardson test slide | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA | 80303 | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Image-Pro Plus software | Media Cybernetics, MD, USA | ||
| Triple Beam Balance | OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA | ||
| Tissue Homogenizer, Dounce | VWR | 71000-518 |
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