Introduction
Endosporer är metaboliskt vilande former av bakterier som gör att bakterier att kvarstå i ogynnsamma miljöer. I många sporbildande bakterier, är sporbildning inducerad av näringsämnen deprivation men denna process kan regleras genom ändringar i pH, exponering för syre eller andra påkänningar 1. Även i deras metaboliskt vilande sporformen, bakterier motstå UV-strålning, uttorkning, högre temperaturer och frysa 2. De flesta av kunskap på sporulering processen kommer från studier i modellorganism, Bacillus subtilis. Sporuleringen Processen börjar med DNA-replikation och bildning av en axiell glödtråd 3,4. En asymmetrisk septum delar sedan cellen i två ojämnt dimensionerade fack. Den större fack, modercellen, omger den mindre fack, den forespore. Både modercellen och forespore samordna genuttryck att mogna sporen och modercellen till slut lyserar, släppa Dormant spor i den omgivande miljön en.
Spor struktur och sammansättning är konserverad i många bakteriearter. Sporkärnan har en lägre vattenhalt än den vegetativa cellen och är rikt med dipikolinsyra (DPA) 1,2. Under sporbildning är DPA pumpas in sporkärnan i utbyte mot vatten. Som omger kärnan är ett inre spor membranet där, i de flesta sporbildande bakterier är de receptorer som känner igen de små molekyler som stimulerar grobarhet (groddarna) beläget 2. Beläget strax utanför spor inre membran är ett skikt av cellväggs peptidoglykan. En specialiserad peptidoglykan skikt (cortex) omger cellväggen peptidoglykan och består av många av samma komponenter som cellväggs peptidoglykan [alternerande N-acetylglukosamin (NAG) och N-acetylmuramidsyra (NAM)]. Emellertid har cirka 50% av NAM rester i hjärnbarken omvandlats till muramic-δ-laktam 5,6 2.
Styrning av processen på grobarhet är av avgörande betydelse för sporbildande bakterier. Groning initieras när groende receptorer interagerar med sina respektive groddar 2. I många sporbildande bakterier, dessa groddarna är aminosyror, sockerarter, nukleotider, joner eller kombinationer därav två. C. difficile sporgroning initieras genom kombinationer av vissa gallsyror, [t.ex., taurocholsyra (TA)] och aminosyror (t.ex. glycin) 7-10. Även om det finns skillnader mellan C. difficile groning vägen och vägarna studeras i andra sporbildandebakterier, såsom B. subtilis, är gemensam för alla absolut krav att försämra spor cortex för att möjliggöra ett vegetativt cell att växa från grodda sporer 2,8. Cortex nedbrytning kan åstadkommas genom den SCLEs CwlJ / SleB (som finns i B. subtilis) eller SLEC (som återfinns i många Clostridia). Cortex hydrolys minskar begränsningen på cellväggen och spor. Detta möjliggör full kärn rehydrering, ett nödvändigt steg i reaktive många av de proteiner som behövs för cellulär metabolism 2.
När sporerna gror, kan de vilande spor ändras från en fas-ljus tillstånd till en fas-mörkt tillstånd och denna process mätas genom en förändring i optisk densitet (OD) vid 600 nm 11. En tidigare rapport tyder på att en stor del av denna förändring i OD beror på frisättning av DPA från spor 12. Under våra senaste studie, försökte vi att jämföra tidpunkten för C. difficile sporgroning och övervakadefrisättning av DPA och cortex fragment 9. För denna studie var viktigt att övervaka frisättningen av cortex fragment när de började att släppas genom groende sporer.
Den kolorimetriska analysen som används här baserades på en metod för att detektera sockerarter med reducerande ändarna utvecklade Ghuysen et al. 13. Eftersom andra har beskrivit protokoll för detektion av reducerande sockerarter 14 eller har ändrat dessa protokoll 15, kan litteraturen om detta ämne vara förvirrande. Här har vi detaljerat en steg-för-steg-metod för kolorimetrisk detektion av reducerande sockerarter som frigöres från groende C. difficile sporer. Även denna studie använder C. difficile sporer, reducerande socker släpptes under groning av sporer från andra sporbildande bakterier kan detekteras med detta protokoll 9,16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generera Prover
- Värme aktivera C. difficile sporer vid 65 ° C i 30 min och förvara på is.
Notera: C. difficile-sporer kan produceras och renas såsom beskrivits tidigare 7,9,10. - Förbered groning lösning på X + 1 ml där X är antalet prover som ska tas under analysen.
Obs! Grobarhet lösning är specifik för bakteriearter Spore studeras. För analys av C. difficile sporgroning, använde vi en lösning av 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glycin och 10 mM taurocholsyra i avjoniserat vatten. - Innan analysen, rita en 1,0 ml prov av groning lösning utan sporer att fungera som ett ämne för cortex fragment detektering.
- Lägg sporer till en OD 600 av ~ 3,0 till groning lösning och skaka snabbt.
Obs: För våra grobarhet studier i B. subtilis, använde vi samma OD 600 sporer som för C. difficile.
Obs: Denna mängd sporer fungerat bra för övervakning cortex fragment frisättning under C. difficile sporgroning. Mängden sporer användes i denna analys bör bestämmas experimentellt för varje bakterie eller stam. - Ta bort ett 1,2 ml prov omedelbart efter tillsats av de sporer och centrifugera vid rumstemperatur under 1 min vid 14000 x g. Detta är nolltidpunkten.
- Överför 1,0 ml av supernatanten från det centrifugerade provet till ett nytt rör för efterföljande cortex fragmentanalys.
Obs: Om DPA måste övervakas, ta bort en separat 100 pl prov för detektion av DPA i lösningen med hjälp av en analys baserad på terbium fluorescens 9,18,19. - Frysa den uppsamlade provet vid -80 ° C.
- Upprepa steg 1,4 och 1,5 med regelbundna intervall tills alla tidpunkter avslutad.
Obs: På grund av tiden som krävs för centrifugering och provtagning, tidpunkter mindre then 2 min isär inte var möjligt under vårt förfarande, så våra samplingsintervall var gång varje 2 min för 14 min. - Som en positiv kontroll för att minska socker upptäckt och kvantifiering innehålla följande mängder N -acetylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, och 5000. Bered dessa prover samtidigt som cortex prover och kör längs med Cortex prover så att standardkurvan är relevant för de data som genereras av groende sporer.
- Efter det att alla tidspunkt prover samlas in, lyofilisera proverna.
Obs: Vi lyofiliserade våra prover i två ml skruvlock.
2. Mätning Cortex Fragment
- Resuspendera lyofiliserade prover i 120 pl av 3 N HCl kompletterad med 1% fenol och 0,5% β-merkaptoetanol.
- Överför de återsuspenderade proverna till 2-ml med skruvlock.
Obs! Reproducerbarhet, se alla frystorkade provet suspenderas och överföras. <li> Inkubera proverna i ett recirkulerande vattenbad vid 95 ° C under 4 h. - Efter inkubation, placera proverna på is tills de är svala.
- Neutralisera proverna med 120 pl 3 M NaOH.
- Tillsätt 80 | il av en mättad natriumvätekarbonatlösning och 80 | il av en 5% ättiksyraanhydrid lösning till varje prov och vortexa.
- Inkubera proverna vid rumstemperatur i 10 min.
- Överför proverna tillbaka till 95 ° C vattenbad i exakt tre min.
Obs: Detta steg är tidskänsliga och längre tider kan påverka nedströms signalutveckling. - Ta prover från vattenbadet och svalna på is.
- Tillsätt 400 mikroliter av 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O till varje rör och virvel.
- Inkubera proverna i ett recirkulerande vattenbad vid 95 ° C under exakt 7 min.
Obs: Detta steg är tidskänsliga och längre tider kan påverka nedströms signalutveckling. - Avlägsnaproven och placera på is i 5 min.
3. Färgreagens
- Medan proverna på is (steg 2,12), förbereda färgreagensen. Lös upp 0,320 g p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; Ehrlichs reagens) i 1,9 ml isättika.
Obs: Reagenset är tid, temperatur och ljuskänsliga och bör inte göras i förväg. - Efter DMAB helt löser sig, tillsätt 100 | il av 10 N HCl och vortexa.
- Tillsätt 5 ml isättika och vortexa.
4. kolorimetrisk reaktion
- Överför 100 | il av varje kyld cortex prov till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Lägg 700 ul av den nyligen framställda färglösning till varje prov.
- Överför omedelbart proverna till en 37 ° C vattenbad och inkubera under exakt 20 min.
- Överföra 200 ul av varje prov till en klar platta med 96 brunnar.
- Kvantifiera proverna vid 585 nm på en plattläsare. Prover ska börja med en gul färg och en positiv reaktion kommer att flyttas till lila. Ju mer cortex närvarande, desto djupare lila färg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 1 visar typiska resultat med hjälp av NAG standarder. Data används för att generera en standardkurva. Tabell 2 visar typiska resultat från en grobarhet analys i groning buffert kompletterad med 100 mM glycin och 10 mM TA (grobarhet befrämjande betingelser) eller 100 mM glycin enbart (icke-groende förhållanden). I avsaknad av TA, C. difficile sporer inte gror och det finns lite förändring i närvaro av cortex fragment i lösningen. Emellertid i närvaro av både TA och glycin, C. difficile sporer gror och släppa cortex fragment i lösningen. Detta observeras som en ökning av OD 585 över tiden av de reagerade proven. Den totala mängden cortex fragment (nmol) frigörs vid denna analys beräknades med hjälp av en standardkurva som liknar figur 1B. I denna analys, de flesta av cortex hydrolyseras (eller släpps) med 15 minuter efter avslutadgerminationsmedel exponering, vilket tyder på att de flesta av sporerna har grott i denna tidsram (Figur 2, i linje med en tidigare publikation 7).
Efter att ha utvecklat proverna i färgreagens, kan de flesta prover visar inte den lila färgen för blotta ögat. Figur 1 visar ett representativt prov som genererats från N-acetylglukosamin. Många av proverna visar inte en synlig lila färg. De 250 nmol, 500 nmol och 5000 nmol prov annorlunda visuellt från den negativa kontrollen (0 nmol). Mätt vid OD 585 nm genererade signalen bäst passar en linjär regression (R 2 = 0,999).
Figur 1:. Detecting N-acetylglukosamin (A) N-acetylglukosamin prover (0 nmol, 12,5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5000 nmol) lyofiliserades och omsattes enligt den beskrivna proceduren. (B) Prov tillsattes till en 96-brunnars platta och mängden reagerat material detekterades vid 585 nm. Signalen användes för att generera en standardkurva. 
Figur 2:. Grafisk representation av groning Resultat Den beräknade nmol cortex i Tabell 2 avsattes mot tid. (●) 100 mM glycin + 10 mM TA; (■) 100 mM glycin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| NAG Koncentration (nmol) | OD 585 |
| 0 | 0,047 |
| 12,5 | 0,054 |
| 25 | 0,066 |
| 50 | 0,084 |
| 100 | 0,128 |
| 250 | 0,285 |
| 500 | 0,556 |
| 5000 | 4,0 |
| blank = | 0,046 |
Tabell 1: NAG Standard.
| Clostridium difficile sporgroning | ||||
| Groning Solution (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl) | ||||
| 100 mM Glycin + 10 mM TA | 100 mM Glycin | |||
| Tid (minuter) | OD 585 | Beräknat (nmol) | OD 585 | Beräknat (nmol) |
| 0 | 0,046 | 0,00 | 0,047 | 0,00 |
| 2 | 0,048 | 2,54 | 0,048 | 1,27 |
| 4 | 0,05 | 5,07 | 0,049 | 2,54 |
| 6 | 0,055 | 11,41 | 0,05 | 3,80 |
| 8 | 0,059 | 16,49 | 0,05 | 3,80 |
| 10 | 0,06 | 17,76 | 0,051 | 5,07 |
| 12 | 0,061 | 19,02 | 0,05 | 3,80 |
| 14 | 0,063 | 21,56 | 0,051 | 5,07 |
Tabell 2: Exempel Spore Germinatipå resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vid stimulering, sporer som genomgår processen för groning förlorar sina hållfasthetsegenskaper utan behov av makromolekylära syntes. När sporgroning utlöses släpper sporkärnan DPA i utbyte mot vatten 2. Grund av den höga DPA innehållet i vilande spor är sporkärnan under intensiv osmotiska trycket och den specialiserade peptidoglykan, cortex, hjälper till att förhindra kärnan från att svälla genom att agera, förmodligen, som en barriär mot expansions 2.
Den metod som beskrivs ovan använder Ehrlichs reagens (en gul lösning) för att detektera närvaron av reducerande sockerarter som en mätbar förskjutning till en lila nyans. Under cortex hydrolys är NAG och NAM socker frigörs (beroende på omfattningen av hydrolyserande enzymer, kan det socker frigöras som disackarider eller polysackarider). Hydrolys av glykosidbindningar av HCI (steg 2,1) genererar monosackarider med fria reducerande ändarna 7. efter neutralizing av syran med en lika stor mängd av natriumhydroxid (Steg 2,5), är de alkoholer som omger NAG och NAM monosackarider acylerad med ättiksyraanhydrid (steg 2,6) 13. Därefter oreagerad ättiksyraanhydrid omvandlas till ättiksyra genom upphettning av provet (steg 2,8). Som en hypotes av Morgan och Elson 20, terminal aldehyden omvandlas spontant till enolformen. Under alkaliska betingelser (Steg 2,10) kan denna enolform reagera med den intilliggande acetyl att generera en oxazol-derivat, som reagerar med Ehrlichs reagens (steg 4,3) för att generera en lila färg 15,20.
Denna ovan beskrivna metoden ger konsekventa, pålitliga resultat för detektering av cortex fragment från groende sporer, både B. subtilis och C. difficile 9,16,17. Analysen kräver särskild uppmärksamhet för att säkerställa att reaktionstider, temperaturer och ingrepp utförs med precision. Utan ordentlig uppmärksamhetdetalj, är det lätt för reaktionsbetingelserna för att misslyckas eller inte återge mellan experiment 13. Men införandet av en NAG standard hjälpmedel vid tillämpningen av analysen mellan laboratoriemiljöer. NAG positiv kontroll standard ingår i varje experimentkontroller för alla inter experimentell variabilitet (t.ex. små variationer i reaktionstider eller effektivitet färgreagensen). Reaktioner som endast använder buffertbetingelser och reaktioner med sporer oförmögna att hydrolysera cortex båda gav ingen förändring i färg.
Det vanligaste problemet med denna metod är inter experimentell variabilitet eller total avsaknad av signal. För att kontrollera variabiliteten måste spor preparaten vara fri från all vegetativ cellrester. Denna cellrester innehåller peptidoglykan fragment (NAG och NAM) och kommer att resultera i en hög bakgrundssignal för groende sporer. För att säkerställa en ren spor preparat (> 99,9% sporer), hänvisar till literature för metoder för framställning av rena sporsuspensioner i organismen som ska studeras 7,9,21-23.
Om analysen inte ger någon detekterbar signal, observerade vi att frystorkning steg kan införa variabilitet. På grund av att den kraft med vilken vakuumet frigöres, observerade vi att det torkade pulverprovet kan blåsas ut ur provröret. För att minska / förhindra att detta inträffar, använd en liten sprutnål att peta hål i toppen av provrör. Det lilla område av de introducerade hålen kommer att minska sannolikheten av den lyofiliserade provet (nu i pulverform) från att bli störd. Slutligen, som noterats i metoderna ovan, flera inkubationssteg är mycket tidskänsliga. Se till att alla tidsinställda steg övervakas noggrant. En viktig faktor för denna analys är att Cortex fragmenten måste frigöras från groende sporer för att kunna upptäckas. Om cortex hydrolyseras i stora fragment kan dessa fragment vara för stor för att vara released genom spor coat. Även en viktig faktor när du felsöker ett experiment som inte ger en signal, rekommenderar vi att bekräfta att villkoren för att gro flesta av sporerna i lösningen och de andra felsökningsalternativ som anges här innan man överväger cortex fragmentstorlek som ett potentiellt problem i analysen.
Inte alla grobarhet buffertar / förhållanden lämpar sig för denna analys. Eftersom denna analys detekterar närvaron av reducerande socker som frigjorts under groningsprocessen 13, varje groning buffert som innehåller reducerande sockerarter eller någon germinationsmedel som i sig själv är ett reducerande socker (t.ex. glukos) kommer att resultera i en stark signal i denna analys. Om så är fallet, kan högupplösande vätskekromatografi (HPLC) användas för att detektera närvaron av cortex fragment 24-26. Emellertid, eftersom inte alla laboratorier är utrustade med en sådan instrumentering, den metod som beskrivs häri kan användas av de flestalaboratorier och erbjuder enkla och lätt mätbara resultat.
Groning av bakteriesporer har till stor del studerats i Bacillus och några Clostridium arter 2,8. Processen är i allmänhet bevarade dock skillnader föreligger. Viktigt är inte alla organismer gror använda mekanismer för sporgroning som observerats i modellen sporbildare 9,27. Eftersom groning blir studeras mer olika organismer, kan analysen beskriven ovan tillämpas på dessa organismer för att detektera cortex fragment under sporgroning. Genom att tillämpa denna metod för att dessa nyligen studerade organismer, kan forskarna avgöra vilken roll olika grobarhet proteiner spelar i cortex hydrolys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Projektet beskrivs stöds av Award nummer 5R01AI116895 från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute of Allergy och infektionssjukdomar eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
