Introduction
Rotiferi sono microscopici cosmopolita zooplancton (<1 mm), che costituiscono il phylum Rotifera 1. Hanno un semplice piano corpo composto di circa 1.000 cellule somatiche, nonché un apparato ciliare ruota-come caratteristica denominata corona, che viene utilizzato per la locomozione e l'alimentazione. La maggior parte dei rotiferi appartengono a classi Monogononta o Bdelloidea, che contengono circa 1.600 e 500 specie, rispettivamente 2. Rotiferi Monogonont hanno generalmente entrambe le fasi riproduttivo sessuale e asessuale (partenogenesi ciclico), mentre rotiferi bdelloid si riproducono per partenogenesi obbligatoria 3. È così possibile ottenere individui rotifere geneticamente identici, che assicura un'elevata riproducibilità in esperimenti. Inoltre, essi hanno diversi altri vantaggi come organismi modello, come una vita breve, facilità di coltura, la disponibilità dei dati di sequenza genomica e trascrittomica 4-7, ed una posizione filogenetica unica distante da unarthropods e nematodi 8. Rotiferi sono quindi promettenti modelli di invertebrati in ecologico, tossicologico, e l'invecchiamento studi 9-12.
Il tempo di sopravvivenza in condizioni di esposizione a stress ambientale o sostanze chimiche è un parametro spesso misurato in questi campi di ricerca 13-19. Tuttavia, la cautela è necessaria quando si misura il tempo di sopravvivenza dei rotiferi, perché è suscettibile a condizioni ambientali delle loro madri. Vale a dire, nel monogonont Manjavacas rotifero Brachionus, prole femminile da madri di età hanno una durata più breve rispetto a quelli da giovani madri; tuttavia, la restrizione calorica materna (CR) compensa in parte gli effetti deleteri di avanzata età materna 20. In B. plicatilis, materna CR fornisce longevità prole, il tempo di sopravvivenza a lungo sotto la fame, ed elevata resistenza stress ossidativo associato con una maggiore espressione di enzimi antiossidanti 21,22. L'effetto dell'età maternaè stato osservato anche in rotiferi bdelloid 23. Pertanto, le condizioni di rotiferi sperimentali devono essere attentamente sincronizzate su più generazioni prima di misurazioni del tempo di sopravvivenza.
Qui forniamo un protocollo per la misurazione del tempo di sopravvivenza in rotiferi Brachionus dopo la sincronizzazione delle condizioni di coltura per diverse generazioni. Digiuno intermittente (IF), una variazione di CR dove rotiferi vengono alimentati periodicamente, è stato applicato per rivelare l'effetto della sincronizzazione a causa degli effetti ben noti di IF sulla longevità 22,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di media
Nota: utilizzare metà diluita Brujewicz acqua di mare artificiale di salinità 16,5 ppt (PSU). Altri seawaters artificiali sono anche spesso utilizzate per cultura Brachionus rotiferi 25,26.
- Aggiungere 454 mM NaCl, 26 mM MgCl 2, 27 mM MgSO 4, 10 mM KCl, e 10 mM CaCl 2 al 4,5 l di acqua distillata (volume finale sarà di 5 L). In alternativa, utilizzare acqua di diluizione deionizzata invece di acqua distillata. Aggiungere CaCl 2 dopo aver sciolto tutti gli altri sali.
- Preparare la M NaHCO soluzione 0.48 3 stock (concentrazione 200x). Aggiungere 25 ml di esso alla soluzione precedente. La concentrazione finale di NaHCO 3 è di 2,4 mM.
- Preparare la soluzione di riserva M NaBr 0,4 (concentrazione 500x). Aggiungere 10 ml di esso alla soluzione precedente. La concentrazione finale di NaBr è 0,8 mM. Portare a 5 L con acqua distillata.
- Filtrare la soluzione con un filtro a membrana da 0,45 micron.Diluire due volte con acqua sterile prima dell'uso (v / v).
Nota: E 'possibile effettuare una concentrazione 2x di Brujewicz acqua di mare artificiale come una soluzione madre.
2. Condizioni generali Culture
- Cultura laboratorio rilievo o rotiferi selvatici catturati in una sterile bicchiere da 100 ml tra 20 e 30 ° C. Temperature più elevate si traducono in durate di vita più brevi e la riproduzione accelerata. Utilizzare 25 ° C per la comodità di esperimenti. La densità rotifero o il volume di acqua di mare artificiale non è un grosso problema qui.
- Cultura specie di microalghe alimentari in acqua di mare artificiale 11. Vedere Snell et al. (2014) per i dettagli 11. In genere, usare Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 cellule / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 cellule / ml 25,29), e Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 cellule / ml 30,31). Dal momento che le alghe dieta (specie, la cultura Conditioni, composizioni biochimiche) influenza in modo significativo il tempo di sopravvivenza dei rotiferi Brachionus, utilizzare lo stesso lotto di microalga in tutti i gruppi sperimentali.
- Mantenere una popolazione magazzino di rotiferi in una cultura lotto alimentando e cambio di un supporto di tanto in tanto (ad esempio, da mangiare ogni 2 giorni e inoculare ogni settimana). Molti neonati e adulti che portano 2-3 uova possono essere osservati quando rotiferi sono in condizioni ottimali.
Nota: Un modo alternativo per ottenere rotiferi sperimentali è a covare le uova di riposo. Rotiferi nati dalle uova di riposo sono considerati essere ben sincronizzati, e la loro durata di vita non è significativamente diversa da quella dei rotiferi nati da uova amictic 11. Tuttavia, rotiferi da uova di riposo iniziare la riproduzione prima di quelli da uova amictic. Quindi, cautela è necessaria per la misura delle loro caratteristiche riproduttive.
3. La sincronizzazione dei rotiferi da Pre-cultura
- Selezionare una singola rotifero dalla stock popolazione e cultura come descritto in 2.1-2.3 per stabilire una sottopopolazione che verrà utilizzato per esperimenti. In genere la cultura per due settimane.
- Raccogliere rotiferi uova recanti dalla sotto-popolazione (raccogliere un numero doppio di persone che verranno utilizzati per l'esperimento). Li cultura come singola coorte (densità: ~ 50 individui / ml) in una piastra di coltura a 6 così come descritto in 2.1-2.3 in un fresco supporto sotto alimentazione ad libitum. Controllare la densità di popolazione è importante perché il mezzo condizionato incide sulla fisiologia della riproduzione Brachionus rotiferi 32,33.
- Trasferire i neonati nati da uova prima degli adulti a terreni di coltura appena preparata. Ripetere questa procedura per 2-3 generazioni.
- Utilizzare neonati nati entro un certo periodo di tempo (ad esempio, <3 hr) per la misura del tempo di sopravvivenza. Per evitare possibili distorsioni nella scelta del singolo individuo, anche se molto improbabile, controllare la riproducibilità utilizzando diversi independenti sottopopolazioni.
Nota: Come rotiferi solito riproducono solo asessuata in questa condizione, garantire l'assenza di maschi sono presenti in tutto l'esperimento. I maschi sono più piccoli di neonati e in genere si muovono più velocemente rispetto alle femmine. Femmine Mictic hanno differenti durate di vita da femmine amictic a determinate condizioni 29.
4. Le misurazioni del Tempo di sopravvivenza
- Luogo neonati in piatti di plastica (in genere 24 o 48 pozzetti, con ogni ben contenente 1 ml di acqua di mare artificiale).
- A intervalli hr 24, trasferire i rotiferi per terreni di coltura appena preparati o ad intervalli di 12 h se a temperatura elevata (30 ° C o superiore). Registrare il numero di figli e se ogni individuo è vivo o morto. Registrare il rotifero come morto quando il movimento delle ciglia della corona ha completamente fermato.
Nota: Rotiferi spesso attaccano alle pareti laterali dei pozzi. pipettaggio delicato dell'acqua aiuta a trovarli. Se rotiferi non si trovano o are danneggiato accidentalmente dal pipettaggio, registrarli come "censurato", non come "morto". - Rimuovere i neonati quando rotiferi sperimentali sono attivamente riprodursi. I neonati crescono rapidamente ed è a volte difficile distinguerli dai rotiferi sperimentali.
Analisi 5. I dati
- Creare la curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier (figure 1 e 2) riportando tasso di sopravvivenza cumulativo sull'asse Y e tempo sull'asse X. Questa è la rappresentazione più comune di dati di sopravvivenza. Utilizzare il log-rank test non parametrico (chiamato anche test di Mantel-Cox) per il confronto statistico del tempo di sopravvivenza 34. Il log-rank test è incluso anche in altri pacchetti statistici standard come JMP e R.
Nota: non utilizzare t-test o analisi della varianza (ANOVA) seguita da parametrico confronto multiplo di Student distribuzione normale perché di solito non è soddisfatta da dati di sopravvivenza 35. Inoltre, questi methods non prendono gli individui Censored in considerazione. Mann-Whitney U test può essere utilizzato se non ci sono dati censurati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 1 mostra le curve rappresentative di sopravvivenza delle popolazioni mal sincronizzati (su due repliche). In questo esperimento, rotiferi erano o tutti i giorni della Fed [ad libitum (AL) gruppo] o ogni altro giorno (se il gruppo). La sopravvivenza mediana è stata di 13 e 18 giorni nel AL e se i gruppi, rispettivamente. Sebbene sia ben noto che se prolunga la vita della rotifero, questo esperimento non ha rilevato una differenza statisticamente significativa tra durate di vita di AL e IF gruppi. Empiricamente, i risultati di sincronizzazione insufficienti a mortalità precoce e graduale declino nel tasso di sopravvivenza come osservato in questo esperimento. Danni al rotiferi causati da un trattamento inappropriato o la qualità dell'acqua basso per il sotto-popolazione tende a produrre risultati simili.
Quando le condizioni di rotiferi sono ottimali e ben sincronizzati, mortalità precoce è poco osservato e Accordingly rotiferi tendono a morire in modo sincronizzato durante la fase successiva dell'esperimento (Figura 2). La sopravvivenza mediana è stata di 13 e 20 giorni di AL e se i gruppi, rispettivamente. Sebbene meno animali sono stati usati che l'esperimento in figura 1, la differenza di durata tra questi gruppi era statisticamente significativa. Questo è il risultato rappresentativi di più di cinque esperimenti che sono stati pubblicati in precedenza 22.
Figura 1:. Curve di Kaplan-Meier per gli individui mal sincronizzati sottoposti a digiuno intermittente (IF) Il gruppo LA è stato alimentato ad libitum tutto l'esperimento, mentre il gruppo se è stato alimentato a giorni alterni. N = 11 e N = 12 per la AL e IF gruppi, rispettivamente (N si riferisce al numero di singoli usato nell'esperimento). L'esperimento è stato performed a 25 ° C. Nessuna differenza significativa nella durata della vita è stato rilevato quando log-rank test è stato utilizzato (P = 0,1207). Tuttavia, questi dati è difficile da interpretare perché log-rank test non deve essere utilizzato per confrontare due curve di attraversamento di sopravvivenza, anche se il test è conosciuto per essere robusta 36. Non ci sono metodi consolidati sono attualmente disponibili per l'attraversamento curve di sopravvivenza con i dati censurati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Curve di Kaplan-Meier per gli individui sincronizzati sottoposti a SE Il coorte rotiferi, ottenuto dalla pre-cultura, è stato sottoposto allo stesso Se Schedule (nutriti a giorni alterni). N = 6 e N = 8 per AL e IF gruppi, rispettivamente. L'esperimento è stato effettuato a 25 ° C. log-rank test, p = 0,0057. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'attuale protocollo descrive un metodo per misurare il tempo di sopravvivenza in rotiferi Brachionus. Il passo fondamentale è la sincronizzazione delle condizioni di rotiferi per diverse generazioni. Quando rotiferi sperimentali sono ben sincronizzati, una curva di sopravvivenza che tipo tipico è osservata con molto poco mortalità precoce come riportato in diversi studi precedenti 18,24,37,38. Le deviazioni standard del loro tempo di sopravvivenza di conseguenza diventano più piccoli rispetto ai rotiferi sincronizzati male, con conseguente elevata potenza statistica. La sincronizzazione è previsto anche per aumentare la riproducibilità delle misure di tempo di sopravvivenza - perché le madri sono coltivate in condizioni ottimali, l'attuale protocollo compensa i possibili effetti deleteri delle generazioni materni. Se la mortalità precoce è ancora osservata dopo un'attenta sincronizzazione, considerare l'utilizzo di terreni di coltura di recente preparato, un'altra partita di alghe alimentazione, o di una coorte sperimentale di nuova costituzione (vale a dire,iniziare da protocollo 3.1).
Una limitazione di questo protocollo è che i rotiferi ben sincronizzati, sono potenzialmente troppo sensibile. Ad esempio, al momento lo screening di sostanze chimiche che si estendono la durata della vita, alcune sostanze chimiche schermati da questo protocollo potrebbe non riuscire a rilevare effetti significativi sulla durata di vita di rotiferi mal sincronizzati (ad esempio, persone provenienti da popolazioni selvatiche e batch-colta). Pertanto, i risultati di tali esperimenti devono essere interpretati con cautela.
L'effetto dell'età materna in tempo prole di sopravvivenza è stata riportata anche in altri modelli di invertebrati, tra cui la mosca della frutta Drosophila melanogaster ed il nematode Caenorhabditis elegans 39,40. Anche se è più-tempo in questi modelli a lunga vita, la procedura di sincronizzazione per diverse generazioni sarebbe utile per questi animali per diminuire variazioni sperimentali nella misurazione del tempo di sopravvivenza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Siamo grati a George Jarvis, Martha Bock, e Bette Hecox-Lea, Marine Biological Laboratory, per il loro aiuto in riprese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Wako | 190-13921 | |
| Magnesium chloride | Wako | 136-03995 | |
| Magnesium sulfate | Wako | 131-00427 | |
| Potassium chloride | Wako | 168-22111 | |
| Calcium chloride | Wako | 035-00455 | |
| Sodium bicarbonate | Wako | 199-05985 | |
| Sodium bromide | Wako | 190-01515 | |
| Membrane filter (0.45 µm pore size) | Millipore | HAWP04700 | |
| Culture plate, 6-well, non-treated | Thomas Scientific | 6902D01 | Flat bottom |
| Culture plate, 48-well, non-treated | Thomas Scientific | 6902D07 | Flat bottom |
| Tetraselmis, Living | Carolina Biological Supply Company | 152610 | |
| PRISM 6 | GraphPad Software | Version 6.0d |
References
- Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. , 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
- Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. , Magnolia Press. Auckland. (2007).
- Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288 (5469), 1211-1215 (2000).
- Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671 (2007).
- Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108 (2009).
- Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662 (1), 65-75 (2010).
- Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500 (7463), 453-457 (2013).
- Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
- Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136 (4), 715-722 (2003).
- Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101 (1), 1-12 (2011).
- Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 84-95 (2014).
- Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
- Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
- Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
- Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649 (1), 267-277 (2010).
- Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77 (3), 403-409 (2011).
- Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 166-172 (2014).
- Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19 (1), 33-52 (2014).
- Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
- Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13 (4), 623-630 (2014).
- Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67 (2), 373-374 (2001).
- Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25 (1), 209-216 (2011).
- Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2 (3), 228-239 (1947).
- Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253 (2), 253-260 (2000).
- Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
- Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
- Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662 (1), 107-111 (2011).
- Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
- Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (4), 349-358 (2013).
- Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68 (6), 1317-1323 (2002).
- Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 151-156 (2014).
- Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
- Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667 (1), 101-117 (2011).
- GraphPad Statistics Guide. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
- Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. , 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
- Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137 (2011).
- Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8 (2), e57186 (2013).
- Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
- Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).
