Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54135
Automatic Translation
*1, *1,3, 1,2
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 3Laerdal AS
* These authors contributed equally

Summary

فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) التصوير هو أداة قوية في الوقت الحقيقي للدراسات بيولوجيا الخلية. هنا يتم تقديم وسيلة للخلايا التصوير الحنق في الفسيولوجية microenvironments ثلاثي الأبعاد (3D) هيدروجيل باستخدام المجهر epifluorescence التقليدية. يوصف تحليلا للتحقيقات الحنق ratiometric التي تعطي نسب الخطية على نطاق التنشيط.

Abstract

تصوير فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) هو أداة قوية لفحص بيولوجيا الخلية في الوقت الحقيقي. الدراسات باستخدام الحنق عادة توظف ثنائي الأبعاد (2D) والثقافة، والتي لا تحاكي ثلاثية الأبعاد (3D) المكروية الخلوية. تم توضيح طريقة لأداء الانبعاثات مروي الحنق التصوير باستخدام التقليدية المجهر widefield epifluorescence من الخلايا داخل بيئة هيدروجيل 3D. هنا يتم وصف طريقة تحليل للتحقيقات الحنق ratiometric التي تعطي نسب الخطية على نطاق تفعيل التحقيق. ويظهر قياس (المخيم) مستويات الخلايا أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي في غضروفية تحت التحفيز forskolin باستخدام مسبار لEPAC1 تفعيل (ICUE1) والقدرة على اكتشاف الفروق في مخيم يشير هذا يعتمد على نوع المواد هيدروجيل، هنا هيدروجيل photocrosslinking (PC-جل، البولي ايثيلين جلايكول dimethacrylate) وهيدروجيل thermoresponsive (TR-جل). بالمقارنة مع الطرق 2D الحنق،يتطلب هذا الأسلوب العمل الإضافي القليل. يمكن أن المختبرات التي تستخدم بالفعل الحنق التصوير في 2D تعتمد هذه الطريقة بسهولة لإجراء الدراسات الخلوية في المكروية 3D. ويمكن كذلك تطبيقها على الإنتاجية العالية فحص المخدرات في microtissues 3D هندسيا. بالإضافة إلى ذلك، وهو متوافق مع أشكال أخرى من التصوير الحنق، مثل قياس تباين والتصوير مضان عمر (FLIM)، ومع منصات متقدمة المجهري باستخدام مبائر، نابض، أو إضاءة التضمين.

Introduction

الإشارات الخلوية على حد سواء معقدة والتبعية للعديد من المجالات، بما في ذلك علم الصيدلة، هندسة الأنسجة والطب التجديدي. هناك حاجة إلى أدوات الفحص مفيدة لزيادة فهمنا للبيولوجيا الخلية وتطوير المواد المثلى لتجديد الأنسجة. فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) التصوير هو أداة أساسية تمكن من تحليل تنشيط مستقبلات، التشكل الجزيئي، والتفاعلات supramolecular (على سبيل المثال، بروتين / الحمض النووي complexation) في الخلايا الحية. الحنق هو نوع من نقل الطاقة غير الإشعاعي بين fluorophores 1. ولديه الكفاءة التي تتناسب عكسيا مع قوة السادسة من المسافة بين fluorophore المانحة وfluorophore المتقبلة. وهكذا، يمكن أن توفر معلومات عن المسافة المكانية بين اثنين من جزيئات مختلفة أو عبر مناطق جزيء واحد على مقياس النانومتر (عادة 1-10 نانومتر) 2. قد يكون fluorophores المانحة ومتقبل م مختلفةأنواع olecule (مغاير الحنق)، الذي المانحة لديه انبعاث طاقة أعلى (أقصر طول موجي)، أو من نفس النوع (هومو-الحنق). الحنق التصوير لا يمكن أن يؤديها على خلايا ثابتة أو الحية، ولكن بصفة عامة تستخدم خلايا ثابتة للتصوير التفاعلات الجزيئية في قرار مكانية عالية عندما نظم مبائر سرعة عالية غير متوفرة. تستخدم الخلايا الحية لدراسة التفاعلات والعمليات التي تحول دون أو تعديلها من قبل التثبيت، مثل داخل الخلايا في الوقت الحقيقي مما يشير إلى استجابة 3.

دراسات الخلية الحية التي تستخدم الحنق استخدام التصوير ثنائي الأبعاد (2D) الثقافات الخلوية وذلك جزئيا بسبب البساطة وانخفاض الخلفية (أي انبعاث من خارج الخلايا الطائرة). ومع ذلك، ثقافات 2D أيضا تغيير العديد من العمليات الخلوية مقارنة المكروية الفسيولوجية وثلاثية الأبعاد (3D) ثقافة 4،5. على سبيل المثال، يتم تغيير الخلية الأم إلى الخلية والخلية إلى التفاعلات المصفوفة خارج الخلية بشكل كبير في ثقافة 2D المؤدية إلى قمة شرق آسيالاحظ إيلي التغييرات في شكل الخلية والاستقطاب 6. microdomains غشاء (على سبيل المثال، caveolae والدهون الطوافات) والإشارات المستقبلة وينظم بقوة عن البيئة والثقافة، ويرجع ذلك جزئيا إلى ربط مكونات هيكل الخلية 7،8 وشكل الخلية وهيكل الخلية هيكل وينظم بقوة بيئة الثقافة المكانية 9. لا يتأثر Mechanotransduction إلا من خلال مصفوفة 3D، ولكن بسبب الظروف تحميل الثانوية أكثر تعقيدا تولدت في بيئات 3D مقارنة الثقافات 2D 10. وأخيرا، نفاذية المصفوفات 3D أقل من مستنبت، بشكل عام مع انخفاض انتشار وزيادة ملزمة من الخلايا الجزيئات مما يشير مقارنة الثقافات 2D. مع الثقافات 3D واحد قادر على خلق ومراقبة المكروية أكثر مماثلة لفيزيولوجي فيما يتعلق اللاصقة والكيميائية، والعظة الميكانيكية. خلية إلى خلية التفاعلات يمكن تعزيز وخصائص لاصقة يمكن التحكم ثإيث هيكل، وتكوينها، والهندسة المعمارية (الزخرفة) من المادة 3D 11-13. يمكن أيضا الخواص الميكانيكية للمواد تكون مصممة من قبل تكوين وبنية 14،15. زراعة الخلايا في الهلاميات المائية بالتالي تصاريح الحنق دراسات على الخلايا الأولية التي من شأنها التقليل من يفرق خلاف ذلك أو تغيير في النمط الظاهري باستخدام التقنيات التقليدية، على سبيل المثال، الخلايا من الغضروف المفصلي. وبالتالي، هناك حاجة إلى وسيلة لتمكين المقايسات الحنق في الثقافات 3D حية.

السقالات هيدروجيل مثالية للدراسات تستند 3D الحنق لأنها يمكن أن تكون شفافة بصريا ومصممة للسيطرة على المكروية وتقديم العظة الخلوية. وقد استخدمت الهلاميات المائية المصنوعة من البوليمرات الطبيعية في زراعة الخلايا على مدى عقود، بما في ذلك الجيلاتين والفيبرين 16. ويمكن تحقيق قدر أكبر من السيطرة المكروية الخلوية مع التعديل الكيميائي لهذه البوليمرات ومع استخدام البوليمرات الاصطناعية 17،18. HYDRogel صلابة الميكانيكية ويمكن التحكم نفاذية عن طريق تغيير تركيبتها البوليمر وشبكة حجم (البوليمر وكثافة تشعبي) 19،20. وعلاوة على ذلك، الهلاميات المائية ويمكن إجراء النشطة بيولوجيا من خلال إدراج عوامل النمو وبروابط الخلوية. بسبب هذه الاحتمالات، وتطوير الهلاميات المائية لbiosensing، تسليم المخدرات، وتطبيقات هندسة الأنسجة هي منطقة نشطة جدا من الأبحاث 21. 3D الطباعة من الهلاميات المائية يخضع لعملية تطوير لتصنيع الأنسجة الدقيقة و-organs 15. وهكذا، الحنق التصوير من الخلايا في الهلاميات المائية هو مفيد ليس فقط كوسيلة لتقريب سلوك الخلوية الفسيولوجية، ولكن أيضا كأداة لدراسة وتحسين نمو الأنسجة هندسيا.

ثنائية تحقيقات الحنق ratiometric مفيدة جدا في دراسة الإشارات الخلوية، ويمكن الاستفادة منها في الثقافات هيدروجيل. للحصول على قائمة جزئية من الفلورسنت المنشورة والحنق تحقيقات، راجع خلية اتحاد هجرة الموقع سبيل المثال، ربط أيون أو جزيء، انشقاق الأنزيمي في المنطقة) أن يغير المسافة بين fluorophores، وبالتالي فإن حجم الحنق (إما أعلى أو أقل) 23. وهناك نوع مسبار أقل شيوعا ولكنها مفيدة يعتمد على التغيير حساسة تحليلها في التداخل الطيفي للfluorophores اثنين، الذي يغير الحنق الحجم. "وحيد سلسلة" تحقيقات ratiometric الاستفادة من زوج fluorophore مرتبط على جزيء واحد. "مزدوجة سلسلة" تحقيقات الاستفادة أزواج fluorophore على جزيئات منفصلة، ​​ولكن التعبير عنها يمكن أن يقترن تحت نفس التعبير كاسيت 24. على عكس الدراسات مع التعبير fluorophore واحد (على سبيل المثال. والبروتينات الانصهار فلوري)، ودراسات مع ratiometricتحقيقات الحنق لا تتطلب ترنسفكأيشن المزدوج للسيطرة على كفاءة ترنسفكأيشن أو بقاء الخلية. تحقيقات Ratiometric الحنق لا تعير اهتماما نسبيا لكفاءة ترنسفكأيشن عندما أعرب فوق الحد الأدنى عتبة (تركيز حساسة) 23،25. فهي حساسة لتقلبات مصدر الإثارة وغيرها من العوامل البيئة داخل الخلايا (على سبيل المثال.، ودرجة الحموضة، أيونات) ما دام كل fluorophores تستجيب على نحو مماثل. وبالإضافة إلى ذلك، ردهم لا تخضع لتأخير النسخي، على عكس فلوري وإضاءة الحيوية المروج مراسل يبني 26،27.

وبسهولة وغالبا ما يلجأ تحقيقات Ratiometric الحنق في أنظمة المجهر widefield epifluorescence التقليدية. ويفضل المجاهر Widefield على الأنظمة مبائر خط المسح الضوئي لتصوير الخلايا الحية بسبب المخاوف بشأن تكلفة النظام، وتبيض fluorophore، والتقاط التغيرات إشارة لقرار زمني يكفي. وبالإضافة إلى ذلك، الشرج خلية واحدةيسيس على عدد كبير من الخلايا هو ممكن مع القبض على مرحلة وصورة الآلية على حقول نظر متعددة. يتطلب Widefield المجهري تحليل كثافة أساس الإشارات التحقيق مغاير الحنق. على الرغم من تحليل كثافة لا تتطلب أجهزة معقدة مثل أساليب الزخرفة أخرى، هناك حاجة إلى مزيد من العمل بعد الحيازة لتصحيح آثار السلوكيات fluorophore والمجهر / التصوير تكوينات النظام 28. كثافة الانبعاثات القبض على fluorophore هي وظيفة من طاقة الإثارة، fluorophore العائد الكم، وتصفية جنبا إلى جنب والكاميرا / كشف الحساسية الطيفية والخطي 2. قد تكون هذه تختلف عن الجهة المانحة ومتقبل وسوف يتطلب معايرة للتحليل الكمي. وبالإضافة إلى ذلك، يتأثر التصوير من الانبعاثات متقبل من خلال التداخل الطيفي للfluorophores (الإثارة من متقبل من قبل الجهات المانحة ضوء الإثارة وتنزف من خلال انبعاث المانحة إلى أطياف الانبعاث متقبل) 2.4؛ واحدة سلسلة "تحقيقات تم تطبيع داخليا بسبب fluorophores هم متساوي المولية على مقياس النانو، في حين أن fluorophores من" مزدوجة سلسلة "تحقيقات قد تكون موجودة في النسبة المولارية المختلفة في جميع أنحاء خلية 25،28 إذا كان fluorophores من" سلسلة واحدة " تحقيقات ذات سطوع مماثل (وظيفة من معامل الانقراض والعائد الكم)، وآثار للكشف عن حساسية غير الخطية هي تصحيح صغير والوحيد لمضان الخلفية ونوعية حساسية العائد / كاشف جانب هناك حاجة إلى 23 وهكذا "سلسلة واحدة" تنفذ تحقيقات ratiometric الحنق أكثر سهولة في widefield المجهري 24.

وتصف هذه الورقة تقنية واضحة لأداء الحنق التصوير من الخلايا الحية في الثقافات هيدروجيل 3D باستخدام المجهر widefield epifluorescent التقليدية. ويمكن بسهولة اعتمدت من قبل مختبرات تحمل بالفعل تجارب الحنق في 2D، وكذلك المختبرات المهتمة في ما بينالإشارات الخلوية في microtissues. نحن هنا لشرح الطريقة مع قياس الحنق التصوير أساس من الأدينوزين الحلقي الأدينوساين (المخيم) مستويات في غضروفية الحية داخل photocrosslinking (PC-جل، البولي ايثيلين جلايكول dimethacrylate) وthermoresponsive (TR-جل، Matrigel) الهلاميات المائية. ويستخدم مجس الحنق ratiometric على أساس EPAC1 (ICUE1) للكشف عن مستويات المخيم ردا على forskolin، ناهض الكيميائية لمحلقة أدينيليل الذي يحفز تحويل ATP إلى المخيم. المخيم هو واحد من رسل الثانية الرئيسية التوسط G البروتين يقترن مستقبلات الإشارات وأنه ينشط عوامل مختلفة، بما في ذلك البروتينات صرف المصب تفعيلها مباشرة من المخيم (EPACs). وfluorophores تتحرك بعيدا على مخيم ملزمة إلى المجال EPAC مما أدى إلى انخفاض في الحنق. وصفت هنا هو إعداد المواد هيدروجيل، ترنسفكأيشن الخلية مع لجنة التحقيق ICUE1، وتضمين الخلايا في الهلاميات المائية 3D. إجراء تجربة 3D الحنق وتحليل الصور ضروريوأوضح النشاط التحقيق في خلية لتقييم. نحن أيضا مناقشة القيود المتأصلة في تحليل الحنق في 2D و 3D باستخدام widefield المجهر. تقنية المعروضة هنا هي تحسنا عن طرق القائم 2D لأنه تمكن من تحليل في سياق أكثر الفسيولوجية ويتطلب أقل تصحيح الصورة والمعايرة. فائدة كبيرة تكمن في حقيقة أن العديد من مواد شفافة يمكن استخدامها في حين يمكن الحفاظ على الخلية وترنسفكأيشن التفضيلات.

Protocol

1. المواد التحضير

  1. إعداد البولي ايثيلين جلايكول dimethacrylate (PEGDM، 4000 ميغاواط) من خلال methacrylating البولي ايثيلين جلايكول وفقا للأساليب التي وصفها لين جيبسون وآخرون. 29. بدلا من ذلك، PEGDM يمكن شراؤها.
  2. تجميع photoinitiator، والليثيوم فينيل 2،4،6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)، من خلال عملية من خطوتين حيث يتفاعل أول phenylphosphonite ثنائي مع choride 2،4،6-trimethylbenzoyl طريق تفاعل ميخائيل-Arbuzov ثم ملح الليثيوم تم إنشاؤها عن طريق إضافة بروميد الليثيوم في 2-بونانون، وفقا Majima وآخرون. 30.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن شراء photoinitiators سوى يظهر LAP أفضل توافق مع الحياة ويشابك كفاءة 31.
  3. Functionalize الزجاج coverslips لتمكين الرابطة من هيدروجيل على الزجاج وبالتالي منع الحركة أثناء التصوير.
    1. في غطاء الكيميائية مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة، واستخدام3- (Trimethoxysilyl) بروبيل ميتاكريليت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للكمبيوتر الهلام وsilanes الايبوكسي (3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane) لTR الهلام 31. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن شراء الشرائح المكسوة مسبقا والمحمولة. لاحظ أن زلة غطاء يجب أن يكون أكبر من جانب الطبق PDMS في الخطوة 3.8.

ترنسفكأيشن 2. خلية

  1. في نسيج الثقافة هود وباستخدام تقنيات معقمة، ذوبان الجليد ولوحة الخلايا المطلوب في شبه confluency (50-70٪)، غضروفية البقري هنا في 15000 خلية / سم 2 في 6 جيدا الأطباق الثقافة غير المعالجة. ملاحظة: أي نوع من الخلايا ذات الصلة يمكن استخدامها، بما في ذلك خلايا مستقلة مرسى.
    1. تسمح للخلايا لاستعادة ليوم واحد في حاضنة عند 37 درجة مئوية. قبل الخطوات اللاحقة، وإزالة المتوسطة، وشطف مع برنامج تلفزيوني، وإضافة المتوسطة 2 مل phenol- وخالية من المصل لكل بئر.
  2. في اليوم التالي لكل بئر، إضافة 100 ميكرولتر من المتوسطة phenol- وخالية من المصل وكذلك 3ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن إلى أنبوب اختبار الزجاج تعقيمها. خلط، هز أنبوب طفيفة. في احتضان RT لمدة 5 دقائق. الحد من أي التعرض للضوء.
  3. إضافة 1 ميكروغرام الحنق سبر الحمض النووي ويهز طفيفة. احتضان الخليط على RT وبعيدا عن الضوء لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: في هذه التجربة ICUE1 البلازميد كان يستخدم (مجاملة للدكتور جين تشانغ 33). وfluorophores في ICUE1 هي سماوي ببروتين (CFP، الجهات المانحة) والأصفر بروتين فلوري (YFP، متقبل). فإن نسبة من كاشف ترنسفكأيشن لDNA البلازميد تحتاج إلى تعديل لترنسفكأيشن الأمثل من أنواع مختلفة من الخلايا.
  4. توزيع الخليط على استعداد (~ 104 ميكرولتر) قطرة من الحكمة أن كل واحد من 6 آبار تحتوي على خلايا زائد 2 مل من phenol- والمتوسطة خالية من المصل. لا الماصة صعودا وهبوطا. دوامة بلطف لوحة لالمزيج.
  5. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ملاحظة: Confluency يمنع كفاءة ترنسفكأيشن ويغير التعبير الذاتية من المستقبلات.

3. تصنيعPDMS لقوالب صب هيدروجيل والثقافة

  1. لإعداد شريحة زجاجية كبيرة للادلاء ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) على، تنظيف الزجاج أولا بالماء والصابون، وشطف مع كمية وفيرة من الماء، ثم الجافة مع الأيزوبروبانول تليها الهواء.
    1. علاج الزجاج مع كاشف siliconizing حسب بروتوكول الشركة المصنعة بحيث PDMS يمكن تقشيرها بسهولة قبالة بعد علاج. شطف كاشف المتبقية من على سطح مع التولوين أكثر من حاوية مستجمعات المياه. السماح للسطح في الهواء يجف تماما قبل أو استخدام الحرارة عند 100 درجة مئوية لتقصير وقت الانتظار.
  2. حدد ارتفاع هيدروجيل (على سبيل المثال، 1 مم) وحساب 1.2 أضعاف حجم PDMS اللازمة لتغطية شريحة زجاجية مع PDMS من هذا السمك باستخدام أبعاد الشريحة الزجاجية وارتفاع هيدروجيل. ملاحظة: PDMS لا يتقلص.
    1. خلط مكونات عدة PDMS في 10: 1 نسبة من وزنه في كوب. مرة واحدة يتم مزجه جيدا، ضع الكأس في ظل فراغ المنزل لديغا. يختلطieve الفراغ إذا تبدأ فقاعات لتجاوز الحاوية وتكرار.
      ملاحظة: يمكن استخدام سمك هيدروجيل أخرى، ولكن على حساب زيادة الخلفية وزيادة التعتيم إذا لم يتم استخدام الطرد المركزي (الخطوة 6.2).
  3. لف رقائق الألومنيوم حول قاعدة وجوانب من الزجاج لاحتواء PDMS. صب بعناية المبلغ المطلوب من PDMS نزع الغاز على هذا الزجاج محاطة احباط. قياس ارتفاع PDMS. نضع في اعتبارنا أن ارتفاع PDMS سوف يكون الحد الأقصى للارتفاع هيدروجيل. إذا تم إنشاء أي فقاعات عندما صب، ديغا مرة أخرى أو موسيقى البوب ​​لهم مع ملعقة أو إبرة.
  4. ضع PDMS غير مخمر على سطح مستو في الفرن على 100 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، أو ترك في RT لمدة 24 ساعة.
  5. إزالة بعناية PDMS من على سطح الأرض مرة واحدة وعلاجه. لكمة من أصل الشكل المطلوب (على سبيل المثال، لكمة اسطوانية من 3 ملم) لالهلاميات المائية.
    ملاحظة: سوف Photocrosslinking تسفر أضيق قليلا اسطوانات PC-جل من قطر القالب المناسبلتبريد من رد فعل من الأكسجين الجزيئي في PDMS.
  6. تعقيم PDMS لكمات. لإجراء التجارب على المدى القصير، غمر PDMS في 70٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة.
  7. تجميع قالب من تركيب قاعدة PDMS تعقيمها مع ساترة زجاجية معقمة من سمك مطابقة لتصحيح موضوعي المجهر. توضع جانبا لاستخدامها في الخطوة 6.
  8. صنع طبق PDMS أكبر باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه (مع بئر أوسع وأطول من هيدروجيل) لاحتواء هيدروجيل والمتوسطة. استيعاب حجم متوسط ​​10X على الأقل أكثر من هيدروجيل أن تزج هيدروجيل والتقليل من التخفيف من تحليلها.

4. إعداد هيدروجيل السلائف حلول

  1. في نسيج الثقافة هود وباستخدام تقنيات عقيمة، وإعداد هيدروجيل حلول السلائف مناسبا للدراسة على الفور قبل أن يضيف الخلايا. إعداد PC-جل من السلائف البوليمر على النحو التالي.
    1. خلط مسحوق PEGDM في الفوسفات المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.2) بنسبة 10٪ (ث / ت).
    2. إضافة photoinitiator (على سبيل المثال، LAP) بتركيز نهائي من ،005-0،01٪ (ث / ت) ومزيج من قبل pipetting. تغطية الحل مع رقائق الألومنيوم أو درع من الضوء وLAP غير الحساسة للضوء.
      ملاحظة: وهنا يتم استخدام TR-جل انخفاض النمو عامل المصفوفة خارج الخلية كما تم توفيره من قبل الشركة المصنعة.

5. تعليق خلية في حلول هيدروجيل

  1. في نسيج الثقافة هود وباستخدام تقنيات عقيمة، ونضح المتوسط ​​من الآبار.
  2. إضافة إلى برنامج تلفزيوني الآبار ثم ترفع إلى شطفها جيدا الطبقات الوحيدة الخلية المرفقة.
  3. فصل الخلايا من الركيزة الثقافة باستخدام 2-3 مل لكل 25 سم 2 من الحل تفارق الخلية. صخرة بلطف، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة أو حتى تنفصل. بحزم الاستفادة الطبق إذا لزم الأمر لإزاحة الخلايا.
    ملاحظة: هي حلول تفارق الخلية البديلة المتاحة مع اختيار تقتصر على تلك التي لا طMPACT مسار الإشارات قيد التحليل من قبل الشق مستقبلات المصالح.
  4. بعد أن يتم فصل الخلايا، إضافة 2 مل من المتوسط ​​phenol- وخالية من المصل، تعليق الخلايا، وعدد الخلايا مع عدادة الكريات. ملاحظة: المصل محددة كيميائيا خالية المتوسطة (على سبيل المثال، على أن تستكمل مع الانسولين، ترانسفيرين والسيلينيوم) ويمكن أيضا أن تستخدم.
  5. قسامة العدد المطلوب من الخلايا استنادا على نوع من الخلايا في قارورة معقمة وبيليه (على سبيل المثال، 2.0 × 10 6 خلايا في قارورة).
  6. إزالة طاف، إضافة حجم المطلوب من السلائف هيدروجيل وتعليق الخلايا من قبل pipetting. استخدام حجم السلائف التي من شأنها أن تسفر عن 2 × 10 5 خلية / سم 2 في الطائرة س ص عندما تصور ض محور هيدروجيل كما انهارت (على سبيل المثال، 1.0 مل لكل قارورة ل1 مم هيدروجيل سميكة تحتوي على 2 × 10 6 خلايا / مل). الحرص على عدم إنتاج فقاعات.
    1. التحرك بسرعة إلى الخطوة التالية للحد من الآثار السلبية على بقاء الخلية 34 </ سوب>.

6. إعداد هيدروجيل

  1. في نسيج الثقافة هود وباستخدام تقنيات عقيمة، إضافة هيدروجيل السلائف التي تحتوي على خلية لقوالب الصب أعدت في الخطوة 3 (على سبيل المثال، 7.1 ميكرولتر لكل مم 3 × 1 مم العفن عالية). إنشاء هيدروجيل إضافية، وفقا لنفس الأساليب المذكورة، لاستخدامها في نظام المجهر التصوير المعايرة وتحقيق المعايرة (اذا كانت كفاءة التحقيق الكامنة غير معروفة).
  2. الطرد المركزي هيدروجيل السلائف قبل دبق / يشابك لتحسين التصوير من خلال حصر الخلايا إلى البؤري واحدة والتقليل من إشارة الطائرة التي تحتوي على خلية استعداد (الشكل 1). ضبط الوقت الطرد المركزي والقوة لنوع من الخلايا واللزوجة من السلائف (400 غرام لمدة 4 دقائق).
  3. هلام أو تشعبي الحل
    1. لهيدروجيل PC-جل، أشرق على السلائف التي تحتوي على خلية تحتوي على الأشعة فوق البنفسجية مصدر الضوء (λ = 365 نانومتر) لفترة التعرض يساوي3.2 J / سم 2 في سمك ملليمتر إلى photocrosslink.
      ملاحظة: استخدم 1 مم على الأقل سماكة في الحساب. يجب التعرض تقع في نطاق 1-5 دقيقة. استخدام الحد الأدنى من الوقت التعرض. تجنب الإفراط في اضاءة الخلايا حيث سيؤدي ذلك إلى تقليل قابلية وتبييض المانحة CFP. ومع ذلك، لا ينصح التعرض مرات أقل من 60 ثانية بسبب ارتفاع كثافة الإشعاع يؤدي إلى جذري التبريد الذاتي والفقيرة بقاء الخلية.
    2. لهيدروجيل TR-جل، ضع القالب شغل في طبق بتري والانتقال إلى حاضنة ليهلم حراريا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. بعد التبلور أو يشابك هيدروجيل، وإزالة PDMS هيدروجيل قالب الصب واستبدالها مع صحن PDMS أكبر أعدت (من الخطوة 3.5). اضغط على PDMS أسفل على الزجاج مع ملعقة معقمة التمسك به.
    1. وضع هذا PDMS طبق مع ساترة في وعاء معقم، مثل طبق بتري. إضافة المتوسطة المصل خالية خالية من الفينول أو محددة كيميائيا ليdium (المصل خالية المتوسطة تستكمل مع الانسولين، ترانسفيرين والسيلينيوم (الخطوة 5.4)) لخلق جيدا مع الطبق PDMS وساترة للحفاظ على هيدروجيل مغمورة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم طبق متخصص مع ساترة، ثم ضع ساترة في ذلك، وكذلك إضافة المتوسطة.
    2. بالتناوب، تنفيذ هذه الخطوة قبل يوم من التصوير الحنق للسماح للتحقيقات لاستعادة كما تتداخل موجات الإشعاع مع CFP الإثارة المانحة الطيف.

7. 3D الحنق التصوير

  1. إزالة الطبق PDMS مع هيدروجيل من طبق بتري، أعدت في الخطوة 6.4، وثبته في حامل العينة قابل للتعديل للمرحلة XY المجهر (الشكل 2). وضع حامل العينة على المسرح المجهر. تطبيق النفط إلى الهدف إذا لزم الأمر. استخدام الهدف من 40X على الأقل ومن الفتحة العددية عالية (NA) (أي 1.3 NA) لالتقاط fluorophor ضعيف نسبياانبعاثات ه.
  2. تكوين مجالات عرض (FOVs) لالتقاط صور: خلايا الاختيار للتصوير باستخدام تنتقل عن طريق التصوير الضوئي والتحقق من ترنسفكأيشن مع التصوير مضان. اختيار لا يقل عن 15 خلايا مختلفة.
    1. حدد الخلايا التي ليست مشرقة جدا ولا قاتمة جدا (التي يمكن أن تؤدي إلى التحقيق على مدى تشبع أو حساسية منخفضة) ومع نسبة الحنق بين 0.0 و 1.0 (الذي يشير إلى خلاف ذلك الضرر أو تسوس لجنة التحقيق ثنائي). ثم إيقاف ضوء للحد من التعرض.
    2. اختر FOVs مقربة من مركز هيدروجيل ومع خلايا الفائدة في مجال الإضاءة مسطحة نسبيا (انظر الشكل 3B والخطوة 9.2 أدناه).
  3. تكوين إعدادات الكاميرا لقنوات الصورة الحنق. تختار من بين عدد قليل من الخلايا بالقرب من مركز مجال الرؤية لتحسين "تكوينات بصرية" (أي، والتعرض وزيادة في قناة الصورة).
    ملاحظة: التسميات تختلف أدناه dependinز على البرمجيات المستخدمة لتشغيل المجهر والكاميرا. البرنامج المجهر، شيكل، عناصر، ويستخدم هنا لالتقاط الصور وتحليلها.
    1. لتحليل الحنق تحقيقات سلسلة واحدة، حدد قناتين صورة في مجال الرؤية: مروي الانبعاثات (QE)، وهو انبعاث المانحة تحت الإثارة المانحة والانبعاثات القابل تحت الإثارة متقبل (AEM).
      ملاحظة: للحصول على التحقيق ICUE1 CFP-YFP، والإثارة CFP وتصفية الانبعاثات الزوج لبورصة قطر (418-442 السابق، 458-482 م)، والإثارة وانبعاث زوج YFP لAEM (490-510 السابق، 520-550 م) يستخدم.
    2. تعيين التعرض لبورصة قطر وAEM للحصول على أقصى قدر من قوة إشارة دون التشبع (وإذا باستخدام اتفاقية مكافحة التصحر، مع الربح الحد الأدنى الممكن) للحد من الضوضاء في الخلفية. الحفاظ على تكوينات بصرية نفسها من أجل كل fluorophores وفي كافة مراحل التجربة، وكذلك بين المجموعات التجريبية لتجنب يتحامل على النتائج (أي قوة الإثارة، حجم القزحية، والتعرض، وزيادة الكاميرا) (الشكل3A لدى عودتهم).
    3. الحصول على قنوات صورة إضافية للسماح لمزيد من الخيارات التحليل بعد اكتساب (على سبيل المثال، تصحيح الانبعاثات توعية (CSE) التصوير (انظر مناقشة)). لجنة التحقيق ICUE1 CFP-YFP، الحصول على الإثارة (خروج) والانبعاثات (إم) قنوات السابقين المانحة - إم المانحة (QE، حدد CFP-CFP في البرنامج المجهر)، تحويلة المانحة - إم متقبل (SE، حدد CFP- YFP)، تحويلة متقبل - إم متقبل (AEM، حدد YFP-YFP)، والمحررين متقبل - إم المانحة (YFP-CFP) تكوينات (انظر الشكل 3A).
  4. تكوين معدل القبض على الحصول على الصور مرور الزمن.
    1. خفض معدل التقاط إذا محدود من الأجهزة. لفحوصات على المدى القصير (على سبيل المثال، 30 - 60 دقيقة)، للدلالة حوالي 12 عمليات الاستحواذ في الدقيقة الواحدة لكل فوف (5 ثانية معدل أخذ العينات) لالتقاط حركية الإشارة. استخدام الحد الأدنى لمعدل أخذ العينات اللازمة لتجنب جوهريphotobleaching من ficantly التحقيق.
    2. تعيين نسبة الاستحواذ عن طريق كتابة وتيرة انعقاد يلتقط في البرنامج المجهر. لفحوصات على المدى الطويل (على سبيل المثال، 24 ساعة)، يبدأ معدل اكتساب عالية لالتقاط استجابة نبض الأولية ومن ثم التحول إلى معدل اكتساب منخفضة، على سبيل المثال، كل 5 إلى 10 دقيقة.
  5. حدد "تشغيل الآن" في البرنامج المجهر لبدء الحصول على الصور والتقاط الصور لمدة 5 دقائق لإنشاء خط الأساس للاستجابة التحقيق في FOVs المعينة.
  6. بعد 5 دقائق من الحصول على الصور، الماصة في المطلوب ناهض أو خصم تحليلها (على سبيل المثال، Forskolin في 100 نانومتر)، مزيج من قبل pipetting، ومواصلة التصوير.

8. الحنق المعايرة

  1. معايرة نظام: استخدام هيدروجيل معايرة إضافية، ملفقة كما هو موضح في الخطوة 6، للحصول على الصور AEM لا يقل عن 6 خلايا تمثيلية باستخدام نفس المعايير فوف، تكوينات بصرية، ومجموعة الكاميراالرنين المستخدمة في التصوير الحنق فوق (خطوات 7.1، 7.2 و 7.3).
    ملاحظة: هناك حاجة الكمي للعائد الكم والحساسية الطيفية (QS) لنظام التحقيق والتصوير المجهر جنبا إلى جنب ل "مطلق" الحنق التحليل ولكن ليس لالحنق "النسبي".
    1. Photobleach على fluorophore متقبل عن طريق اختيار التعرض 5 دقائق طويلة لضوء الإثارة في شدة كاملة (الإثارة على قناة AEM). استخدام الفتحة الضيقة لتبييض فقط خلايا الفائدة. تحقق من أن إشارة AEM أقل 10٪ على الأقل من الإشارة الأصلية من خلال مقارنة إشارة كثافة الرسم البياني ( "طرفية" نافذة) قبل وبعد photobleaching من. تواصل photobleaching من إذا كان فقدان إشارة أقل من 90٪.
      ملاحظة: تأكد من عدم ابيض وfluorophore المانحة خلال هذا الإجراء باستخدام مرشحات الإثارة AEM التي لا تتداخل مع الطيف الإثارة المانحة.
    2. الحصول على الانبعاثات المانحة تحت الإثارة المانحة مع fluorophore متقبل ابيض الآن (ماركا) لناجي نفس التكوين البصري بالنسبة لبورصة قطر في الخطوة 7.3.
    3. حساب QS لكل بكسل كما ماركا مقسوما AEM بعد تصحيح الخلفية، كما هو الحال في القسم 9 أدناه. QS = ماركا المانيا / AEM
    4. حساب متوسط ​​QS بين الخلايا من المعدلات الخلوية.
  2. تقدير كفاءة الحنق الأصيلة في التحقيق (المنظمة الدولية للتعليم) باستخدام عينة المعايرة. إحداث أقصى قدر ممكن الحنق لجنة التحقيق وحساب المنظمة الدولية للتعليم = 1 - أسهم / (AEM س QS) كما في القسم 9 أدناه. بدلا من ذلك، استخدام المنظمة الدولية للتعليم = CSE / AEM، أو المنظمة الدولية للتعليم تحسب باستخدام فحص نقطة النهاية التقليدية لكفاءة الحنق مع المنظمة الدولية للتعليم = 1 - (QE / ماركا).
    ملاحظة: هناك حاجة إلى المنظمة الدولية للتعليم لتحديد جزء المطلق للتحقيقات المنشط (FAP، أي جزء من تحقيقات الحليلة ملزمة)، ولكن ليس من الضروري لتحليل "النسبي" الحنق.
    1. تشبع استجابة التحقيق من خلال تحفيز الثقافة مع ناهض الحليلة الإنتاج / التنشيط لتحقيقات التي تزيد في الحنق على التفاعل مع تحليلها.
    2. تمنع التحقيق interactioن مع تحليلها باستخدام خصم من الإشارات للتحقيقات التي تقلل في الحنق على ربط تحليلها. ملاحظة: في حالة التحقيق ICUE1 وقمع مستويات المخيم مع مثبطات محلقة الأدينيل مثل 2 "، 5'-Dideoxyadenosine (محددة) أو 3-إيسوبوتيل ميثيل الكزانتين (غير محددة).

9. الحنق نسبة حساب

  1. رسم وتعيين منطقة واحدة من الفائدة (ROI) في فوف بالقرب من الخلايا لتحديد مستوى الخلفية (الشكل 3B) في كل مجال الرؤية مع مرور الوقت، ولكن تقييد العائد على الاستثمار في مجال الإضاءة متجانسة نسبيا على وسط الصورة (الشكل 4A ). الاطلاع على المناقشات لشرح خيارات التصحيح الخلفية.
    1. مع البرنامج المجهر: اختر السهم على "أيقونة خلفية العائد على الاستثمار" وحدد "رسم بيضاوي الشكل ROI الخلفية" (ستعمل الأشكال الأخرى). تأكد من أن "حافظوا على تحديث خلفية أوفست" يتم تحديد. تفعيل تتنافسجناح من العائد على الاستثمار الخلفية عن طريق النقر على أيقونة خلفية العائد على الاستثمار. بالتناوب، واستخدام "أيقونة العائد على الاستثمار" وخصائص العائد على الاستثمار النحو "كما استخدم العائد على الاستثمار الخلفية" و "رويس مختلفة في كل متعددة".
    2. مع يماغيج: استخدام شريط الأدوات لتحديد أداة رسم دائرية. ثم إضافة الشكل إلى مدير العائد على الاستثمار من خلال القائمة "تحليل → أدوات → مدير العائد على الاستثمار". تعيين لون مختلف عن العائد على الاستثمار خلفية في إدارة عائدات الاستثمار إذا رغبت في ذلك.
    3. لكل قناة فوف والصورة (على سبيل المثال، بورصة قطر وAEM)، وطرح متوسط ​​قيمة داخل ROI الخلفية في الوقت نقطة لخلق صورة تصحيح لكل قناة، على سبيل المثال، SQE ر، ع = QE ر، ص - bQE ر، ص حيث t هو اكتساب الوقت، ص هو فوف (أي موقف س ص)، وbQE وbAem هي القيم العددية للإشارة داخل ROI الخلفية. استخدام وظائف حسابية صورة متوفرة في البرنامج.
      1. Wإيث البرنامج المجهر، واستخدام "أيقونة ROI الخلفية" وحدد "خلفية طرح عن طريق العائد على الاستثمار". في النافذة المنبثقة، حدد "كل صورة" تحت عنوان "العائد على الاستثمار خلفية طرح على" وحدد "كافة إطارات" تحت عنوان "تطبيق على".
        ملاحظة: يجب أن يتم تعريف العائد على الاستثمار الخلفية في كل مجال الرؤية لهذه الوظيفة للعمل بشكل صحيح (على سبيل المثال، فإن وظيفة لا طرح صحيح الخلفيات لفوف مع رويس الخلفية إذا كان بعض فوف ديك رويس خلفية غير محددة).
      2. مع يماغيج، واستخدام "الطرح BG من العائد على الاستثمار" ماكرو كتبه مايكل Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
    4. حفظ السلاسل الزمنية تصحيح الصور عن طريق اختيار "حفظ باسم" لخطوات التحليل التالي.
  2. تحديد العائد على الاستثمار حول الخلية باستخدام قناع ثنائي لكل خلية قيد التحليل في كل مجال الرؤية (الشكل 4B). استخدام قناة AEM إلى عتبة الصورة في فوف في بداية سو التجربة، وتحديد حدود الخلية، وتعريف رويس. حفظ رويس.
    1. مع البرنامج المجهر: للحصول على كل إطار (أي فوف)، لأول مرة استخدام القائمة "ثنائي → تحديد عتبة" وحدد "تنطبق على الإطار الحالي". ضبط قيمة العتبة الدنيا لتحديد الخلايا. ثم استخدم "ثنائي → إغلاق" وظيفة لملء الثقوب في قناع ثنائي إذا لزم الأمر. بجانب استخدام رمز العائد على الاستثمار لتحديد "نسخ ثنائي إلى العائد على الاستثمار". يتم حذف طبقة ثنائية تلقائيا.
      1. إلحاق رويس لقطة لاحقة إلى التجمع الحالي للرويس. حذف أي رويس زائفة. التالي "بزر الماوس الأيمن فوق" على رويس والتأكد من خصائصها هي "استخدام وفقا لمعايير العائد على الاستثمار" و "رويس مختلفة في كل متعددة".
      2. مع يماغيج: لكل فوف، أولا استخدام القائمة "صورة → ضبط → عتبة". ثم استخدام "تحليل → تحليل الجزيئات" مع عرض الخطوط العريضة وإضافة إلى مدير المحدد. استعمال"ثنائي → إغلاق" لملء "الثقوب" في قناع ثنائي إذا لزم الأمر. حذف زائفة رويس. تتوفر لأتمتة هذه العملية الإضافات المجانية.
  3. حساب بورصة قطر على أساس نسبة الحنق في كل بكسل، SQE / صائم لتحليل النسبي (انظر الخطوة 10) و E QE = SQE / (QS س صائم) للتحليل المطلق (راجع الخطوة 10) مع QS تم الحصول عليها في الخطوة 8.1. استخدام العائمة تقسيم نقطة من الصور. راجع قسم نقاش لشرح من الاشتقاقات النسبة.
    1. مع البرنامج المجهر: استخدام القائمة "صورة عمليات → صورة" وحدد "النقطة العائمة".
    2. مع يماغيج: استخدام إما "عملية → صورة حاسبة" وظيفة أو "Calculator_Plus.java" المساعد. ملاحظة: بدلا من ذلك، الماكرو "pH_ratioMacro". TXT "يمكن تكييفها لحساب نسب الحنق ويعمل الماكرو تصحيح المعلومات الأساسية المبينة أعلاه ويتوفر في.
  4. تصدير متوسط ​​نسبة لكل خلية (أي في ROI) في جدول بيانات والرسوم البيانية البرمجيات.
    1. مع البرنامج المجهر: إما استخدام زر تصدير ND في "العائد على الاستثمار الاحصائيات" السيطرة تحليل أو الزر "جدول تصدير" في "وقت التحليل" السيطرة التحليل.
    2. مع يماغيج: أولا حدد القائمة "تحليل → تعيين القياسات" وتأكد من "قيمة المتوسط" و "الانحراف المعياري" يتم اختيار. ثم استخدم إدارة العائد على الاستثمار وحدد زر "القياس". حفظ نافذة النتائج التي تم إنشاؤها.

تحليل النسب 10. الحنق

  1. حساب متوسط ​​نسبة الحنق الخلوية مع مرور الوقت من متوسط ​​نسب لكل خلية (صدرت في الخطوة 9.4). النظر في الأساس الحنق نسب (نسبة قبل إدارة الحليلة) في هذا الحساب.
    يستخدم جدول وبرنامج الرسوم البيانية هنا لرسم خط الأساس subtr: مذكرةتصرف متوسط ​​نسب الحنق وخطأهم المعياري للمتوسط ​​(SEM) باستخدام الانحدار الخطي في الأساس كما في الخطوة 10.1.2 و10.1.3 أدناه (الشكلان 5 و 6).
    1. تحليل النسبي (حجم الاستجابة): تطبيع كل منحنى على عينة مرجعية مشتركة (على سبيل المثال، عينة غير المعالجة).
    2. تحليل المطلق (الوقت طبعا من الاستجابة): التحول منحنيات إلى نقطة بداية مشتركة من قبل تطبيع كل منحنى مع خط الأساس الحنق النسبة.
      1. في جدول البيانات والرسوم البيانية البرمجيات، تعشيق البيانات (الأعمدة من متوسط ​​نسب لكل خلية) مع أعمدة جديدة، بحيث كل عمود الأصلي يقترن عمود جديد يحتوي على بيانات نسبة الوحيدة لفترة الأساس (نسب، قبل ان يضيف تحليلها). حدد "إدراج عمود" لإدراج عمود فارغ بعد كل عمود من البيانات. ثم نسخ بيانات خط الأساس في أعمدة فارغة المقترنة.
      2. في جدول البيانات والرسوم البيانية البرنامج، حدد "إدراج → نيو تحليل → Transfoإزالة جمهورية مقدونيا خط الأساس "ثم قم بتعيين" العمود مختارة "إلى" كل الآخرين "، حدد" تولي الأساس هو الخطي "، وحدد" الفرق "تحت عنوان" حساب ".
      3. حساب متوسط ​​نسبة الخلوية والإحصاء الوصفي. في جدول البيانات والرسوم البيانية البرنامج، حدد "تحليلات XY إدراج → تحليل جديد → → الصف سائل مع SD أو SEM" ثم حدد "صف يعني مع وزارة شؤون المرأة" في نافذة منبثقة.

Representative Results

وقد أعدت كل السلائف، والخلايا، وقوالب الصب هيدروجيل كما هو موضح أعلاه. ويلقي الخلية حلول السلائف لادن في قوالب PDMS ثم طرد قبل دبق / photocrosslinking لشل حركة الخلايا بالقرب من ساترة وتسهيل الحنق تحليل التصوير (الشكل 1). وضعت الهلاميات المائية مع coverslips المرافق خلال مستعدة الآبار التصوير PDMS للتصوير المجهري (الشكل 2). ثم تم تعيين تكوينات بصرية والمعلمات الحصول على الصور كما هو مبين في الشكل 3A. ويتجلى القبض على كل قنوات الصورة ذات الصلة الحنق أربعة لCFP-YFP أزواج fluorophore (انظر تحت عنوان "أسيوط البصري." في الشكل 3)، كما هو مطلوب للتحقيقات غير الثنائية. ولكن في هذا العمل مطلوب اثنين فقط من الصور لسلسلة واحدة التحقيق ICUE1 ثنائي، QE = "CFP CFP" وAEM = "YFP YFP" (الانبعاثات الإثارة). FOVs متعددة (موقف س صوقد تم اختيار اللغات) التي عدة خلايا يقيمون داخل منطقة الإضاءة متجانسة (الشكل 3B). بعد اكتساب مرور الوقت، تم تصدير البيانات إشارة للتحقيق. رويس لتصحيح خلفية إشارات القناة ولتحليل الخلية كانت مخصصة باستخدام الصور AEM thresholded من بداية التجارب (الشكل 4). وقد تم اختيار الخلايا من بين تجمع الخلايا مثل تلك معربا كافية (لا قاتمة للغاية)، ولكن ليست عالية جدا (بشكل مفرط مشرق) تحقيق (الشكل 4B). حسبت بورصة قطر وSE الحنق نسب لكل بكسل في كل اكتساب باستخدام تقسيم الفاصلة العائمة من خلفية طرح قنوات الصورة. متوسط ​​نسبة الحنق في كل خلية (أي في ROI) تم حسابها، تطبيع إشارة خط الأساس قبل التحفيز (أي تراجع في الأساس تطرح من جميع نقاط الوقت)، وتآمر مع أشرطة الخطأ كما في الخطأ المعياري لل يعني (SEM). كل من بورصة قطر وCSE على أساس نسب الحنق ديTECT زيادة النشاط المخيم في غضروفية تحت التحفيز forskolin (100 نيوتن متر، الشكل 5). وكانت نسبة QE الحنق أكثر حساسية للتصويب خلفية من نسبة CSE الحنق لأن إشارة بورصة قطر كانت أقل نظرا لمستوى القاعدية انخفاض النشاط المخيم في غضروفية جزءا لا يتجزأ من داخل الهلاميات المائية. وأظهرت كلا النوعين هيدروجيل (TR-جل وPC-جل) زيادة في نسبة الحنق على مر الزمن (الشكل 6)، مما يدل على زيادة استجابة المخيم مما يشير إلى إضافة Forskolin. كما يتضح من نسبة QE الحنق، غضروفية في الهلاميات المائية PC-جل تظهر تغييرا أكبر في المخيم (كما هو موضح) ومستوى القاعدية أعلى من مخيم (E QE = 0.19 في PC-جل مقابل E QE = 0.09 في TR-جل، لا هو مبين في الشكل الأساس تطرح).

شكل 1
الشكل 1: توزيع الخلايا في Photocrosslinked هيدروجيل (PC-جل) تم طرد والسلائف الخلية محملة هيدروجيل لزيادة عدد الخلايا في طائرة الوصل بالقرب من ساترة: A. باء: وهذا يزيد من عدد الخلايا في مجال الرؤية ويقلل إشارة الخلفية من خارج الخلايا الطائرة. (مقياس بار = 200 ميكرون) الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: هيدروجيل في PDMS الصحن
وضعت هيدروجيل داخل PDMS طويل القامة أيضا (10X حجم هيدروجيل) مع قاعدة ساترة للتصوير المجهري والتحفيز تحليلها. الهلاميات المائية PC-جل شفافة والمستعبدين إلى ساترة بحيث تبقى في مكانها طوال الفحص. وPDMS بشكل جيد يمكن أن تكون أكبر لاحتواء 10X أكثر المتوسطة من حجم هيدروجيل باستخدام أوسع لكمة خزعة بالإضافة إلى فيhicker PDMS ورقة. (مقياس بار = 2 ملم) الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: تكوين لاكتساب الحنق التصوير
تم تكوين اقتناء لالتقاط صورة كل 7 ثوان في مواقع متعددة: A. لبورصة قطر الحنق نسبة الحساب، هناك حاجة إلى اثنين فقط من القنوات صورة للتحقيق ICUE1 المستخدمة هنا (ثنائي سلسلة واحدة التحقيق)، QE = "CFP CFP" وAEM = "YFP YFP" (الانبعاثات الإثارة) تحت عنوان "أسيوط البصرية". عمود في علامة التبويب λ من البرنامج المجهر. وقد تم اختيار FOVs ( "XY" المواقف) التي عدة خلايا يقيمون داخل منطقة الإضاءة متجانسة: B. المؤامرة أسفل الصورة يظهر شدة الإضاءة على طول الخط arrowed الأزرقأن يخترق من خلال مركز مجال الرؤية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: اختيار رويس لتحليل الحنق التصوير
وقد تم اختيار المنطقة ذات الاهتمام (ROI) خالية من الخلايا لتصحيح إشارة الخلفية على كل قناة: A. صورة من هيدروجيل خالية من الخلايا بدلا من ذلك قد يتم استخدامها لخلفية الطرح إذا كثافة الخلايا أو هجرة عالية، أو إذا لم يتم استخدام قناع التظليل عندما الخلايا التي لا تقع ضمن حقل الإضاءة متجانسة. ب: تم ​​تحديد رويس الخلية باستخدام العتبة الصورة وإخفاء ثنائي القناة AEM. اختيار العائد على الاستثمار أكبر من الخلايا سوف تؤثر سلبا على حساب متوسط ​​نسبة الحنق في الخلية نتيجة لإدراج نسب الخلية الناتجة عن خلفية نإيل دو فرانس. لا ينصح حساب نسبة الحنق الخلوية باستخدام متوسط ​​كل قناة لكل خلية لأن ذلك يقلل من نسبة. (مقياس بار = 50 ميكرون) الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: مقارنة بين نسب الحنق في Thermoresponsive هيدروجيل (TR-جل)
كل من بورصة قطر ونسب الحنق SE استنادا للكشف عن زيادة النشاط المخيم في غضروفية تحت التحفيز forskolin. Forskolin هو إنزيم ناهض أدينيل الذي يدفع إنتاج المخيم. الحنق يقلل عندما يتحد التحقيق ICUE1 المخيم، وبالتالي فإن نسبة QE الحنق (E QE = SQE / (صائم س QS)) يزيد. على العكس من ذلك، فإن نسبة SE الحنق تنخفض وبالتالي تآمرت كما E SE = 1 - CSE / صائم. في هيدروجيل جزءا لا يتجزأ من غضروفية، بورصة قطر Fنسبة RET هي أكثر حساسية لتصحيح الخلفية من نسبة SE الحنق لأن إشارة التسهيل الكمي منخفضة بسبب النشاط المخيم القاعدية منخفضة. أشرطة الخطأ = SEM، ن = 25. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: مقارنة نسبة الحنق في الهلاميات المائية المختلفة
ردت غضروفية في كلا النوعين هيدروجيل لتحفيز forskolin مع زيادة في النشاط المخيم كما يدل على ذلك زيادة نسبة QE الحنق على مر الزمن. آثار نوع هيدروجيل الاستجابة الخلوية من خلال العديد من الآثار، بما في ذلك الاختلافات في نفاذية لforskolin وفي النشاط المخيم الخلوي القاعدية (E QE = 0.19 في PC-جل مقابل E QE = 0.09 في TR-جل، لا تظهر). أشرطة الخطأ = SEM، ن لTR-جل= 25، ن لPC-جل = 15. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يوضح هذا العمل كيف الحنق التصوير يمكن استخدامها لتحليل الإشارات الخلوية في الهلاميات المائية 3D. في حين أن دراسات سابقة أظهرت الحنق التصوير الخلايا المزروعة على ركائز هيدروجيل 35-37، تفاعلات خارج الخلية مع الهلاميات 38، وجزيئات المحاصرين في الهلاميات المائية 39-41، وهذا هو أول نشر لوصف الحنق التصوير تحليل الخلايا استنادا الخلايا جزءا لا يتجزأ من داخل الهلاميات المائية 3D. العمل يحل عدة قضايا التنفيذ عند ترجمة الحنق التصوير من 2D إلى 3D. أولا، هناك حاجة إلى أهداف الفتحة العددية العالية للتصوير الحنق لجمع إشارة كافية في الانبعاثات، ولكنها تحد من عمق الميدان. يسمح للخلايا هنا ليستقر قليلا عن طريق الطرد المركزي لزيادة عدد الخلايا في طائرة الوصل بالقرب من الزجاج للتعويض عن ذلك. ثانيا، قد السقالات هيدروجيل 3D الانجراف عبر مجال الرؤية أثناء التصوير مما يعقد التحليل. الهلاميات المائية مستعبدين هنا إلى COVerslip بحيث تظل ثابتة في كافة مراحل التجربة. الثالثة، واختيار التراكيب هيدروجيل المناسبة ل3D الحنق أمر ضروري لالهلاميات المائية قد تعيق التصور من الخلايا. وتستخدم الهلاميات المائية الشفافة هنا من PC-جل وTR-جل. ومع ذلك، وجمع الخلايا مع الطرد المركزي إلى المستوى البؤري بالقرب من ساترة يمكن استخدامها لخلايا الصورة في الهلاميات المائية مع أعلى diffraction.The اختيار هيدروجيل يعتمد على الظروف المكروية التي يجب أن يكون محاكاة، والتي يمكن العثور عليها في الاستعراض على الهلاميات المائية 42 . رابعا، يعمل على حساب بديل هنا للحصول على نسبة الحنق من ICUE1 التحقيق سلسلة واحدة (أي، E QE = QE / الأرصاد الجوية للطيران) للحد من عدد من القنوات الصورة المطلوبة للتحليل، وبالتالي تقليل photobleaching من. يتم حساب متوسط ​​نسبة الحنق لكل خلية على أنه متوسط ​​النسب لكل بكسل داخل الخلية للحد من التقليل من نسبة الحنق الفعلية. وأخيرا، تحليل وسائل ratiometric الخطيلحساب جزء تفعيلها من سلسلة واحدة تحقيقات الثنائية يوصف.

هناك العديد من الجوانب الهامة في إجراء التجارب الحنق ناجحة باستخدام المجهر widefield. وفيما يتعلق الأجهزة، يجب أن تكون كاميرا حساسة بما يكفي لحل التغييرات إشارة صغيرة، وترك أحدث الكاميرات المكمل العلمية والإلكترون ضرب أجهزة المتقارنة بواسطة الشحنات مناسبة أفضل من أجهزة المتقارنة بواسطة الشحنات التقليدية. لتحليل أفضل التوزيع المكاني للنسبة الحنق، يجب على الكاميرا على الأقل تمتلك ضعف القرار المكانية وظيفة انتشار نقطة من الهدف (معيار نيكويست). وهذا يجعل النظم المزدوج عرض أقل ملائمة لهذه المهمة. أكثر أهمية هو تحديد التعرض وصورة معدل اقتناء المناسب للزوج الحنق معين وذلك لتقليل photobleaching من لfluorophores. ينصح معدل الاستحواذ انخفض مع زيادة مدة التجربة. استخدام عجلات مرشح السريعة يزيد من معدل اقتناء وعدد من FOVs للتحليل في حين تجنبجي القضايا تسجيل صورة مع ثنائي الرأي ومكعبات مرشح برج. مجال الإضاءة متجانسة يعقد تصحيح مضان الخلفية التي تنشأ من عينة تألق ذاتي والضوضاء نظام الكاميرا. بعض الهلاميات المائية، وخاصة تلك التي تحتوي على البروتينات الكولاجينية وautofluorescent غاية 43،44. والتقليل من نسب الحنق دون تصحيح الخلفية. نحن هنا توظيف خلفية بسيطة طريقة التصحيح التي تعتمد على مجال الإضاءة مسطحة نسبيا والتي كثيرا ما يمكن تكوينها مع الإضاءة برنامج التحصين الموسع ومضان على وسط الصورة (الشكل 3B، الخطوة 7.2). ولهذه الطريقة يقيد خلايا الفائدة لتلك في هذا المجال الإضاءة. تصحيح المعلومات الأساسية المبينة هنا لا يأخذ في الحسبان تألق ذاتي الخلوية في موجات قراءة للتحقيق الثنائية. في مثل هذه الحالة، والخلايا غير المسماة (أي تحقيق ترنسفكأيشن) ينبغي تصوير تحت نفس الظروف والخلفية تطرح. ومالتاسع من الخلايا المسمى وغير المسماة يمكن استخدام والخلايا غير المسماة اختيارها لROI الخلفية. الطرق البديلة التي تنص على تحليل الخلية على حقل صورة كامل على استخدام قناع التظليل، متعددة رويس الخلفية، أو عينات مماثلة من دون الخلايا وبروتوكول متاحة عند الطلب.

محددة لتصوير 3D الحنق، استجابة التحقيق حساسة جدا للنفاذية هيدروجيل إلى الحليلة (الشكل 6). لذلك تتم مقارنة المناطق هيدروجيل نفسها عبر العلاجات التجريبية، ويفضل عند نقطة التناظر الهندسي مثل بالقرب من مركز سقالة المستخدمة هنا. بدلا من ذلك، غرف الموائع الدقيقة / يجوز استخدام المفاعلات الحيوية إلى بسرعة وبشكل موحد يروي هيدروجيل مع حل الحليلة 45. قد لا يتم الكشف عن إشارة الحنق (إشارة إلى نسبة الضوضاء منخفض جدا) عندما تألق ذاتي هيدروجيل مرتفع جدا. وينبغي أن تستخدم هيدروجيل أرق أو التحقيق المختلفة (fluorophores مختلفة).وفيما يتعلق التصوير 3D الحنق في الهلاميات المائية photocrosslinked، فمن المستحسن استخدام الحد الأدنى من التعرض للإشعاع وموجات خارج أطياف الإثارة من fluorophores التحقيق. ويمكن استخدام LAP مع مصدر الضوء المرئي في 405 نانومتر إلى مزيد من تقليل تلف الخلايا المحتمل 31،46. ومع ذلك، ينصح باستخدام LAP مع 365 نانومتر التشعيع لأن هذا يقلل تبيض التحقيق. 365 نانومتر يكمن في نهاية الذيل من الإثارة الطيف CFP المانحة، في حين أن 405 نانومتر تقع في ذروة الإثارة. بدلا من ذلك، يمكن أن يسمح التعبير التحقيق لاستعادة ليوم واحد. استخدام تحقيقات الثنائية يقلل القضايا حساسية للاختلافات في مستويات التعبير ونشر الجزيئي للالمانحة ومتقبل fluorophores. ويمكن استخدام المجسات غير الثنائية، ولكن مع SE بدلا من التصوير بورصة قطر وتصحيح إضافي لطيفي تنزف من خلال الإثارة وانبعاث الطيف (أنظر أدناه). وعلاوة على ذلك، توفر التجاري منخفض والتعقيد في تصميم تحقيقات الحنققد يكون عائقا. العامل الأكثر أهمية للتجارب ناجحة يبقى التصحيح السليم وتحليل الاشارات مضان.

ويستخدم لحساب بديل من نسبة الحنق لعدة أسباب إضافية إلى جانب التقليل من photobleaching من. لتحقيقات سلسلة واحدة ثنائية، نسبة شيوعا هي الانبعاثات متقبل تحت الإثارة المانحة (توعية الانبعاثات، SE) إلى انبعاث المانحة تحت الإثارة المانحة (مروي الانبعاثات، QE)، أي الحنق نسبة = SE / QE 25،47،48. SE / QE هو غير الخطية نسبة إلى تغييرات في كفاءة الحنق 21،22،47. وهي نسبة لها علاقة بشكل كبير غير الخطية لكفاءة الحنق الأصيلة في التحقيق (المنظمة الدولية للتعليم) (Donius، AE، Taboas، JM عمل غير منشور. (2015))، مع نسبة معظم الخطية لالمنظمة الدولية للتعليم أقل من ما يقرب من 15٪. سوف SE / QE نقلل أيضا جزء من تحقيقات المنشط (FAP، أي جزء من تحقيقات تحليلها ملزم). Therefoإعادة، تحليل SE / QE يتطلب التوازن جرعة مرهقة دراسة استجابة ومنحنى مناسبا. لحسن الحظ، ونسب SE أو التيسير الكمي إلى انبعاث متقبل تحت الإثارة متقبل (AEM) هي الخطية فيما يتعلق المنظمة الدولية للتعليم وFAP، أي نسب الحنق SE / AEM وQE / AEM. وكثيرا ما يستخدم SE / AEM لتحقيقات الثنائية ويتطلب فقط معايرة نقطة النهاية (في أي نشاط التحقيق والنشاط التحقيق الكامل)، ولكن الإشارات الخلوية القاعدية يجعل ذلك صعبا. للقضاء على الحاجة لمعايرة نقطة النهاية، SE يمكن تصحيحه (CSE) لتداخل الأطياف من الجهات المانحة والإثارة متقبل والانبعاثات أطياف (الطيفي تنزف من خلال) والعائد الكم والحساسية الطيفية (QS) من fluorophores التحقيق جنبا إلى جنب والمجهر نظام التصوير. نسبة SE الحنق تصحيح على أساس CSE تحدد كفاءة الحنق لاحظ من تحقيقات في كل بكسل من الصورة، أي E SE = CSE / AEM. البرمجيات التجارية ومجانية متاحة لتصحيح SE لهذه الآثار ويشار إلى القارئ إلى العمل تشن وPeriasamy 2006 للحصول على شرح مفصل للطرق 50. ومع ذلك، وحساب E SE يتطلب القبض على ثلاثة قنوات الصورة في الوقت نقطة (SE، بورصة قطر، AEM). لذلك، في هذا العمل كما قمنا بتوظيف نسبة الحنق بديلة E QE = 1 - أسهم / الأرصاد الجوية للطيران، الأمر الذي يتطلب القبض على اثنين من قنوات الصورة فقط (QE وAEM). حساب QE E من هذه القنوات لا يتطلب سوى تصحيح AEM لQS (الأرصاد الجوية للطيران = AEM س QS). ويقدر QS = ماركا المانيا / AEM بسهولة باستخدام اثنين من الصور من العينة معايرة واحدة، حيث ماركا هو انبعاث المانحة تحت الإثارة المانحة مع ابيض متقبل. ويندرج في أي لحظة يمكن أن تحسب بمقارنة E SE أو E بورصة قطر إلى المنظمة الدولية للتعليم من التحقيق.

في نهاية المطاف، الحنق اختيار نسبة (E SE = CSE / AEM مقابل E QE = QE / الأرصاد الجوية للطيران) ينبغي أن تقوم على النظر في نوع التحقيق والقنوات مع أفضل إشارة. على حد سواءتشمل pproaches خلفية تصحيح الضجيج من الصور في الإطار كما هو موضح أعلاه لمراعاة التغييرات في تألق ذاتي مع مرور الوقت. أنها تفترض أي تداخل من AEM ضوء الإثارة في الطيف الإثارة ماركا المانيا، كما هو الحال المستحقة للتحقيق في تصميم والمجهر مرشح التكوين في كثير من الأحيان. يمكن تحقيقات واحدة سلسلة استخدام أي ويستند الاختيار على أفضل إشارة التحقيق (السطوع) للضوضاء الكاميرا وإشارة أساسية عن SE وقنوات التسهيل الكمي. لجنة التحقيق ICUE1 والظروف التجريبية المستخدمة هنا (الخلية وهيدروجيل أنواع)، SE لديه إشارة أقوى من التيسير الكمي. تتطلب تحقيقات مزدوجة سلسلة استخدام E SE بسبب التوزيع غير متساوي المولية من الجهات المانحة ومتقبل fluorophores. للتحقيقات التي تقلل في الحنق على ملزم تحليلها مثل ICUE1، الحنق الكفاءة يمكن أن يكون "مقلوب" لتقديم تغيير الإشارات الإيجابية على ربط تحليلها كما نفعل هنا، مع E SE = 1 - CSE / AEM أو E QE = QE / (AEM س QS).

تحليل الالبريد يندرج حساس للتصويب السليم للنسب الحنق والتقدير من المنظمة الدولية للتعليم. يمكن تقدير مع نفس العينة المعايرة تستخدم لQS ونقطة النهاية التقليدية الحنق فحص الكفاءة كما المنظمة الدولية للتعليم = 1- (QE / ماركا المانيا) (صورة QE تليها photobleaching من متقبل وصورة ماركا المانيا) 28، ولكن يجب الحرص على تقليل تبيض عرضية من الجهة المانحة. نحن تصف نسخة معدلة حيث يتم استبدال تقدير ماركا استنادا AEM تعديل لQS، أي المنظمة الدولية للتعليم = 1 - (QE / (AEM س QS)). بالتناوب، المنظمة الدولية للتعليم = CSE / AEM يمكن استخدامها. يتطلب تقدير المنظمة الدولية للتعليم في الخلايا الحية أن يكون الدافع وراء كل تحقيقات لالحنق الكامل. وهذا أمر يصعب تحقيقه عمليا للتحقيقات، مثل ICUE1 التي تقلل في الحنق على ربط تحليلها. لحساب في المختبر على أساس من المنظمة الدولية للتعليم باستخدام الخلية لست] وتحليلها النقي هو أفضل، ولكن خارج نطاق هذا العمل. نحن هنا ننصح باستخدام 2 "، 5'-Dideoxyadenosine لتقليل المخيم في الخلايا. ومع ذلك، يجوز للFAP النسبي بالبريد حسابها باستخدام تقديرات المنظمة الدولية للتعليم المستمدة من مستوى خط الأساس من الإشارات. لهذه الأسباب، دراسات في معظم الأحيان بالإبلاغ عن نسبة الحنق (كما فعلت هنا) أو ما يندرج النسبي على أساس المعايرة نقطة النهاية، حيث الأساس يشير قبل إضافة ناهض هو الأدنى وإشارة بعد إضافة ناهض الثاني الذي يشبع الإشارات هي العليا مقيد. وكثيرا ما يستخدم Forskolin كما ناهض التحكم لتشبع إشارة المخيم. بدلا من ذلك، يمكن استخدام التناظرية المخيم مثل 8 Bromoadenosine 3 "، الأدينوزين 5'-دوري. ينصح الضوابط الإيجابية المستخدمة عند الانتهاء من الدراسات لتحديد التغييرات المحتملة في مسار الإشارات بين علاجات تجريبية.

حساب متوسط ​​استجابة الإشارات لكل خلية يتطلب النظر في عدة عوامل. أولا، يجب أن يحسب متوسط ​​نسبة الحنق على أنه متوسط ​​النسب في كل بكسل داخل الخلية، أي (Σ (QE/cAem)) / (عدد البكسل)، بدلا من راتيو من متوسط ​​بورصة قطر وAEM في خلية، أي (ΣQE) / (ΣcAem). على الرغم من أن هذا الأخير لا يحتاج اخفاء دقيق ضجيج منخفض، فإنه يقلل كثيرا من متوسط ​​الحقيقية نسبة الحنق. ومع ذلك، نسب بكسل تتطلب حساب الفاصلة العائمة واخفاء ثنائي دقيق لمساحة الخلية لتحديد رويس وتجنب إدراج نسب زائفة الناتجة عن الضوضاء الخلفية خارج الخلية. يجب أن يكون كميا المنطقة الخلية بأكملها لتجنب يتحامل النتائج على شكل الخلية. قد يحتاج اخفاء إلى إعادة تعريف بمرور الوقت اعتمادا على التغييرات في شكل الخلية والهجرة. بالتناوب، رويس أكبر من الخلايا يمكن استخدامها في حالة عدم تعريف معايير الاستبعاد لإزالة نسب بكسل من التيسير الكمي وإشارات AEM التي تقع أقل بكثير من مستويات الخلايا وتكون مستويات الخلفية القريب. ووصف أساليب التحليل بالتفصيل الخطوات الأساسية المستخدمة في هذا العمل لتحليل الحنق بدون برامج / الإضافات المتخصصة. المصنعين المجهر وغيرها من البائعين بيع إضافة على وحدةالصورة للبرمجيات المجهر، والتي تدعم ratiometric الآلي والحنق التحليل. وبالمثل، فإن برنامج ImageJ المجال العام لديها العديد من الإضافات المتاحة للالجسيمات وتحليل الحنق، مثل RiFRET. وثانيا، فإن متوسط ​​نسبة الحنق بكسل القائم تقلل من شأن متوسط ​​نسبة حقيقية من الهيكل الخلوي 3D لأنه يستخدم صورة 2D. إشارات 2D تمثل والمتوسط ​​على طول محور ض. حساب التوزيع المكاني 3D نسب الحنق في الخلايا الحية غير ممكن دون سرعة عالية التصوير 3D (على سبيل المثال، باستخدام الغزل القرص المجهري متحد البؤر). هذه هي مشكلة لكل من 2D و 3D الثقافات، ولكن له تأثير أكبر في 3D كما أكثر من الهيكل الخلوي موجودا من الطائرة. هذا هو مصدر قلق كبير للتحقيقات أن توطين الهياكل الخلوية، مثل غشاء البلازما EPAC1 التحقيق مساء ICUE. انظر Spiering وآخرون. 2013 للحصول على اقتراحات لتصحيح آثار سمك خلية في حسابات نسبة 24. تحليل توزيع AEM يمكن استخدامها لالكشف عن حالة يتراكم التحقيق في مناطق الطائرة الخلية والتصوير تعديل. وهذا سوف يساعد أيضا في تفسير التوزيع المكاني للنسب الحنق والقضاء على نتائج زائفة، على سبيل المثال، تحديد مسبار التشبع (أي سوف منطقة AEM منخفضة يكون تركيز التحقيق منخفضة ويمكن أن يحمل التشبع التحقيق ونسبة الحنق عالية). قد تشير مختلف المستويات الثالثة، الحنق خط الأساس فرق في كفاءة ترنسفكأيشن، تسبر التعبير، أو إشارات القاعدية بين المجموعات التجريبية. "تحليل نسبي" (الخطوة 10.1.1) يساعد على إزالة الانجراف في نسبة الحنق على مر الزمن إذا كان موجودا. فهو يسهل المقارنة بين حجم النسبي لاستجابات بين العينات، ولكن يعوق بالمقارنة مع الوقت طبعا الاستجابة لعينة مرجعية (مراقبة المؤامرة هي على خط مستو). "تحليل المطلق" (الخطوة 10.1.2) يسهل المقارنة بين معدل استجابة عبر العينات، ولكن يعوق المقارنة بين حجم الاستجابة ليتم تحجيم كل سطر من قبل dissimثابت ILAR. وغالبا ما تستخدم دراسات الانحدار الخطي على خط الأساس لتصحيح الانحراف في نسبة الحنق على مر الزمن.

طريقة 3D الحنق وصفه هو وسيلة مفيدة وعملية لصنع وتنفيذ الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الهلاميات المائية 3D لادن، والتي يمكن تطبيقها لتحقيقات أخرى وطرائق التصوير. وغيرها من نظام الحنق إلى جانب سلسلة واحدة تحقيقات الثنائية تتطلب المزيد من تصحيح معقدة من الإشارات كثافة القائمة على النحو المذكور أعلاه. بالتناوب، مضان العمر التصوير من الحنق (FLIM-الحنق) يمكن أن تستخدم لحساب الكفاءة الحنق عن طريق التغيير في حياة الانبعاثات من الجهات المانحة التحقيق. على عكس الحنق كثافة مقرها، FLIM-الحنق غير حساس للضجيج في الخلفية، الطيفي تنزف من خلال والكفاءة الكم، وكشف عن الحساسية الطيفية 2. ومع ذلك، نظم فليم مكلفة ومعقدة، وغير المألوف، وتعمل بشكل أفضل مع fluorophores مع تسوس الأس واحد وليس FLIM الاعادة 49. ويمكن أيضا أن تستخدم الطريقة الموصوفة مع موإعادة منصات المجهر المتقدمة (على سبيل المثال، الحنق، TIRF، تباين مضان، والأطياف الحنق الارتباط). إن تطبيق هذه الطريقة لتصوير 3D مع سرعة عالية متحد البؤر والفحص المجهري multiphoton تسهيل تحليل التوزيع الفرعية الخلوي للاستجابة الإشارات وزيادة دقة مما يشير التحليل. وهذه الطريقة سوف 3D الحنق تمكن دراسات بيولوجيا الخلايا المتقدمة في microenvironments الخلوية 3D المحاكاة. على هذا النحو، ويمكن تطبيقه بسهولة إلى الأدوية والاحتياجات الطب التجديدي، بما في ذلك دراسة الإشارات بين الخلايا وفحص الاستجابة للدواء في microtissues القائم هيدروجيل هندسيا.

Acknowledgments

المؤلفون تقر بدعم مالي من كلية طب الأسنان في جامعة بيتسبرغ، والمعاهد الوطنية للصحة جائزة K01 AR062598، وDE030740 منحة P30. أشكر الكتاب أيضا الدكتور جين تشانغ لالبلازميد ICUE1، واين Rasband لتطوير يماغيج ومايكل Cammer للماكرو يماغيج.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1,000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 ml, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ = 365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , Elsevier. (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. Capri, A. , InTech. Europe. 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Nagamune, I. E. 119, Springer. Berlin Heidelberg. 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators - Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002 (2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X. Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. Burdick, J. A., Mauck, R. L. , Springer-Verlag. 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , PCT/US2006/028417 (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170 (2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 114، ميكروفلويديك، microtissue، مضان، فورستر، سقالة، البولي ايثيلين جلايكول، هيدروجيل، الحنق، مما يشير الى داخل الخلايا، غضروفية
الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donius, A. E., Bougoin, S. V.,… More

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter