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Biology

生存时间的测量 Published: July 22, 2016 doi: 10.3791/54126
Automatic Translation
1,4, 2, 3, 3, 1
1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

Introduction

轮虫是微观世界性浮游动物（<1毫米）构成门轮虫1。它们具有约1,000的体细胞，以及一个特性轮状睫状装置构成的简单的身体计划称为电晕，其用于运动和进纸。大多数轮虫属于类Monogononta或玄武湖的轮虫，其中包含约1600和500种，分别为2。 Monogonont轮虫一般同时具有有性和无性繁殖阶段（周期性孤雌生殖），而蛭形轮虫繁殖通过强制性孤雌生殖3。因此，有可能获得基因完全相同轮虫个人，从而确保在实验高再现性。此外，它们具有其它几个优点模式生物，如短寿命，易于培养，基因组和转录组序列数据4-7的可用性，以及独特的系统位置远离一rthropods和线虫8。因此轮虫是有希望在生态毒理学无脊椎动物模型和老化研究9-12。

下暴露于环境压力或化学品的生存时间是在这些研究领域一个13-19经常测量参数。但是，衡量轮虫的存活时间的时候，因为很容易受到他们的母亲的环境条件是需要谨慎。也就是说，在monogonont 臂尾轮虫manjavacas，雌性后代从母亲年龄比那些年轻的妈妈寿命较短;然而，产妇热量限制（CR），部分抵消了先进的孕产妇20岁的有害影响。在B.轮虫 ，母亲CR提供后代长寿，饥饿状态下存活时间长，并与抗氧化酶21,22表达增强相关的高氧化应激性。产妇年龄效应也已在蛭形轮虫23观察到。因此，实验轮虫的条件应仔细的存活时间测量同步前几代。

在这里，我们提供了以下几代的培养条件同步的轮虫臂存活时间测量的协议。间歇禁食（IF），其中轮虫周期性馈送CR的变化，施加于揭示的同步的效果由于中频对长寿22,24众所周知的效果。

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Protocol

1.媒体的制备

注意：使用盐度16.5个百分点（PSU）的一半稀释Brujewicz人造海水。其他人工海水也经常用于培养轮虫臂 25,26。

  1. 加454毫摩尔NaCl，26毫的MgCl 2，27毫硫酸镁 ，10毫米氯化钾和10mM的CaCl 2到4.5升蒸馏水（最终体积为5升）。另外，使用去离子水稀释代替蒸馏水。溶解所有其他盐后添加氯化钙 。
  2. 准备0.48中号碳酸氢钠原液（200倍浓度）。将25ml添加到上述溶液中。的NaHCO 3的最终浓度为2.4毫摩尔。
  3. 制备0.4M的溴化钠储备液（500X浓度）。加入10ml其添加到上述溶液中。溴化钠的最终浓度为0.8毫摩尔。补至5升蒸馏水。
  4. 过滤用0.45μm的膜过滤器的溶液。在使用前用无菌水两次稀释（V / V）。
    注意：可以使Brujewicz人工海水的2倍浓度作为原液。

2.一般培养条件

  1. 培养实验室饲养或在20和30℃之间的无菌100毫升烧杯野生捕获轮虫。较高的温度导致寿命较短，加速繁殖。使用25℃下的实验的方便性。轮虫密度或人工海水量是不是在这里一个大问题。
  2. 文化饮食微藻在人工海水中11。见斯内尔等人 （2014年）的详细信息11。通常情况下，使用四爿tetrathele（〜2×10 5个细胞/ ml 27,28），T。 suecica（〜6×10 5个细胞/ ml 25,29），和微绿球藻 （〜7×10 6个细胞/ ml 30,31），由于饮食藻（种类，培养康迪特离子，生化成分）显著影响轮虫臂尾轮虫的存活时间，用同一地段微藻各实验组。
  3. 喂养偶尔改变介质（ 如 ，喂，每2天，每周接种）保持在分批培养轮虫的股票群体。许多新生儿和成人轴承鸡蛋2-3个可以在轮虫是在最佳条件下进行观察。
    注：另一种方式来获得实验轮虫是孵化休眠卵。从休眠卵孵出轮虫被认为是很好地同步，并且他们的寿命是不从来自amictic鸡蛋11孵出轮虫显著不同。然而，从休眠卵轮虫早于从amictic鸡蛋开始再现。因此，需要对它们的繁殖性状测量慎用。

3.同步轮虫通过预培养

  1. 选择从ST单轮虫玉珠人口和培养在2.1-2.3如上所述建立一个亚群将被用于实验。通常培养两周。
  2. 收集来自亚群蛋承载轮虫（收集将用于实验的个体的双号）。培养它们作为一个单一的队列（密度：〜50个/毫升），在新鲜的介质下自由采食在2.1-2.3中描述的6孔培养板中。控制人口密度是重要的，因为条件培养基影响轮虫臂 32,33的生殖生理。
  3. 转移从成人的第一个卵孵化到新制备培养基新生儿。重复此过程在2-3代。
  4. 使用用于测量生存时间的特定时间段（ 例如 ，<3小时）内画影线的新生儿。为了避免可能偏向于选择单一的个体，虽然很不可能的，用几个不知疲倦重复性检查侧亚群。
    注：由于轮虫繁殖通常只无性这种情况下，确保无男性是整个实验过程中存在。男性比新生儿小，典型的移动比女性更快。混交雌体具有amictic女性在一定条件下29种不同的寿命。

4.生存时间的测量

  1. 在塑料板代替新生儿（通常24或48孔板，每孔含有1ml人工海水）。
  2. 在24小时的时间间隔，如果在较高的温度（30℃以上）传送轮虫到新制备的培养基，或在12小时的时间间隔。记录的后代的数量和每一个人无论是死是活。记录轮虫死时电晕的纤毛运动完全停止。
    注意：轮虫经常附着到孔的侧壁。水的轻柔吹打有助于找到他们。如果轮虫找不到或ArË小心被移液破坏，记录他们为“封杀”，而不是“死”。
  3. 新生儿取出实验时，轮虫正在积极重现。新生儿快速增长，这是有时很难从实验轮虫区分。

5.数据分析

  1. 创建Kaplan-Meier生存曲线（ 图1和2）通过在Y轴和时间在X轴上标绘的累积存活率。这是存活数据的最常见的代表。使用的存活时间34统计比较的非参数数秩检验（也称为曼特尔-考克斯测试）。对数秩检验也被包括在其他标准统计软件包如JMP和R.
    注：请不要使用学生t检验或后面的参数多重比较方差分析的分析，因为正态分布通常不是由生存数据35满足。此外，这些方法具DS不采取截尾的个人考虑。如果没有删数据曼 - 惠特尼U检验都可以使用。

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Representative Results


图1显示了同步较差人群（出两个重复的）的代表生存曲线。在这个实验中，轮虫要么美联储日常[ 自由采食 （AL）组]或隔日（IF组）。中位生存期在美联和IF组13和18日，分别。虽然这是众所周知的，如果延伸轮虫的寿命，本实验未能检测到的AL和IF组的寿命之间存在统计学显著差异。根据经验，在早期死亡率和生存率下降逐渐同步不足的结果在这个实验中观察到。损害所引起的不恰当的治疗或低水质为亚群轮虫趋于产生类似的结果。

当轮虫条件是最优的，以及同步的，早期死亡率几乎观察accordin甘氨酸轮虫往往在实验（ 图2）的后期阶段以同步的方式死去。中位生存期在美联和IF组13和20天，分别。虽然较少动物比图1中的实验中所用，在这些组之间寿命的差异有统计学显著。这是从先前已22发表超过五个实验的代表性结果。

图1
图 1： 为进行间歇禁食（IF）不佳同步个人Kaplan-Meier曲线的AL组随意喂食整个实验，而中频组每隔一天喂食。 N = 11和N = 12为AL和IF组，分别为（N​​为在实验中使用的个人号码）。该实验perforMED在25℃。当数秩检验用于（P = 0.1207）检测人的寿命没有显著差异。然而，该数据难以解释，因为数秩检验，不应用来比较两个交叉存活曲线虽然测试已知是健壮36。没有建立的方法目前可用于穿越生存曲线截尾数据， 请点击这里查看该图的放大版本。

图2
图 2： 对经受中频同步个人Kaplan-Meier曲线的轮虫队列，通过预先培养获得的，进行相同的中频时间表（馈送隔日）。 N = 6和N = 8为AL和中频组，分别。该实验在25℃下进行。对数秩和检验，P = 0.0057。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

目前的协议描述了测量在臂轮虫的存活时间的方法。关键的步骤是轮虫条件几代同步。当实验轮虫以及同步的，一个典型的I型的生存曲线是用很少的早期死亡率观察到几个以前的研究报告18,24,37,38。相比较差同步轮虫的存活时间的标准偏差因此变得更小，从而导致高的统计力量。同步也有望增加存活时间测量的再现 - 因为母亲在最佳条件下培养时，当前协议抵消母体世代的可能的有害作用。如果早期死亡率经过仔细同步仍在观察，考虑用新制备培养基，另外很多喂养藻类，或新成立的实验人群（ 即从协议3.1开始）。

此协议的一个限制是该井同步轮虫是潜在过分敏感。例如，在该延长寿命的化学品的筛选，通过该协议筛选一些化学物质可能无法检测到不良同步轮虫寿命显著影响（ 例如 ，从野生和批量养殖群体的个人）。因此，这样的实验的结果，应谨慎解释。

孕妇年龄对后代存活时间的影响也有报道在其他无脊椎动物模型，包括果蝇果蝇和线虫 39,40。虽然它是比较费时，这些长寿命模式，对于这些动物中的存活时间测量减少实验的变化超过几代同步过程将是有益的。

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Acknowledgments

我们感谢乔治·贾维斯，玛莎博克和贝特Hecox - 李，海洋生物实验室，他们在拍戏的帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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细胞生物学，第113，抗老化，寿命，母体效应，Monogononta，轮虫，存活时间
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Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

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