Summary
Мыши производят сложный многосложный репертуар ультразвуковых вокализаций (USV). Эти USVs широко используются как считывания для нейропсихиатрических расстройств. Этот протокол описывает некоторые из методов, которые мы изучили и разработали, чтобы последовательно побуждать, собирать и анализировать акустические характеристики и синтаксис песен мыши.
Abstract
Мыши производят ультразвуковые вокализации (USV) в различных социальных контекстах на протяжении всего развития и взросления. Эти USVs используются для поиска материнских щенков 1 , несовершеннолетних взаимодействий 2 , противоположных и однополых взаимодействий 3 , 4 , 5 и территориальных взаимодействий 6 . В течение десятилетий USV использовались исследователями как прокси для изучения нейропсихиатрических и пороков развития или поведенческих расстройств 7 , 8 , 9 и более недавно для понимания механизмов и эволюции голосового общения среди позвоночных 10 . В рамках сексуальных взаимодействий взрослые самцы-мыши производят песни USV, которые имеют некоторые черты, похожие на ухаживающие песни певчих птиц 11 . Использование такого многосложного репераToires могут увеличить потенциальную гибкость и информацию, которую они несут, поскольку они могут варьироваться в том, как элементы организованы и объединены, а именно синтаксис. В этом протоколе описан надежный метод получения песен USV от мышей-самцов в различных социальных контекстах, таких как воздействие свежей женской мочи, обезболиваемых животных и самок эструса. Это включает в себя условия, чтобы вызвать большое количество слогов от мышей. Мы уменьшаем запись окружающих шумов с недорогими звуковыми камерами и представляем метод количественного определения, чтобы автоматически обнаруживать, классифицировать и анализировать USV. Последний включает оценку скорости вызова, речевого репертуара, акустических параметров и синтаксиса. Описаны различные подходы и понимание использования воспроизведения для изучения предпочтений животных к конкретным типам песен. Эти методы были использованы для описания акустических и синтаксических изменений в разных контекстах у мышей-самцов и предпочтений в песнях у самок мышей.
Introduction
Относительно людей мышей производят как низкочастотные, так и высокочастотные вокализации, позже известные как ультразвуковые вокализации (USV) выше нашего слухового диапазона. USVs производятся в различных контекстах, в том числе от извлечения материнского щенка, ювенильных взаимодействий, до противоположных или однополых взрослых взаимодействий 4 , 12 . Эти USV состоят из разнообразного многосложного репертуара, который можно классифицировать вручную 9 или автоматически 10 , 11 . В последние годы роль этих USV в общении постоянно растет. К ним относятся использование USV в качестве считывания мышиных моделей нейропсихиатрических, пороков развития или расстройства поведения 7 , 8 и внутренних мотивационных / эмоциональных состояний 13 . Предполагается, что USVs передают достоверную информацию оСостояние миттера, которое полезно для приемника 14 , 15 .
В 2005 году Holy and Guo 11 выдвинули идею о том, что взрослые самцы мышей USV были организованы как последовательность многосложных элементов вызова или слогов, похожих на певчих птиц. У многих видов многосложный репертуар позволяет эмиттеру комбинировать и упорядочивать слоги разными способами, чтобы увеличить потенциальную информацию, передаваемую песней. Считается, что вариации в этом синтаксисе имеют этологическое значение для сексуального поведения и предпочтений супругов 16 , 17 . Последующие исследования показали, что самцам мышей удалось изменить относительный состав слогов, которые они производят до, во время и после присутствия самки 5 , 18 . То есть, взрослые самцы мышей используют свои USV для поведения ухаживания, чтобы привлечьИли поддерживать тесный контакт с самкой, или для облегчения спаривания 19 , 20 , 21 . Они также испускаются в отношениях между мужчинами и мужчинами, вероятно, для передачи социальной информации во время взаимодействий 4 . Чтобы зафиксировать эти изменения в репертуаре, ученые обычно измеряют спектральные характеристики (акустические параметры, такие как амплитуда, частоты и т. Д.), Количество слогов USV или вызовов и латентность к первому USV. Однако, немногие фактически смотрят на динамику последовательности этих USVs подробно 22 . Недавно наша группа разработала новый метод измерения динамических изменений в слогах слога USV 23 . Мы показали, что порядок слога внутри песни (а именно синтаксис) не является случайным, он изменяется в зависимости от социального контекста и что слуховые животные обнаруживают эти изменения как имеющие отношение к этиологии.
Заметим, чтоУ многих исследователей, изучающих связь с животными, не придают термину «синтаксис» такое же точное значение, как синтаксис, используемый в человеческой речи. Для исследований общения с животными мы просто подразумеваем упорядоченную, неслучайную последовательность звуков с некоторыми правилами. Для людей, кроме того, известно, что определенные последовательности имеют конкретные значения. Мы не знаем, так ли это для мышей.
В этом документе и связанном с ним видео мы стремимся предоставить надежные протоколы для регистрации USV-ов ухаживающих мышей у мужчин в различных контекстах и воспроизведения. Использование трех последовательно используемых программных средств для: 1) автоматизированных записей; 2) обнаружение и кодирование слога; И 3) глубокий анализ особенностей слога и синтаксиса демонстрируется ( рис. 1 ). Это позволяет нам узнать больше о структуре и функции USV мышей. Мы считаем, что такие методы облегчают анализ данных и могут открыть новые горизонты в характеристике нормального и ненормального голосового общения в mouSe моделей общения и нейропсихиатрических расстройств, соответственно.
Protocol
Заявление о соблюдении этики: Все экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных при Университете Дьюка в соответствии с протоколом № A095-14-04. Примечание. Подробные сведения об используемом программном обеспечении см. В таблице 1 в разделе « Материалы и оборудование ».
1. Стимулирование и запись мышей USVs
- Подготовка самцов перед сеансами записи
ПРИМЕЧАНИЕ. Репрезентативные результаты были получены с использованием молодых взрослых самцов B6D2F1 / J (возраст 7-8 недель). Этот протокол может быть адаптирован для любого штамма.- Задайте световой цикл комнаты для животных в течение 12-часового цикла свет / темнота, если не требуется иное. Следуйте стандартным правилам проживания от 4 до 5 самцов в клетке, если это не требуется или не требуется. За три дня до записи, разоблачайте самцов индивидуально половозрелой и восприимчивой самке (до 3 самцов с одной самкой в клетке) одного и того же штамма в течение ночи.
- На следующий день убираемЖенщина из клетки мужчины и дом мужчин без женщин, по крайней мере за два дня до первой сессии записи увеличить социальную мотивацию петь (на основе наших проб и ошибок anecdotal анализов).
- Подготовка ящиков для записей
- Используйте охладитель пляжа (внутренние размеры L 27 x W 23 x H 47 см), чтобы действовать как студия звукоизоляции ( рисунок 2A ). Просверлите небольшое отверстие сверху коробки, чтобы пропустить провод микрофона.
ПРИМЕЧАНИЕ. Запись животных в ослабленной звуковой и визуально изолированной среде является предпочтительной, чтобы записывать десятки мышей сразу, без их слуха или наблюдения друг за другом, предотвращать запись загрязнений окружающего оборудования в помещении и людей в комнате и получать чистую Звуковые записи мышей ( рис. 2В ). Мы не отметили звуковые эхо или искажения звука при сравнении вокализации одной и той же мыши внутри и вне tЗвуковая камера ослабления ( рис. 2С ); Скорее, там звуки могут быть громче и иметь меньше гармоник внутри камеры. - Подключите микрофон к проводу, провод к звуковой карте и звуковую карту к компьютеру для работы с программным обеспечением для записи звука ( например, программное обеспечение A на рисунке 1 и в таблице 1 ). Необходимо соответствующее программное обеспечение звукозаписи, например программное обеспечение A, которое генерирует звуковые файлы .wav.
- Поместите пустую клетку (58 x 33 x 40 см) в звуконепроницаемую коробку и отрегулируйте высоту микрофона так, чтобы мембрана микрофона находилась на 35-40 см выше дна клетки и чтобы микрофон находился над клеткой ( См. Рис. 2А ).
- Используйте охладитель пляжа (внутренние размеры L 27 x W 23 x H 47 см), чтобы действовать как студия звукоизоляции ( рисунок 2A ). Просверлите небольшое отверстие сверху коробки, чтобы пропустить провод микрофона.
- Конфигурация программного обеспечения записи A ( Таблица 1 ) для непрерывной записи
- Двойной щелчок и откройте программное обеспечение A. Нажмите и откройте меню «Конфигурация» и выберите Device named, Частота дискретизации (250 000 Гц), формат (16 бит).
- Выберите ключ «Триггер» и установите флажок «Переключить».
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот параметр позволяет начать запись, нажав клавишу (F1, F2 и т. Д.), Помещая стимул в клетку мыши. - Введите идентификатор мыши в параметре «Имя».
- Установите максимальный размер файла в нужные минуты записи (обычно мы устанавливаем 5 минут).
ПРИМЕЧАНИЕ. Чем больше минут, тем больше требуется памяти компьютера. Если непрерывный режим не установлен, программное обеспечение отключает отступы песни в начале или конце последовательности на основе заданных параметров, и поэтому невозможно надежно определить количество последовательностей.
- Запись USVs с использованием разных стимулов. Примечание. Каждый стимул может использоваться независимо в зависимости от экспериментальных потребностей пользователя.
- Осторожно поднимите животное, которое должно быть записано хвостом, и поместите его в клетку без постельных принадлежностей (чтобы предотвратить мовШум в постели) в звуконепроницаемой коробке, и положите на него крышку открытой металлической крышки сверху, при этом крышка должна быть обращена вверх.
- Закройте коробку с ослабленным звуком и дайте животному привыкнуть к ней в течение 15 мин. Проведите подготовку стимулов (1.4) в этот момент.
- Подготовка стимуляторов
- Приготовление образцов свежей мочи (UR) в качестве стимула
- Получите образцы мочи не более чем за 5 минут до начала сеанса записи, чтобы обеспечить максимальный эффект при наведении песни у мужчин. ПРИМЕЧАНИЕ. Моча, которая сидит дольше, особенно часами или в ночное время, не так эффективна 24 , 25 , что мы проверили эмпирически 23 .
- Выберите женщину или мужчину (в зависимости от пола стимула, который будет использоваться) в одной клетке, возьмите кожу за шею и сдержите животное в одной руке, как для процедуры инъекции наркотиков с выставленным животом.
- Затем выберите другую клетку. И повторите ту же самую процедуру с другой женщиной или мужчиной, но с тем же самым хлопковым наконечником, который использовался ранее.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эта процедура позволяет смешивать мочу, по меньшей мере, двух самок или самцов из двух независимых клеток на одном и том же хлопчатобумажном кончике для защиты от любого течки или других индивидуальных эффектов, поскольку известно, что цикл течки может влиять на поющее поведение 18 , 26 . - Поместите хлопковый наконечник в чистую стеклянную или пластиковую чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ. Так как наконечник хлопка с мочой необходимо будет использовать в течение следующих 5 минут, нет необходимости покрывать его, чтобы предотвратить испарение.
- препараты вНа живого женского (FE) стимула в качестве стимула
- Выберите одну или две новые клетки половозрелых самок. Определите женщин в стадии проструса или эструса путем визуального осмотра (широкое раскрытие влагалища и розовое окружение, как показано в 27 , 28 ). Разделите их в другой клетке до использования.
- Приготовление анестезированных животных самки (AF) или самцов (AM) в качестве стимула
- Для AF выберите женщину из пула выше (либо в про-тесту, либо в течке). Для AM выберите самец из клетки взрослых самцов мышей.
- Обезболить женщину или мужчину внутрибрюшинной инъекцией раствора кетамина / ксилазина (100 и 10 мг / кг соответственно).
- Используйте глазную мазь, чтобы предотвратить обезвоживание глаз, в то время как животное подвергается анестезии. Проверяйте правильную анестезию, проверяя рефракцию отталкивания лапы при ущемлении. Поместите обезболивающее животное в чистую клетку на бумажное полотенце, остроумиеЧ клетка на тепловой подушке установлена на «минимальную температуру» для обеспечения контроля температуры тела.
- Повторно используйте тех же животных до 2-3 раз для разных сеансов записи, если необходимо, прежде чем они проснутся (обычно около 45 минут). Положите их обратно на тепловую подушку после каждого сеанса записи.
- Контролируйте частоту дыхания визуальным осмотром (~ 60 - 80 вдохов в минуту) и температурой тела, прикасаясь к животному каждые 5 минут (должен быть теплым на ощупь).
- Когда будете готовы к записи, нажмите кнопку «Запись» программного обеспечения A.
ПРИМЕЧАНИЕ. Записи не будут запускаться, если пользователь не нажмет кнопку, связанную с каждым каналом; Следить за живым звуковым потоком из клеток на экране компьютера, чтобы убедиться, что животные поют и записи получают должным образом. - Одновременно нажмите соответствующую кнопку с нужным полем для записи ( т.е. F1 для блока 1) и введите желаемый стимул.
- Представьте один из стимулов следующим образом. Поместите хлопковый наконечник свежими образцами мочи внутрь клетки или поместите живую самку в клетку или поместите одного из анестезированных животных (AF или AM) поверх металлической крышки клетки.
- Осторожно закройте коробку записи и дайте записи пройти заданное количество минут ( например, 5 минут, как описано в разделе 1.3).
- После завершения записи нажмите красную кнопку «стоп-квадрат», чтобы остановить запись.
- Если в качестве стимула использовалось наркотизированное животное, откройте звукоизолирующий ящик для записи, выведите обезболиваемое животное из металлической крышки клетки и положите его на грелку перед следующим сеансом записи или, если больше не используете животное в качестве стимула Это каждые 15 минут, пока он не восстановил достаточное сознание, чтобы сохранить грудинку.
- Откройте клетку и удалите сознательное тестовое животное, и поместите его обратно в свою клетку. Очистите тест-клетку 70% -ным спиртом aДистиллированной воды.
- Приготовление образцов свежей мочи (UR) в качестве стимула
2. Обработка WAV-файлов и кодирование Syllable с помощью Mouse Song Analyzer v1.3
- Откройте программу для кодирования B ( Рисунок 1 , Таблица 1 ) и поместите папку, содержащую Сценарий программного обеспечения C в «Mouse Song Analyzer» ( рисунок 1 , Таблица 1 ), в путь к программному обеспечению B, нажав «установить путь» и добавив папку в программное обеспечение B. Затем закройте программное обеспечение B для сохранения.
- Настройте параметры идентификации слога в сочетании с программным обеспечением B + C. ПРИМЕЧАНИЕ. Программный код сценария C автоматически создает новую папку «сонограммы» с файлами в формате .sng в той же папке, где находятся файлы .wav. Как правило, лучше всего поместить все WAV-файлы из одного сеанса записи, созданного с помощью программного обеспечения A, в одну и ту же папку.
- Откройте программное обеспечение B, настроенное с помощью C.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эта версия программного обеспечения B полностью cOmpatible с программным скриптом C. Не может быть гарантировано, что любые более поздние версии будут принимать все функции, включенные в текущий код. - Перейдите в интересующую папку, содержащую записываемые WAV-файлы, которые нужно проанализировать, используя окно «текущей папки».
- В «командном окне» введите команду «whis_gui».
- В новом окне whis-gui наблюдайте несколько разделов суб-окна с различными параметрами ( рис. 3 ), включая «Параметры сонограммы», «Параметры свистка» и все остальные. Настройте параметры для обнаружения USV. Используйте следующие параметры для определения слогов USV от лабораторных мышей ( например, штаммы мыши B6D2F1 / J и C57BL / 6J, используемые в наших исследованиях):
- В разделе « Параметры сонограммы» отрегулируйте минимальную частоту до 15 000 Гц, максимальную частоту до 125 000 Гц, частоту дискретизации ( количество частот ) tO 256 кГц, а пороговое значение - 0,3.
- В разделе « Параметры свистка» настройте порог чистоты на 0,075, минимальную длительность слога до 3 мс, развертку с минимальной частотой до 20 000 Гц и длительность фильтра до 3 мс.
- В других разделах отрегулируйте продолжительность минимальной ноты на 3 мс, а минимальное количество нот - на 1.
- Для протокола классификации слогов выберите поля в средней части окна whis_gui:
Классификация по умолчанию основана на Holy and Guo 11 и Arriaga et al. 10 , который кодирует слог числом прыжков основного тона и направлением прыжка: S для простого непрерывного слога; D для одного прыжка вниз; U для одного прыжка вверх; DD для двух последовательных прыжков вниз; DU для одной dowN и один прыжок вверх; И т.д. Это будет по умолчанию, если пользователь ничего не выбирает. У пользователя есть возможность запускать анализ на определенных типах слога, выбирая каждый из репрезентативных блоков.
Чтобы выбрать категоризацию слоги, как описано Scattoni, et al. 9 , дополнительно выберите категорию Split s , которая разделяет этот тип на несколько подкатегорий, основанных на форме слога.
Выберите Harmonics, если пользователь хочет продолжить сортировку слогов в соответствии с гармониками и без них.
- Откройте программное обеспечение B, настроенное с помощью C.
- Классифицируйте слоги в интересующих файлах .wav
- Выберите все файлы .wav из одного сеанса записи в левом верхнем углу окна whis_gui.
- Нажмите «Получить сонограммы» в середине окна whis_gui ( рисунок 3 ). Будет создана новая папка, содержащая сонограммы, с файловым форматом .sng. Выделите все сонограммы (файлы .sng) в верхнемЛевый угол окна whis-gui. В полях ниже окна сонограммы введите «Animal ID» и «ID сеанса». Затем щелкните процесс сонограммы.
- Обратите внимание на три типа файлов в папке сонограммы: «ID-сессии ID животных -Notes.csv» (содержит информацию о заметках, извлеченных из слогов), «ID-идентификатор Animal-ID -Syllables.csv» (содержит значения всех Классифицированные слоги, включая их спектральные признаки и общее число слогов, обнаруженных на сонограммах), «ID идентификатора животного-ID-Traces.mat» (содержит графические изображения всех слогов).
ПРИМЕЧАНИЕ. В файле «ID-сессии идентификатора Animal-ID -Syllables» иногда содержится небольшой процент (2 - 16%) неклассифицированных слогов USV, которые являются более сложными, чем выбранные, или которые имеют два слога животного, перекрывающие друг друга 23 . При необходимости их можно изучить отдельно от файла трассировки.
- Обратите внимание на три типа файлов в папке сонограммы: «ID-сессии ID животных -Notes.csv» (содержит информацию о заметках, извлеченных из слогов), «ID-идентификатор Animal-ID -Syllables.csv» (содержит значения всех Классифицированные слоги, включая их спектральные признаки и общее число слогов, обнаруженных на сонограммах), «ID идентификатора животного-ID-Traces.mat» (содержит графические изображения всех слогов).
3. Количественная оценка звуковой структуры и синтаксиса Syllable
ПРИМЕЧАНИЕ. Инструкции по действиям для первоначального синтаксического анализа приведены в разделе «READ ME!». Таблицу в файле «Analysis Analysis Guide v1.1.xlsx», разработанном специально для вас калькуляторе электронной таблицы E ( рисунок 1 , таблица 1 ).
- Откройте файл С-файла сценария программного обеспечения «ID идентификатора животного -Syllables.csv», полученный в разделе выше, с программным обеспечением электронной таблицы D ( рисунок 1 , Таблица 1 ). Он содержит общее количество слогов, обнаруженных на всех сонограммах, и все их спектральные признаки.
- Если еще не преобразован, то в программном обеспечении D электронных таблиц конвертируйте этот CSV-файл в разделитель столбцов в программном обеспечении D, чтобы поместить каждое значение в отдельные столбцы.
- Откройте файл «Song Analysis Guide v1.1.xlsx» также в программном обеспечении D. Затем щелкните по значению thЭлектронной таблицы шаблонов и скопировать и вставить в этот лист данные файла «ID-ID Animal -Syllables.csv», как рекомендовано в инструкциях к шаблонам. Удалите строки с категорией слотов 'Unclassified'.
- После удаления строк «Неклассифицированные» сначала скопируйте и пересчитайте данные ISI (интервал между слогами) в столбце O в столбец E. Во-вторых, скопируйте все данные из столбца A в N в электронную таблицу «Данные».
- В электронной таблице данных введите идентификаторы животных (столбец AF) и длину записи (в минутах, столбец AC).
ПРИМЕЧАНИЕ. Идентификаторы животных должны совпадать с идентификаторами, введенными в настройке записи. Файл обнаружит введенные символы и сравнит их с именем .wav-файлов. - Определите срез ISI, чтобы определить последовательность, используя таблицу с надписью «Плотность ISI», результат «ISI plot».
ПРИМЕЧАНИЕ. В нашем предыдущем исследовании 23 мы установили обрезание на двух уровняхГо отклонения от центра последнего пика. Он состоял из длинных интервалов (LI) длительностью более 250 мс, которые разделяли различные поединки в течение сеанса пения. - Просмотрите основные результаты в электронной таблице «Особенности» (группируя все спектральные характеристики, измеренные от каждого животного).
ПРИМЕЧАНИЕ. Если пользователь использовал настройку категории слога по умолчанию в программном скрипте C, описанном в разделе 2.8.9, слоги затем дополнительно классифицируются на 4 категории, как описано выше, и в Chabout, et al. 23 : 1) простой слог без скачков высоты, «s»; 2) два нотных слога, разделенных одним прыжком вверх («u»); 3) два слога, разделенных одним прыжком вниз («d»); И 4) более сложные слоги с двумя или более прыжками высоты тона между нотами («m»). - Для значений синтаксиса щелкните таблицу «Глобальные вероятности», которая вычисляет вероятности каждой пары sНезависимо от стартовых слогов, используя следующее уравнение 23 .
P (Возникновение переходного типа) = Общее количество появлений переходного типа / Общее количество переходов всех типов - Нажмите на электронную таблицу «Условные вероятности», чтобы вычислить условные вероятности для каждого типа перехода относительно начальных слогов, в котором используется следующее уравнение:
P (появление переходного типа с учетом начального слога) = Общее количество появлений переходного типа / Общее количество появлений всех типов перехода с одинаковым стартовым слогом - Чтобы проверить, отличаются ли какие-либо из перечисленных выше вероятностей перехода от неслучайных значений, используя марковскую модель первого порядка, следуя подходу в 23 , использовать собственное программное обеспечение F ( например, декодер синтаксиса в студиях R, рис. 1 ,Strong> Table 1) со следующими R сценариями: Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R для групп в разных условиях; Или Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.R для групп в одинаковых условиях.
- Выполните тест хи-квадрат или другой тест по вашему предпочтению, чтобы проверить статистические различия в вероятностях перехода одного и того же животного в другой контекст (по паре), следуя подходу в 23 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Более подробная информация о статистической модели, используемой для сравнения синтаксиса между группами, приведена в разделе 23 . Исследователи могут использовать другие подходы для анализа глобальных или условных вероятностей перехода, которые они или другие разработали. - Для графического отображения последовательностей в виде синтаксических диаграмм введите значения в графическое программное обеспечение G сети (см . Рис. 1 , табл. 1 ), с узлами, обозначающими другой слог cateGories, и цвет стрелки и / или пиксель толщины, представляющий диапазоны значений вероятности между слогами.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для ясности для глобальных графов вероятности мы показываем только переходы выше 0,005 (более 0,5% вероятности появления). Для условных вероятностей мы используем порог 0,05, потому что каждая вероятность в «глобальной модели» ниже, учитывая, что мы делим на общее число слогов, а не только на один конкретный тип слога.
4. Редактирование песни и тестирование предпочтительного типа песни
ПРИМЕЧАНИЕ. Воспроизведение USV может быть использовано для экспериментальной проверки поведенческого ответа животного, в том числе предпочтения для определенного типа песни. Поскольку предпочтения женщин могут изменяться в зависимости от состояния течки, для женщин необходимо убедиться, что они находятся в одном и том же состоянии перед тестом, следующим образом:
- Подготавливайте женщин с сексуальным опытом за несколько дней до эксперимента по воспроизведению
- Контролируйте цикл течки, и когда проэструс или эструс очевидны (отверстие влагалища и розовый объемный звук, как показано в 27 ), положите самок обратно вместе в свою клетку. Они готовы к испытанию на следующий день.
- Используйте функции копирования и вставки в программном обеспечении H обработки звука ( например, SASLap Pro, Рисунок 1 , Таблица 1 ), чтобы создать два отредактированных WAV-файла с желаемыми условиями, которые будут использоваться для стимулов. Для защиты от количества вокализации в качестве переменной убедитесь, что в двух звуковых файлах содержится одинаковое количество sYllables и длину последовательностей (схватки песен) у тех же или разных мужчин / женщин из желаемых контекстов ( например, UR).
- Откройте первый файл, содержащий песню из условия 1, в программном обеспечении H. Затем перейдите в меню Файл> Специальные> Добавить каналы из файла и выберите второй звуковой файл для проверки из условия 2. Это создаст 2 канала, по одному для каждого условия.
- При необходимости отрегулируйте громкость, чтобы убедиться, что тома двух файлов соответствуют друг другу, выбрав «Редактирование»> «Громкость».
- Затем перейдите в меню «Редактирование»> «Формат»> «Преобразование частоты дискретизации» и выберите преобразование с 250 000 Гц в 1 000 000 Гц, чтобы преобразовать WAV-файлы с частотой дискретизации от 256 кГц до 1 МГц. Этот шаг необходим для воспроизведения устройством .wav файлов воспроизведения.
- Сохраните эти новые файлы в качестве тестовых файлов, которые нужно воспроизвести. Обязательно определите, какая песня находится в каком канале (1 или 2). Для наглядности назовите его «file name.wav».
- Перейти к EXit> «Формат»> «Переключить каналы» и поменяйте местами два канала. Сохраните измененные версии с другим именем. ПРИМЕЧАНИЕ. Это будет противоположная копия с инвертированными каналами, названная позже «file name_swapped.wav».
- Очистите устройство воспроизведения «Y-лабиринт» 70% -ным спиртом, а затем дистиллированной водой. Высушите его бумажными полотенцами. Наш Y-лабиринт представляет собой самодельный непрозрачный твердый черный пластиковый аппарат с плечами длиной 30 см и двумя просверленными отверстиями на крайних концах лабиринта для обеспечения возможности установки ультразвукового громкоговорителя на уровне пола рук ( рисунок 4А ).
- Убедитесь, что динамики находятся в правильном положении и подключены к звуковой карте, а карта подключена к компьютеру.
- Откройте программное обеспечение A, выберите «Воспроизведение»> «Устройство» и выберите устройство звуковой карты воспроизведения. Выберите «использовать заголовок файла». Перейдите в меню «Play»> «Playlist» и загрузите интересующий файл, содержащий два chaNnels ( т.е. "file.wav"). Выберите «режим петли». Настройте видеомагнитофон над лабиринтом, чтобы охватить весь лабиринт.
- Поместите испытуемую самку в лабиринт на 10-минутный период привыкания. Через 10 минут, если женщина не находится в стартовом плече, аккуратно вдавите самку обратно в пусковую руку и закройте окно отделения пластика.
- Выберите подготовленный файл ("file.wav") для воспроизведения и воспроизведения. Запустите видеозапись и убедитесь, что вы определили, на каком канале расположено плечо Y-maze ( т.е. UR слева или FE в правой руке) с бумажной заметкой в поле видеозаписи.
- Позвольте женщине слышать песни в режиме петли и исследовать лабиринт в течение желаемого количества минут ( т.е. 5 минут): это один сеанс. Верните самку обратно в стартовую руку. Дайте ей отдохнуть в течение 1 минуты при подготовке следующей сессии. RemOve любые следы мочи и экскременты с дистиллированной водой.
- Загрузите файл «file_swapped.wav». Переключите расположение бумажных заметок для видеозаписи. Переместите левую вправо и наоборот. Через 1 минуту воспроизведите файл. Освободите женщину для второго сеанса ,
- Повторите шаги с 4.4.3 по 4.4.4 в течение всего 4 сеанса х 5 минут, чтобы контролировать обнаружение потенциального смещения стороны во время теста. Остановите видеозапись в конце всех сеансов, нажав красную кнопку остановки. Очистите лабиринт на 70% спиртом и дистиллированной водой между самками.
- Повторите все шаги с различными экземплярами песни неделю спустя с теми же женщинами, чтобы получить достаточные результаты для проверки достоверности результатов.
- Позже просмотрите видеоролики и используйте таймер на видео и секундомер для измерения времени, проведенного женщинами в каждой руке за каждую сессию. Проанализируйте результирующие данные статистически для возможных предпочтений песни.
Representative Results
В настоящем протоколе были описаны изменения вокального поведения и синтаксиса мышей самцов B6D2F1 / J. В целом, используя этот протокол, мы могли регистрировать, в среднем на одного самца за 5 минут сеанса, 675 ± 98,5 классифицированных слогов в ответ на женский UR, 615,6 ± 72 в FE, 450 ± 134 в AF, 75,6 ± 38,9 в AM и 0,2 ± 0,1 у мужчин UR (n = 12 мужчин). Скорости составляли ~ 130 слогов / мин для женского UR, ~ 120 слогов / мин для FE или ~ 100 слогов / мин для контекстов AF ( рисунок 5A ). Мужчины производят намного большее количество слогов в ответ на свежеприготовленную мочу по сравнению с собранной в течение ночи мочой 10 , 23 . Мужчины также поют значительно меньше в присутствии анестезированной мужской или свежей мужской мочи . Рисунок 5A ). Мужчины также меняют свой репертуар в контексте 23 . Например, самцы B6D2F1 / J значительно увеличивают Производство множественных слогов скачка «m» высоты тона в состоянии женской мочи ( рисунок 5B ). Они также изменяют акустические особенности отдельных слогов в контексте. Например, мужчины B6D2F1 / J поют слоги с большей амплитудой и шириной полосы в контексте женской мочи и более высокой спектральной чистотой в активном женском контексте по сравнению с другими ( Рисунок 6 ). 23 .
Этот протокол также предоставляет средство для измерения динамических характеристик последовательности и, таким образом, изменений синтаксиса. Используя адаптированный метод от Ey, et al. 22 , мы используем ISI для определения разрывов между последовательностями ( рис. 7A ) 23 и затем используем промежутки, чтобы различать и анализировать временные паттерны слоговых последовательностей. Мы показали, что более длинные последовательности формируются в активном женском контексте ( рисунок 7B )F "> 23. Этот метод позволяет вычислить отношение сложных последовательностей (составленных по крайней мере из двух вхождений типа" m "слога) в сравнении с простыми последовательностями (составленными из одного или без типа" m "и, Мы обнаружили, что у мужчин B6D2F1 / J женский мочевой контекст вызвал более высокое отношение по сравнению с другими ( Рисунок 7C ) 23 , что указывает на то, что они произвели более сложные слоги в женском состоянии мочи, но также и то, что такие слоги распределены Более последовательностей.
Мы также можем рассчитать условные вероятности перехода от одного типа слога к другому (всего 24 типа переходов, включая переходы из состояния «молчание» и в состояние «молчания») 23 . Мы обнаружили, что в разных контекстах выбор мышей типов перехода для заданных начальных слогов отличается, и что существует больше синтаксиса divЩины в женском моче ( рис. 8 ). 23 . Эти наблюдения согласуются с предыдущими сообщениями, которые показывают, что самцы могут изменять акустические характеристики или репертуарный состав своих вокализаций в ответ на различные стимулы и переживания 4 , 5 , 24 .
Наконец, настоящий протокол обеспечивает руководство для тестирования предпочтений женщин с воспроизведением. Мы обнаружили, что женщины B6D2F1 / J предпочитают более сложные композиции (содержащие 2 или более «m» слогов) относительно простых песен 23 . Большинство женщин предпочитали оставаться чаще на стороне Y-лабиринта, который играл сложные композиции ( рисунок 4B ).
Рисунок 1: Диаграмма потока СофИспользовать и анализировать. Каждой программе и связанному с ней коду дается название письма, чтобы помочь объяснить их личность и использовать в основном тексте. В () - это конкретные программы, которые мы используем в нашем протоколе. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка для записи мышей. (A) Изображение блока звукоизоляции и установка для записи вокализации USV. (B) Пример сонограммы записи, выполненной с программным обеспечением A ( таблица 1 ), включая подробные спектральные характеристики, рассчитанные «Mouse Song Analyzer v1.3»: продолжительность, интервал между слогами (ISI), максимальная частота min (Pf min), Максимальная максимальная частота (Pf max), начало пиковой частоты (пуск Pf), пиковая частота End (Pf end) и пропускной способностью. (C) Сонограммы другого мужчины, поющего живой женщине, в звукоизоляционной коробке и за пределами коробки на лабораторном столе в той же комнате. Наши анекдотические наблюдения показывают, что записи в коробке одного и того же животного показывают больший объем (более интенсивную интенсивность) и меньшую гармонику, но никаких свидетельств эха в ящике без звуковой пены нет. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Скриншот окна «Мышь Песня Analyzer v1.3» Окно whis_gui, показывающее различные опции, доступные для анализа. Показанные параметры - это те, которые используются для записи мужских USV в представленных рисунках и анализах данных (за исключением того, что длительность минимальной ноты составляла 3 мс). .com / files / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Женский выбор между воспроизведением сложных и простых композиций. (A) Изображение используемого аппарата Y-maze и измерение размеров. (B) Время, проведенное женщинами в каждой руке, играя либо из сложной (женская моча), либо из более простой (пробуждаемой женской) песни одного и того же мужчины. Данные представлены для n = 10 самок мышей B6D2F1J в виде среднего ± SE, также показаны индивидуальные значения; 9 из 10 женщин проявили предпочтение к более сложной композиции слога / последовательности. * P <0,05 парный t-критерий ученика. Рисунок, модифицированный Chabout, et al. 23 с разрешения.Blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Количество испускаемых слогов и репертуар в разных условиях . (A) Уровень производства слогов самцов в разных контекстах. (B) Репертуарные составы мужчин, когда в присутствии женской мочи (UR), анестезированной женщины (AF), активной женщины (FE) и анестезированных мужских (AM) контекстов. Данные представлены как среднее ± SEM. * P <0,03; ** p <0,005; *** p <0,0001 для трёхфакторного теста ученика после коррекции Беньямини и Хохберга (n = 12 мужчин). Рисунок от Chabout, et al. 23 с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
together.within-страница = "1"> 
Рисунок 6: Примеры спектральных характеристик в разных контекстах. (A) Амплитуда. * P <0,025 для t-теста ученика после коррекции после коррекции. (B) Частотный диапазон или Полоса пропускания. *: Р <0,041; **: p <0,005; ***: p <0,0001 после коррекции. (C) Спектральная чистота слогов. * P: <0,025; **: p <0,005; ***: p <0,0001 после коррекции. Аббревиатуры: женская моча (UR), анестезированная женщина (AF), бодрствующая самка (FE) и анестезированный мужчина (AM). Рисунки, измененные от Chabout, et al. 23 с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
37fig7.jpg "/>
Рисунок 7: Последовательность измерений. (A) Использование ISI для разделения последовательности. Короткий ISI (SI) и средний ISI (MI) используются для разделения слогов в последовательности, а длинные ISI свыше 250 мс (LI) разделяют две последовательности. (B) Длина последовательностей, определяемая как количество слогов в последовательности, созданных самцами в разных контекстах. *: P <0,025; ** p <0,005; *** p <0,0001 после коррекции. (C) Соотношение сложных песен над простыми песнями, создаваемыми мужчинами в разных контекстах. * P <0,041; ** p <0,005; *** p <0,0001 после коррекции. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 12 мужчин). Рисунок от Chabout, et al. 23 с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Синтаксические схемы силлаксиса последовательностей, основанные на условных вероятностях для каждого контекста. Толщина стрелки пропорциональна появлению условной вероятности переходного типа в каждом контексте, усредненном от n = 12 мужчин: P (возникновение перехода с учетом начального слога). Для ясности, редкие переходы ниже вероятности 0,05 не показаны. Рисунок от Chabout, et al. 23 с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Этот протокол обеспечивает подходы к сбору, количественной оценке и изучению вокализов ухаживания мышей-самцов в лаборатории по целому ряду преимущественно связанных с женщинами стимулов. Как было показано ранее в Chabout, et al. 23 и в репрезентативных результатах, использование этого метода позволило нам обнаружить зависящие от контекста вокализации и синтаксис, которые имеют значение для принимающих женщин. Стандартизация этих стимулов обеспечит сбор надежного числа USVs и позволит детально проанализировать мужские песни и репетиции ухаживания.
Когда живая женщина присутствует с мужчиной, протокол не позволяет нам четко идентифицировать излучатель вокализации. Однако, предыдущие исследования показали, что большинство вокализации, испускаемых в таком контексте, были мужчины 26 , 29 . Большинство исследований с использованием конспецифических (мужских или женских)В качестве стимула для мужчин считают, что количество вокализации у женщин в этих контекстах незначительно 4 , 5 , 22 , 30 . Однако недавняя статья использовала триангуляцию для локализации вокализации излучателя в условиях размещения в группе 31 и показала, что в пределах диады самка вносит вклад в ~ 10% от USV. В настоящем протоколе использование наркотизированной женщины позволяет пользователю изучать мужские вокализации в присутствии женщины без ее озвучивания. В отличие от ожиданий этого недавнего исследования 31 , мы не обнаружили различий в количестве слогов, испущенных между FE и AF условиями 23 . Возможно, что живые женщины не вносят существенного вклада в записи или что самцы менее вокализованы в присутствии живых женщин и анестезированных женщинэля. Тем не менее мы считаем, что в будущих экспериментах следует рассмотреть возможность использования этого метода триангуляции для оценки потенциального эффекта вклада женщин.
Есть и другое программное обеспечение, которое может сделать некоторые шаги, которые мы изложили, хотя мы не верим в способ, достаточный для вопросов, которые мы задавали, используя комбинацию из трех программ: Программное обеспечение A, Программный скрипт мыши Mouse Song Analyzer C с использованием программного обеспечения B, Синтаксиса с использованием пользовательских табличных вычислений D + E и синтаксического декодирования с использованием R. Например, в недавнем документе было предложено программное обеспечение VoICE, которое позволяет пользователю автоматически извлекать акустические переменные из сонограмм или непосредственно на устройствах, которые были вручную Выбранным пользователем 32 . Но автоматизированный или полуавтоматический анализ последовательностей не так детализирован, как наш подход. Некоторые коммерческие программы могут автоматически анализировать акустические характеристики, но не предоставляют автоматАтическую классификацию слогов; Пользователь должен отсортировать разные слоги позже. Grimsley, Gadziola, et al. 33 была разработана виртуальная мышь для голосовых органов на основе таблиц, которая группирует слоги, основанные на общих акустических характеристиках, но не обеспечивает автоматического обнаружения слогов. Их программа 34 уникальна тем, что она создает новые последовательности из записанных песен с использованием марковских моделей и, следовательно, имеет более продвинутые функции, чем простое редактирование.
Большинство предшествующих коммуникационных исследований на мышах были сосредоточены на стороне излучателя 35 , 36 . Немного исследований исследовали сторону получателя 30 , 37 , 38 . Протоколы воспроизведения и дискриминации обеспечивают простой тест для изучения стороны приемника, такой как тот, который недавно был описан Asaba, Kato и др.и др. 39 . В этом исследовании авторы использовали тестовую коробку с двумя вариантами, разделенную акустической пеной вместо описанной здесь коробки Y-лабиринт. Обе установки выбора имеют свои преимущества и недостатки. Во-первых, Y-лабиринт не изолирует звук от одной руки к другой, но это делает коробка с двумя вариантами выбора. Однако, используя дизайн Y-лабиринта, животное может быстро оценить две песни, которые воспроизводятся одновременно, и двигаться в направлении предпочтительного. Тем не менее, эксперименты по воспроизведению в целом помогают экспериментаторам определить значение и, таким образом, функции вокализации, сгенерированные для конспецифичных животных. В заключение, после освоения методов этого протокола и анализов, читатели должны уметь решать многие вопросы, которые влияют на контекст, генетику и нейробиологию USVs мыши.
Используя мышей B6D2F1 / J, женские ассоциированные стимулы почти всегда вызывают УЗИ у мужчин, которых мы тестировали в нашей лаборатории. Для коллеги важноДостаточно коротких слогов (> 100 за 5 минут), чтобы получить сильный статистический анализ. Для устранения неполадок, если записи USV не записаны (или недостаточно), проверьте конфигурацию, чтобы убедиться, что звуки записаны. Сделайте живой анализ того, что происходит в клетке во время записи, посмотрев на сонограмму в реальном времени на экране компьютера после введения стимула. В противном случае попытайтесь повторно подвергнуть мужчину половой зрелой / восприимчивой женщине всю ночь, а затем оставить их в покое на несколько дней или до недели, прежде чем записывать снова. На основе анекдотических наблюдений мы находим, что некоторые мужчины поют много в один день (почти на полные 5 минут), а не на следующий день, а затем снова на другой день. Мы не знаем, почему такая изменчивость наблюдается у субъекта, но мы предполагаем, что это, вероятно, мотивационный или сезонный характер для мужчин и состояние течки для женской мочи. Если USVs не записаны, попробуйте записать животное на несколько дней, чтобы получить эти переменные эффекты. UnlКак и в певчих птицах, мы не отметили явных различий в количестве пения по времени суток. Мы находим, что самцы не очень поют (менее 100 слогов за 5 минут), прежде чем им исполнится 7 недель.
Представленные здесь методы обнаружения могут извлекать тысячи слогов и все акустические параметры за несколько минут. Но как любой метод автоматического обнаружения, он очень чувствителен к фоновому шуму. Использование программного обеспечения для анализатора мыши Mouse Song с шумными записями (например, от животных, записанных с постельными принадлежностями) может потребовать корректировки порога обнаружения, чтобы обеспечить большую гибкость. Однако это также увеличит количество ложных положительных слогов, и автоматическое обнаружение может потерпеть неудачу. При таких обстоятельствах можно использовать ручное кодирование.
Как было сказано ранее, количество, репертории и латентность вокализации широко варьируются в зависимости от деформации, поэтому может потребоваться изменение параметров (длина записи,Стимул, автоматическое определение слога и т. Д.) Для некоторых штаммов для обеспечения оптимальной записи для статистического анализа.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана фондами медицинского института Говарда Хьюза для EDJ. Мы благодарим Пр. Сильви Гранон (NeuroPSI - University Paris south XI - FRANCE) предоставила нам оргкомитет. Мы также благодарим членов Jarvis Lab за их поддержку, обсуждения, исправления и комментарии к этой работе, особенно Джошуа Джонс Макопсон за помощь в цифрах и тестировании. Мы благодарим доктора Густаво Арриагу за помощь в работе с программным обеспечением анализатора мыши Mouse Song, обновляя его для нас до версии 1.3 и другие аспекты этого протокола. V1.0 программного обеспечения была разработана Holy and Guo, и v1.1 и v1.3 компанией Arriaga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
| Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
| Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
| Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
| Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
| plexiglas separation | home made | - | 4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes |
| Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
| Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
| Y-maze | Home made | - | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
| Tweezers | |||
| Software | |||
| Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | - | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
| Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_ v1.3-2015-03-23.zip |
|
| Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
| Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
| Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http://www.graphviz.org | |
| Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| Reagents | |||
| Xylazine (20 mg/mL) | Anased | - | |
| Ketamine HCl (100 mg/mL) | Henry Schein | #045822 | |
| distilled water | |||
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
| Cotton tips | |||
| Petri dish |
References
- Amato, F. R., Scalera, E., Sarli, C., Moles, A. Pups call, mothers rush: does maternal responsiveness affect the amount of ultrasonic vocalizations in mouse pups. Behav. Genet. 35, 103-112 (2005).
- Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PloS ONE. 2, e351 (2007).
- Moles, A., Costantini, F., Garbugino, L., Zanettini, C., D'Amato, F. R. Ultrasonic vocalizations emitted during dyadic interactions in female mice: a possible index of sociability. Behav. Brain Res. 182, 223-230 (2007).
- Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PloS ONE. 7, e29401 (2012).
- Yang, M., Loureiro, D., Kalikhman, D., Crawley, J. N. Male mice emit distinct ultrasonic vocalizations when the female leaves the social interaction arena. Front. Behav. Neurosci. 7, (2013).
- Petric, R., Kalcounis-Rueppell, M. C. Female and male adult brush mice (Peromyscus boylii) use ultrasonic vocalizations in the wild. Behaviour. 150, 1747-1766 (2013).
- Bishop, S. L., Lahvis, G. P. The autism diagnosis in translation: shared affect in children and mouse models of ASD. Autism Res. 4, 317-335 (2011).
- Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation. Genes Brain & Behav. 10, 4-16 (2011).
- Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. PloS ONE. 3, (2008).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PloS ONE. 7, (2012).
- Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Amer. Assoc. Lab. Anim. Science: JAALAS. 46, 28-28 (2007).
- Wohr, M., Schwarting, R. K. Affective communication in rodents: ultrasonic vocalizations as a tool for research on emotion and motivation. Cell Tissue Res. , 81-97 (2013).
- Pasch, B., George, A. S., Campbell, P., Phelps, S. M. Androgen-dependent male vocal performance influences female preference in Neotropical singing mice. Animal Behav. 82, 177-183 (2011).
- Asaba, A., Hattori, T., Mogi, K., Kikusui, T. Sexual attractiveness of male chemicals and vocalizations in mice. Front. Neurosci. 8, (2014).
- Balaban, E. Bird song syntax: learned intraspecific variation is meaningful. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3657-3660 (1988).
- Byers, B. E., Kroodsma, D. E. Female mate choice and songbird song repertoires. Animal Behav. 77, 13-22 (2009).
- Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PloS ONE. 7, (2012).
- Pomerantz, S. M., Nunez, A. A., Bean, N. J. Female behavior is affected by male ultrasonic vocalizations in house mice. Physiol. & Behav. 31, 91-96 (1983).
- White, N. R., Prasad, M., Barfield, R. J., Nyby, J. G. 40- and 70-kHz Vocalizations of Mice (Mus musculus) during Copulation. Physiol. & Behav. 63, 467-473 (1998).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic 'songs' with approach behaviour. Biology Letters. 5, 589-592 (2009).
- Ey, E., et al. The Autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
- Chabout, J., Sarkar, A., Dunson, D. B., Jarvis, E. D. Male mice song syntax depends on social contexts and influences female preferences. Front. Behav. Neurosci. 9. 76, (2015).
- Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. & Behav. 96, 602-605 (2009).
- Roullet, F. I., Wohr, M., Crawley, J. N. Female urine-induced male mice ultrasonic vocalizations, but not scent-marking, is modulated by social experience. Behav. Brain Res. 216, 19-28 (2011).
- Barthelemy, M., Gourbal, B. E., Gabrion, C., Petit, G. Influence of the female sexual cycle on BALB/c mouse calling behaviour during mating. Die Naturwissenschaften. 91, 135-138 (2004).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS ONE. 7, (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. ULTRASONIC EMISSIONS: DO THEY FACILITATE COURTSHIP OF MICE. J. Comp. Physiolog. Psych. 84, 445-452 (1973).
- Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in mice. PloS ONE. 9, 87186 (2014).
- Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
- Burkett, Z. D., Day, N. F., Penagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Scientific Reports. 5, 10237 (2015).
- Grimsley, J. M., Gadziola, M. A., Wenstrup, J. J. Automated classification of mouse pup isolation syllables: from cluster analysis to an Excel-based "mouse pup syllable classification calculator". Front. Behav. Neurosci. 6, (2012).
- Grimsley, J. M. S., Monaghan, J. J. M., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PloS ONE. 6, (2011).
- Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Curr. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
- Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PloS ONE. 9, 97244 (2014).
- Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PloS ONE. 9, 85405 (2014).
- Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136, 3401 (2014).
- Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback. J Vis Exp. , (2015).
