Oppdager Cortex Fragmenter Under Bakteriell Spore Spiring

Summary

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Abstract

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Introduction

Endospores er metabolsk sovende former for bakterier som gjør at bakterier til å vedvare i ugunstige miljøer. I mange sporedannende bakterier, er sporedannelse indusert av næringsmangel, men denne prosessen kan kontrolleres ved endringer i pH, eksponering for oksygen eller andre belastninger ^1. Mens i deres metabolsk sovende sporeform, bakterier motstå UV-stråling, uttørking, høyere temperaturer, og frysing ^2. Det meste av kunnskapen om sporulation prosessen kommer fra studier i modellorganisme, Bacillus subtilis. Den sporulering Prosessen begynner med DNA-replikasjon og dannelsen av en aksial filament ^3,4. En asymmetrisk septum deler deretter cellen i to ulikt størrelse avdelinger. Jo større kupé, moren celle, omslutter mindre rommet, den forespore. Både mor celle og forespore koordinere genuttrykk å modne spore og moren cellen til slutt lyserer, slippe Dormant spore i det omkringliggende miljøet ^en.

Spore struktur og sammensetning er konservert på tvers av mange bakteriearter. Spore kjernen har et lavere vanninnhold enn den vegetative celle og er rik med dipikolinsyre (DPA) ^1,2. I løpet av sporedannelse, er DPA pumpes inn i spore kjerne i bytte for vann. Rundt kjernen er en indre spore membran der, i de fleste sporedannende bakterier, er reseptorer som kjenner igjen de små molekyler som stimulerer spiring (germinants) ligger ^2. Ligger like utenfor spore indre membran er et lag med cellevegg av peptidoglykan. En spesialisert peptidoglykan lag (cortex) omgir celleveggen peptidoglykan, og er sammensatt av mange av de samme komponentene som celleveggen peptidoglykan [vekslende N-acetylglukosamin (NAG) og N-acetylmuraminsyren (NAM)]. Men omtrent 50% av NAM-rester i cortex har blitt konvertert til muramic-δ-laktam ^5,6 </sopp>. Under sporespiringen, er disse muramic-δ-laktam-residuer gjenkjent av spore cortex lytiske enzymer (SCLEs), og dermed gir hjernebarken som skal nedbrytes (en prosess vesentlig å fullføre spiring), men ikke celleveggen. Rundt cortex er en ytre membran og flere lag med kappeproteiner ^2.

Å styre prosessen med spiring er kritisk viktig for sporedannende bakterier. Spiring startes når spiren reseptorer samhandle med sine respektive germinants ^2. I mange sporedannende bakterier, er disse germinants er aminosyrer, sukkere, nukleotider, ioner eller kombinasjoner av disse ^to. C. difficile sporespiringen initieres ved kombinasjoner av enkelte gallesyrer, [f.eks taurocholinsyre (TA)] og aminosyrer (f.eks glycin) ^7-10. Selv om det er forskjeller mellom C. difficile spiring sti og trasé studert i andre sporedannendebakterier, såsom B. subtilis, felles for alle er den absolutt krav for å nedbryte spore cortex for å tillate en vegetativ celle for å vokse fra den spirende spore ^2,8. Cortex degradering kan oppnås ved den SCLEs CwlJ / SleB (som finnes i B. subtilis) eller SleC (som finnes i mange Clostridia). Cortex hydrolyse reduserer begrensningen på celleveggen og den spore. Dette tillater full kjerne rehydrering, et nødvendig skritt for å reaktivisere mange av de proteinene som er nødvendige for cellenes stoffskifte ^to.

Når sporene spire, kan den sovende spore endringer fra en fase-lys tilstand til en fase-mørk tilstand og denne prosessen måles ved en endring i optisk tetthet (OD) ved 600 nm ^11. En tidligere rapport tyder på at mye av denne endringen i OD skyldes frigjøring av DPA fra spore ^12. Under vår siste undersøkelse, forsøkte vi å sammenligne tidspunktet for C. difficile spore spiring og overvåketfrigjøring av DPA og cortex fragmenter ^9. For denne studien var det avgjørende å overvåke utgivelsen av cortex fragmenter som de begynte å bli utgitt av spirende sporer.

Den kolorimetrisk analyse som er brukt her er basert på en metode for påvisning av sukkere med reduserende ender utviklet Ghuysen et al., ^13. Fordi andre har beskrevet protokoller for påvisning av reduserende sukker ¹⁴ eller har modifisert disse protokollene ^15, kan den litteratur på området være forvirrende. Her har vi detalj en trinn-for-trinn fremgangsmåte for den kolorimetriske deteksjon av reduserende sukker frigjort fra spirende C. difficile sporer. Selv om denne studien bruker C. difficile sporer, de reduserende sukkere som frigjøres under spiring av sporer fra andre sporedannende bakterier er i stand til å bli detektert med denne protokollen ^9,16,17.

Protocol

1. Generering Samples Heat aktivere C. difficile sporer ved 65 ° C i 30 min og butikken på is. Merk: C. difficile spores kan bli produsert og renset som beskrevet tidligere 7,9,10. Klargjør spiring løsningen ved X + 1 ml, hvor X er antall prøver som skal tas i løpet av analysen. Merk: spiring løsningen er spesifikk for de arter av bakterier Spore blir studert. For å analysere C. difficile sporespiringen, anvendte vi en oppløsning av 10 mM …

Representative Results

Tabell 1 viser typiske resultater ved hjelp av NAG standarder. Data brukes til å generere en standardkurve. Tabell 2 viser typiske resultater fra en spiring analyse i spiring buffer supplert med 100 mM glycin og 10 mM TA (spiring fremmende betingelser) eller 100 mM glycin bare (ikke-spirebetingelser). I fravær av TA, C. difficile sporene ikke spirer, og det er liten endring i nærvær av cortex fragmenter i oppløsningen. Imidlertid, i nærvæ…

Discussion

Ved stimulering, sporer som gjennomgår prosessen for spiring mister sine motstandsegenskaper uten behov for makromolekylære syntese. Når spore spiring utløses, spore kjernen utgivelser DPA i bytte for vann ^2. På grunn av det høye innholdet av DPA sovende spore, er det spore kjernen under intens osmotisk trykk og den spesialiserte peptidoglykan, cortex, bidrar til å hindre at kjernen sveller ved å opptre, formodentlig som en barriere for utvidelse ^2.

Fremgangsmå…

Materials

2.0 mL screw cap tube	USA scientific	1420-3700
p1000 eppendorf pippet	Eppendorf
p200 eppendorf pippet	Eppendorf
p20 eppendorf pippet	Eppendorf
100-1250uL pipet tips	VWR	89079-486
1-200uL pipet tips	VWR	89079-458
N-acetyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Hydrochloric Acid – 10N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride	Alfa Aesar	L04295
Sodium Bicarbonate	BDH	BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate	Alfa Aesar	39435
Sodium Hydroxide	BDH	BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma	156477-100G
Saturated Phenol	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoethanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 well clear tissue culture plates
Culture tubes	VWR	89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine