Introduction
Prostatacancer är den näst vanligaste orsaken till dödsfall i cancer (9%) bland män i USA, bredvid cancer i lunga och luftrör (28%) 1. Enligt de senaste uppgifterna, uppskattas det att 220, 800 nydiagnostiserade fall av prostatacancer och 27, 540 dödsfall kommer att ske i 2015 en. Den femåriga relativa överlevnaden av tidigt stadium prostatacancer är> 99%, medan den för avancerad metastaserad sjukdom är endast 28% 1. En stor utmaning för behandling av framskriden metastatisk sjukdom är bristen på förståelse av molekylära mekanismer som ligger bakom benägenheten hos denna sjukdom att metastasera till andra organ, i synnerhet till benet, vilket är en frekvent plats för prostatacancer. Därför finns det ett klart behov av att studera den molekylära makeup av dessa prostatatumörer i syfte att utveckla effektiva terapeutiska kurer mot progression till avancerad metastaserad sjukdom 2,3.
Prostatatumörer uppvisar HIGh biologiska heterogenitet utan en väldefinierad vägen till progression. Metastaser förekommer ofta utan tidigare tecken på tumörinvasions 4. Denna kliniska heterogenitet tillskrivs den molekylära mångfalden av prostatacancer. Att förstå den molekylära makeup av dessa dödliga tumörer är nyckeln att utforma bättre diagnostiska och terapeutiska strategier för denna sjukdom. Följaktligen prostatacancerforskning för närvarande inriktad på att förstå och förebygga metastaser.
Prekliniska in vivo-musmodeller erbjuder en mängd olika alternativ för att förstå de molekylära mekanismerna för prostatacancer progression till avancerad metastaserad sjukdom. Dessutom är dessa modeller är viktiga för prekliniska utvärderingar av nya terapeutiska strategier mot denna sjukdom. De vanligaste djurmodeller inkluderar transgena musmodeller, svans-ven injektion, intra-hjärt implantation och orthotopic modeller humana mus. Transgena studier är tids consuming och korrelation av prostatacancer utveckling i möss med den för människor har visat variationer 11. I spontana metastaser musmodeller celler injiceras direkt in i cirkulationen och även om de har en snabb handläggningstid, kan de inte användas för att studera den primära tumören eller de första stegen i metastaserande kaskad 5. Orthotopic xenograft-modeller har begränsningen att utveckla ben metastaser, den gemensamma platsen för prostatacancer metastaser. Ändå är väl karakteriserade och används i stor utsträckning för att studera de molekylära händelserna i primärtumörutveckling, överhörning mellan tumör och organ mikro, inledande fasen av metastatisk sjukdom och användning av experimentella läkemedel för terapeutisk intervention 6 människans orthotopic prostatacancer xenograft musmodell , 7,8-11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoll för alla som deltar i djurförsök måste granskas och godkännas av en Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). Följ officiellt godkända förfaranden för vård och användning av försöksdjur. Intra-prostata injektionen öppen bukkirurgi och djur ska hållas i en patogen miljö med en utsedd kirurgi rum där riktiga kirurgiska aseptisk teknik används under hela proceduren.
1. Framställning av celler för implantation
OBS: Baserat på forskning behov kan vilken prostatacancer cellinje användas. Cellinjer odlas enligt leverantörens instruktioner.
- För PC3M-Luc-C6-cellinje som stabilt uttrycker luciferasgenen från eldfluga, kulturceller i Minimum Essential Medium (MEM) supplementerat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1x Non-essentiella aminosyror, 1 x fleomycin D1 och 1 mM natriumpyruvat . Upprätthålla celler i en inkubator wed en fuktad atmosfär av 95% luft och 5% CO2 vid 37 ° C. PC3M-Luc-C6-celler anskaffas från UCSF kärnanläggningen.
- Harvest cellerna genom trypsinisering. Tvätta odlingsplattor en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 2 ml 0,05% trypsin till en 10 cm skål och inkubera i 3 till 5 minuter i en inkubator med en fuktad atmosfär av 95% luft och 5% CO2 vid 37 ° C tills cellerna är fristående.
- För att undvika klumpning, inte agitera cellerna genom att slå eller skakning av skålen i väntan på celler att lösgöra. Samla upp cellerna i 5 ml komplett medium och centrifugera ner under 5 minuter vid 200 x g. Tvätta cellpelleten med PBS för att avlägsna trypsin.
- Räkna levande celler genom exklusion med trypanblått. Blanda 10 | il av cellsuspensionen i PBS med 10 | il av 0,4% (vikt / volym) trypanblå lösning. Fyll blandningen i en hemocytometer eller räknekammare bild och räkna celler omedelbart under ett mikroskop eller läsa kammaren bilden i en cell panter.
- Bereda en cellsuspension innehållande 2,5 x 10 5 celler i 10 | il media. Blanda cellsuspensionen med 10 | j, l basalmembranliknande extracellulär matrisextrakt och placera cellerna på is. Lägg luciferin till cellsuspensionen (1: 200 pl; lager 30 mg / ml koncentration) före injektion i möss.
OBS: Detta möjliggör omedelbar biologisk avbildning av djur för att kontrollera samstämmigheten cellinjektioner mellan olika experimentella grupper. Injicera celler så fort som möjligt, helst inom 30 minuter efter trypsinisering sedan cellviabiliteten minskar snabbt efter avskildhet.
- Bereda en cellsuspension innehållande 2,5 x 10 5 celler i 10 | il media. Blanda cellsuspensionen med 10 | j, l basalmembranliknande extracellulär matrisextrakt och placera cellerna på is. Lägg luciferin till cellsuspensionen (1: 200 pl; lager 30 mg / ml koncentration) före injektion i möss.
2. Framställning av operationsområdet
- Operera i en stilren, desinficeras område som främjar aseptik.
- Desinficera disk / lab bänk med blekmedel lösning innan operationen.
OBS: Användning av alkohol är avskräckt på grund av lång kontakttid som krävs för att få verkan (15 min). - Använd sterila draperier,rengöra absorberbara kuddar eller handdukar, och ersätta dessa material efter varje kirurgiskt session. Sterilisera alla instrument före användning. Föredragna metoder är en ångautoklav, glaspärla autoklav, etylenoxidgas eller vätesuperoxidånga sterilisering.
- Använd en aseptiskt rengöras dissekera mikroskop för att utföra det kirurgiska ingreppet eller erfarna forskare kan utföra det utan ett mikroskop.
3. Implantation av tumörceller
- Använd hane 6-8 veckor gamla immunförsvar Balb / c eller NOD / SCID-möss.
OBS: Det är svårare att arbeta på mindre djur och större djur tenderar att ha långsammare kinetik för tumörtillväxt och metastas. - Injicera innan operation smärtstillande i enlighet med djur anläggningens instruktioner. Till exempel, kan intra-peritoneal Buprenorfin vid en dos av 0,1 mg / kg kroppsvikt användas.
- Söva djuren genom att placera dem i en isofluran kammare med 1-3% isofluran i syre och wadet tills djuren helt bedövad. Se till att det inte finns någon tå reflex av muskeltonus vid denna tidpunkt. Använd rätt veterinär oftalmologiska salva smörjmedel för att förhindra blindhet på grund av xeroftalmi under narkos.
OBS: Bedöva djuren genom utredarens föredragna metoden t.ex. för pentobarbitalnatrium, är 0,05 mg per gram kroppsvikt administreras intra-peritoneal eller ketamin / xylazin lösning (koncentration: 17,16 mg / ml) vid en dos av 65 mg / kg kroppsvikt används subkutant. Isofluran inandning är en föredragen metod för bedövning. Den ögonsalva ska försiktigt tillämpas utan att gnugga mot hornhinnan. - Ta bort djuret från isofluran kammare och placera i en noskon apparat med kontinuerligt flöde av 1-2% isofluran i syre för att säkerställa att djuret är under full narkos innan du fortsätter.
- Ta bort hår från möss genom rakning eller använda ett hår borttagning grädde innan proceduren.
OBS: Det skulle vara föredraget att placera musen på en steril värmedyna under operation.
- Ta bort hår från möss genom rakning eller använda ett hår borttagning grädde innan proceduren.
- Placera musen i ryggläge. Rengöra den nedre buken med 10% vikt / vikt povidon-jod-lösning följt av 70% etanol kompresser.
- Med ett par fina pincett, lyfta ett hudområde 2 mm ovanför preputialkörteln, ca 1-2 cm ovanför penis slida och ca 2-3 cm under botten av bröstkorgen.
- Göra ett mittlinjesnitt 1cm i längd, först genom huden med en skalpell och sedan genom muskelskiktet med en sax (Figur 1).
- Lokalisera blåsan i kroppshåligheten. Det är en gul-ljusbrun sfäriska organ, som ligger direkt under snittet (Figur 1).
- Med ett par av fina pincett grepp blåsan och lyft uppåt sedan nedåt ut ur kroppskaviteten mot penis slida. Detta kommer att utsätta de båda sädesblåsorna som är ett par vita saclike organ och tydligt åtskilda.
- Med enbomullspinne i varje hand, YTTRE sädesblåsorna, en efter en, och dra dem ut ur kroppshåligheten och lägg dem med framsidan nedåt på den yttre ytan av buken med blåsan i mitten (figur 2).
- Med användning av de bomullspinnar, försiktigt luta tillbaka sädesblåsorna vid punkten för införing i närheten blåshalsen, i riktning mot penis manteln, så att de två dorsala prostata lober är tydligt synliga. Använd våta bomullspinnar för att undvika vävnadsskada (Figur 3).
- Skaka cellsuspensionen med en mikropipett innan du lägger i sprutan.
- Medan placera sädesblåsorna på plats med en bomullspinne, för in injektionsnålen i rygg prostata lob i mikroskop (Figur 4). Injicera långsamt 20 pl cellsuspension tills en bulla bildning identifieras. En utbuktande bulla indikerar att injektionen är korrekt.
- Medan tillbakadragning av nålen genom att trycka lätt på injektionsstället meden bomullstuss och hålla i några sekunder för att förhindra läckage.
- Lyft försiktigt sädesblåsorna med bomullspinnar och sätta dem tillbaka in i kroppen hålighet en av en följd av urinblåsan. Undvika "snurrande" de inre organen när de utför denna procedur.
- Efter att ha placerat organen tillbaka in i kroppshåligheten, suturera muskellagret först i ett avbrutet mönster med absorber 4-0 krom catgut suturer följt av huden stängning med icke absorber 4-0 nylon kirurgisk sutur. Huden kan också dras ihop och stängs med kirurgiska klämmor för att stänga snittet helt.
OBS: Möss har en vana att skrapa och bita på deras sår, vilket kan leda till återöppnande av såret, därmed användning av vävnadslim rekommenderas också tillsammans med suturer. Bild djur omedelbart för att säkerställa att det är lika självlysande intensitet bland alla försöksgrupper. - Återgå djuren att rengöra burar och hålla dem under en värmande lampa eller värmeing pad. Övervaka djur hela tiden tills de är helt återhämta sig från anestesi och upprätthålla sternala VILA.
4. Övervakning av djur
- Övervaka djuren regelbundet fram till slutet av försöket, enligt institutionella protokoll. Om du använder kirurgiska metallklämmor, ta bort efter en till två veckor. Varaktighet av experimentet beror på den specifika forsknings behov.
OBS: Detta experiment utfördes under 21 dagar för att undersöka den framgångsrika etableringen av de implanterade cancerceller i mus prostata. - Administrera smärtstillande baserat på djur anläggningens instruktioner. Till exempel kan intraperitoneal Buprenorfin vid en dos av 0,1 mg / kg kroppsvikt användas vid tidpunkten för förfarandet med en andra dos efter 6 h och ytterligare doser varje 8-12 timmar vid behov.
- Övervaka djurvikt, livsmedelskonsumtion, hudfärg och struktur, aktivitet och frekvensen av urinering och avföring. Avliva djuren Immediately om det finns en betydande förlust av kroppsvikt är större än 15%.
- För dödshjälp, leverera CO2 från en trycktank till en FN-trångt bur med en flödeshastighet för att förskjuta 10-30% av volymen / minut kammare eller bur, så att CO2 att komma in i kammaren långsamt så att medvetslöshet och fullständig NARKOTISERING inträffa före döden.
- Bibehålla CO2 flöde i minst en minut efter andningsstillestånd och lämna djur i kammaren under en tillräcklig tid så att döden inträffar före utförande av en fysikalisk metod.
- Utföra halshuggning, halsdislokation eller någon annan IACUC godkänd fysisk metod efter euthanizing djuren kemiskt.
OBS: Betydligt minskad kroppsvikt indikerar ofta en slö tillstånd. Tumörbärande djur bör vara vid god hälsa med undantag för förekomst av tumörer fram till slutet av experimentet. Dödshjälp bör vara förenliga med de AVMA riktlinjer för eutanasi och måste vara listed i den godkända IACUC protokollet.
5. Icke-invasiv Bio-avbildning av djur
- Övervaka djur per vecka med hjälp av en icke-invasiv avbildningsteknik för att spåra koloniseringen av cancerceller, tumörtillväxt och någon fjärrmetastaser.
OBS: avbildningsmetoder såsom GFP-imaging, luciferas bildbehandling, röntgen eller 3D mikro datortomografi (UCT) etc. kan användas baserat på den specifika forskning behöver 12-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter orthotopic implantation av PC3M-Luc-C6-celler i den bakre prostata lob mössen veckovis avbildas med hjälp av ett levande djur mareld imaging system för att övervaka kolonisering av celler och tumörtillväxt under loppet av experimentet (figur 5A - B). Kvantifiering av självlysande signalen indikerade att PC3M-Luc-C6-celler koloniserade framgångsrikt prostata lober. Ökad bioluminiscens är ett tecken på ökad primärtumörtillväxt under loppet av experimentet (figur 5B). Baserat på forskning mål, kan möss övervakas veckovis icke-invasivt genom röntgen, fluorescens eller luminiscens avbildning för att övervaka tumörtillväxt och eventuella avlägsna metastaser. Andra parametrar som kan uppnås med denna modell är: förändringar i kroppsvikt och livsmedelskonsumtion under loppet av experimentet; effekten av läkemedelsbehandling på tumörstorlek och vikt; kvantifieringav tumörstorlek och vikt vid slutet av experimentet; extraktion av DNA / RNA / protein för att bestämma molekylära förändringar som sker inuti den primära tumören efter avslutandet av experimentet.
Figur 1:. Buken mittlinjen snitt för intra-prostata implantation av tumörceller i buken mittlinjen snitt är cirka 1-2 cm lång. Urinblåsan är direkt under snittet. Gentle trycka på båda sidor av snittet hjälper till att skjuta urinblåsan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Arrangemang av sädesblåsor itra-prostata implantering av tumörceller. sädesblåsor är vita säckliknande organ och är placerade i direkt anslutning till urinblåsan. Sädesblåsor är exteriorized med tops och från vänster och höger med blåsan i centrum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Dorsum av prostata Vid punkten för införande, försiktigt luta tillbaka sädesblåsorna mot penis manteln så att de två dorsala prostata lober är tydligt synliga. Använd våta bomullspinnar för att undvika vävnadsskada. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:.. Intra-prostata implantation av tumörceller Tumörceller injiceras i rygg lob prostata Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. In vivo mareld avbildning av intra-prostata implantation modell (A) In vivo mareld bilder av möss över den experimentella tidsförloppet efter luciferas märkt PC3M-Luc-C6-celler implanterades i ryggprostata lob nakna möss. (B) Kvantifiering av mareld signalen visar att PC3M-Luc-C6-celler framgångsrikt koloniserade prostatakörteln med increased orthotopic tumörtillväxt under loppet av experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver ett detaljerat förfarande för att upprätta en human orthotopic prostatacancer xenograft musmodell. Denna modell fastställdes genom direkt implantation av human prostatacancer cellinje PC3M-Luc-C6 in i de dorsala prostata lober immunförsvagade möss. Tumörer fick utvecklas under loppet av experimentet. Tumörtillväxt övervakades varje vecka genom ett icke-invasivt bioluminescens avbildningssystem under experimentet.
Den viktigaste faktorn i upprättandet xenografttumörmodeller är att uppnå en enhetlig tillämpning i implantering av tumörceller. För att erhålla statistiskt signifikanta resultat bör varje experimentgrupp innehåller 5-10 möss och tumörstorleksvariation bör inte överstiga mer än 10% av medeltumörstorlek. För att uppnå detta mål, vissa kritiska steg i protokollet är viktiga, till exempel: i) att utföra kirurgi i området som främjar aseptik under operation; ii) Cellerna skall vara transplanted så snart som möjligt efter lösgörande från odling; iii) injektionsvolym bör vara konsekvent; iv) försiktig lyftning av inre organ i och ut ur kroppen hålighet under implantation av celler; v) alla djur ska injiceras med samma teknik och av en utredare, vi) djur bör slumpmässigt i experimentella grupper efter tumörcell implantation.
Vissa problem som kan uppstå är: i) tumör inte utvecklas alls eller tumörnoduli utvecklas i tarmkäxet eller kroppskaviteten; ii) ojämn tumörstorlek observeras bland samma experimentgrupp; iii) kan det vara hög kirurgi relaterad dödlighet. Dessa problem kan övervinnas genom att enkla åtgärder såsom: i) testa cellodlings för kontaminering med mykoplasma etc.; ii) förhindrande av läckage av tumörcellsuspension i tarmkäxet och bukhålan under injektion; iii) omröring av cellsuspensionen före varje spruta lastning; iv) korrekt anestesi dosen bör vara followed och värmedynor bör användas för att upprätthålla kroppstemperaturen under förfarandet.
En stor mängd data kan samlas utnyttja denna modell beroende på en viss forsknings mål inklusive mus vikt, matkonsumtion, tumörstorlek och vikt, genetiska och molekylära förändringar i tumörceller som bidrar till tumörtillväxt samt regional lymfkörtel metastas 10 , 16. Hoffman och hans grupp utvecklade tekniken med kirurgisk orthotopic implantation (SOI) och har i stor utsträckning använt denna teknik för att transplantera histologiskt intakt fragment av större typer av humana cancerformer, inklusive prostata, urinblåsa och njure cancer i gnagare 17. Dessa orthotopic modeller har fördel gentemot de transgena eller subkutana musmodeller som de representerar exakt den kliniska cancer 18,19. Dessa modeller användes också för att transplantera tumörer tagna direkt från patienterna till motsvarande organ i immunbrist rednts. Orthotopic modeller är också väl lämpade för att undersöka effekterna av läkemedelsbehandlingen på tumörväxt och lymfkörtel metastas 10. De är också användbara för att undersöka effekterna av förändrade genuttryck ex vivo, och bestämma dess effekt på tumör förekomsten samt inom prostatatillväxt och metastas 20. Det är dock en begränsning av orthotopic prostatacancer modell att inga sådana modeller har rapporterats leda till spontan metastas till benet som är den vanligaste platsen för prostatacancer metastaser 12.
Underlåtenhet att uppnå skelettmetastaser kan bero på möss dör av urinvägsobstruktion före något ben metastaser kan utvecklas, eller på grund av att mikro av musen inte rekapitulera den mänskliga mikro och därmed inte utveckla benmetastaser 12. Ändå gör denna modell rekapitulera de tidiga händelserna i metastaserande kaskad före emboli och inträde av tumörcellerin i cirkulationen och därför är ett värdefullt verktyg för att studera den primära tumören tidigt process av metastaserande omvandling och för prekliniska utvärderingar av nya terapeutiska strategier 10,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PC3 prostate cancer cell line | ATCC | CRL-1435 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | GIBCO,Life Technology | 11095-080 | |
| PBS | GIBCO,Life Technology | 10010-023 | |
| FBS | GIBCO,Life Technology | 10437-028 | |
| Zeocin | Invitrogen,Life Technology | R250-01 | |
| Trypsin | GIBCO,Life Technology | 25300-54 | |
| IVIS | Xenogen-Caliper | ||
| Insulin Syringes (300 µl, 28.5 g) | Becton Dickinson | 309300 | |
| Mice | Charles River Laboratories, Inc | ||
| Alcohol Swabs | MEDEquip Depot | 326895 BD | |
| PVP Iodine Prep Pad | MEDEquip Depot | C12400PDI | |
| Surgical CatGut Chromic Suture | Demetech | CC224017F0P | |
| Matrigel | Corning | 354248 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Andrieu, C., et al. Heat shock protein 27 confers resistance to androgen ablation and chemotherapy in prostate cancer cells through eIF4E. Oncogene. 29 (13), 1883-1896 (2010).
- Fusi, A., et al. Treatment options in hormone-refractory metastatic prostate carcinoma. Tumori. 90 (6), 535-546 (2004).
- Hughes, C., Murphy, A., Martin, C., Sheils, O., O'Leary, J.
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. J Vis Exp. (79), e50873 (2013).
- Pettaway, C. A., et al. Selection of highly metastatic variants of different human prostatic carcinomas using orthotopic implantation in nude mice. Clin Cancer Res. 2 (9), 1627-1636 (1996).
- Rembrink, K., Romijn, J. C., van der Kwast, T. H., Rubben, H., Schroder, F. H. Orthotopic implantation of human prostate cancer cell lines: a clinically relevant animal model for metastatic prostate cancer. Prostate. 31 (3), 168-174 (1997).
- Kim, S. J., et al. Blockade of epidermal growth factor receptor signaling in tumor cells and tumor-associated endothelial cells for therapy of androgen-independent human prostate cancer growing in the bone of nude mice. Clin Cancer Res. 9 (3), 1200-1210 (2003).
- Kim, S. J., et al. Targeting platelet-derived growth factor receptor on endothelial cells of multidrug-resistant prostate cancer. J Natl Cancer Inst. 98 (11), 783-793 (2006).
- Park, S. I., et al. Targeting SRC family kinases inhibits growth and lymph node metastases of prostate cancer in an orthotopic nude mouse model. Cancer Res. 68 (9), 3323-3333 (2008).
- Zhang, J., et al. AFAP-110 is overexpressed in prostate cancer and contributes to tumorigenic growth by regulating focal contacts. J Clin Invest. 117 (10), 2962-2973 (2007).
- Park, S. I., Kim, S. J., McCauley, L. K., Gallick, G. E. Pre-clinical mouse models of human prostate cancer and their utility in drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 14, Unit 14.15 (2010).
- Johnson, L. C., et al. Longitudinal live animal micro-CT allows for quantitative analysis of tumor-induced bone destruction. Bone. 48 (1), 141-151 (2011).
- Steinbauer, M., et al. GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin Exp Metastasis. 20 (2), 135-141 (2003).
- Yang, M., et al. A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59 (4), 781-786 (1999).
- Stephenson, R. A., et al. Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice. J Natl Cancer Inst. 84 (12), 951-957 (1992).
- Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest New Drugs. 17 (4), 343-359 (1999).
- Wang, X., An, Z., Geller, J., Hoffman, R. M. High-malignancy orthotopic nude mouse model of human prostate cancer LNCaP. Prostate. 39 (3), 182-186 (1999).
- An, Z., Wang, X., Geller, J., Moossa, A. R., Hoffman, R. M. Surgical orthotopic implantation allows high lung and lymph node metastatic expression of human prostate carcinoma cell line PC-3 in nude mice. Prostate. 34 (3), 169-174 (1998).
- Kim, S. J., et al. Reduced c-Met expression by an adenovirus expressing a c-Met ribozyme inhibits tumorigenic growth and lymph node metastases of PC3-LN4 prostate tumor cells in an orthotopic nude mouse model. Clin Cancer Res. 9 (14), 5161-5170 (2003).
