Introduction
Endospores metabolisch ruhenden Formen von Bakterien, die Bakterien erlauben, in ungünstigen Umgebungen zu bestehen. In vielen sporenbildenden Bakterien, wird die Sporenbildung von Nährstoffmangel induziert aber dieser Prozess kann 1 durch Änderungen der pH - Wert, der Exposition gegenüber Sauerstoff oder anderen Spannungen gesteuert werden. Während in ihrer metabolisch ruhenden Sporenform, wider Bakterien UV - Strahlung, Austrocknung, höhere Temperaturen und Einfrieren 2. Der größte Teil des Wissens über die Sporulation Prozess stammt aus Studien im Modellorganismus Bacillus subtilis. Die Sporulation Prozess beginnt mit der DNA - Replikation und die Bildung eines axialen Glühfaden 3,4. Eine asymmetrische Septum teilt sich dann die Zelle in zwei ungleich große Fächer. Die größere Kammer, die Mutterzelle, verschlingt die kleinere Kammer, die forespore. Sowohl die Mutterzelle und forespore Genexpression koordinieren, um die Sporen und die Mutterzelle zu reifen schließlich lysiert, die Freigabe der dormant Sporen in die Umgebung 1.
Die Sporen Struktur und Zusammensetzung ist in vielen Bakterienarten konserviert. Die Spore Kern hat einen geringeren Wassergehalt als die vegetative Zelle und ist reich mit Dipicolinsäure (DPA) 1,2. Während die Sporenbildung wird DPA in die Spore Kern im Austausch für Wasser gepumpt. Den Kern umgibt , ist eine innere Membran sporen wo in den meisten sporenbildenden Bakterien, die Rezeptoren , die die kleinen Moleküle erkennen , die Keimung (Keimungsmittel) stimulieren 2 befindet. Das Hotel liegt etwas außerhalb der inneren Membran der Spore ist eine Schicht aus Zellwandpeptidoglycan. Eine spezialisierte Peptidoglycan Schicht (Cortex) umgibt die Peptidoglycan-Zellwand und viele der gleichen Komponenten wie Zellwandpeptidoglycan [alternierende N-Acetylglucosamin (NAG) und N-Acetylmuraminsäure (NAM)] zusammengesetzt ist. Jedoch etwa 50% der NAM - Reste in der Hirnrinde haben muramic-δ-lactam 5,6 umgewandelt 2.
den Prozess der Keimung Steuerung ist von entscheidender Bedeutung für die sporenbildende Bakterien. Die Keimung wird eingeleitet , wenn Keimungsinduktor Rezeptoren interagieren mit ihren jeweiligen Keimungsmittel 2. In vielen sporenbildende Bakterien sind diese Keimungsmittel Aminosäuren, Zucker, Nukleotide, Ionen oder Kombinationen davon . 2 C. difficile Sporenkeimung durch Kombinationen bestimmter Gallensäuren, [zB Taurocholsäure (TA)] und Aminosäuren (beispielsweise Glycin) 7-10 eingeleitet. Obwohl es Unterschiede zwischen der C. difficile Keimung Weg und die untersuchten Wege in andere sporenbildendeBakterien, wie B. subtilis, allen gemeinsam ist die absolute Notwendigkeit der Spore Kortex abzubauen eine vegetative Zelle zu ermöglichen , von der gekeimten Spore 2,8 zu wachsen. Cortex Abbau kann durch die SCLEs CwlJ / SLEB erreicht werden oder SLEC (wie in B. subtilis gefunden) (wie in vielen Clostridia gefunden). Cortex Hydrolyse verringert die Beschränkung der Zellwand und der Spore. Dies ermöglicht eine volle Kern Rehydratisierung notwendiger Schritt in 2 viele der Proteine , die für den Zellstoffwechsel zu reaktivieren.
Wenn Sporen keimen, die ruhende Sporen ändert sich von einem phasen hellen Zustand in einen Phase-Dunkel-Zustand und dieser Prozess kann durch eine Veränderung der optischen Dichte (OD) bei 600 zu messen nm 11. Ein früherer Bericht legt nahe , dass ein großer Teil dieser Änderung in der OD auf die Freisetzung von DPA aus der Spore 12 zurückzuführen ist. Während unserer Studie haben wir versucht , den Zeitpunkt C zu vergleichen difficile Sporenkeimung und überwacht dieFreisetzung von DPA und Cortex - Fragmente 9. Für diese Studie war es wichtig, die Freisetzung von Cortex-Fragmente zu überwachen, wie sie begann von keimen Sporen freigesetzt werden.
Die kolorimetrischen Test hier verwendet wurde , basiert auf einem Verfahren zur Bereitstellung von Zuckern mit reduzierenden Enden entwickelt Ghuysen et al erfasst wird . 13. Weil andere 14 - Protokolle zum Nachweis von reduzierenden Zuckern beschrieben haben oder diese Protokolle 15 modifiziert, kann die Literatur zu diesem Thema verwirrend sein. Hier stellen wir ausführlich die Schritt- für -Schritt - Verfahren zur kolorimetrischen Detektion von Zuckern befreit keimen C. Reduktions difficile - Sporen. Obwohl diese Studie verwendet C. difficile - Sporen sind die reduzierenden Zucker während der Keimung von Sporen von anderen sporenbildenden Bakterien freigesetzt können mit diesem Protokoll 9,16,17 erkannt werden.
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Protocol
1. Erstellen von Proben
- Wärme aktivieren C. difficile Sporen bei 65 ° C für 30 min und auf Eis lagern.
Hinweis: C. difficile - Sporen hergestellt und gereinigt werden , wie zuvor beschrieben , 7,9,10. - Bereiten Sie die Keimung Lösung bei X + 1 ml, wobei X die Anzahl der Abtastwerte ist, die während des Assays entnommen werden.
Anmerkung: Die Keimlösung ist spezifisch für die Spezies von Bakterien untersucht-Sporen werden. Für C. Testen difficile Sporenkeimung, verwendeten wir eine Lösung von 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM Glycin und 10 mM Taurocholsäure in deionisiertem Wasser. - Vor der Durchführung des Tests, ziehen eine 1,0 ml Probe der Keimungslösung ohne Sporen als Rohling für Cortex-Fragment Erkennung dienen.
- Hinzufügen Sporen zu einer OD 600 von ~ 3,0 auf die Keimung Lösung und vortex schnell.
Hinweis: Für unsere Keimung Studien in B. subtilis, wir haben das gleiche OD 600 Sporen als für C. difficile.
Hinweis: Diese Menge an Sporen funktionierte gut für die Überwachung der Hirnrinde Fragment während C. difficile Spore Keimung. Die Menge von Sporen in diesem Assay verwendet wird, sollte experimentell für jedes Bakterium oder Belastung bestimmt werden. - Entfernen, um eine 1,2 ml Probe unmittelbar nach der Sporen Zugabe und Zentrifuge bei Raumtemperatur für 1 min bei 14.000 × g. Dies ist der Zeitpunkt Null.
- Übertragen 1,0 ml des Überstands aus der zentrifugierten Probe in ein frisches Röhrchen zur anschließenden cortex Fragmentanalyse.
Hinweis: Sollte DPA muss überwacht werden, eine separate 100 ul - Probe zum Nachweis von DPA in der Lösung zu entfernen unter Verwendung eines Assays auf Basis von Terbium - Fluoreszenz 9,18,19. - Fixieren Sie die gesammelte Probe bei -80 ° C.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.4 und 1.5 in regelmäßigen Abständen, bis alle Zeitpunkte abgeschlossen.
Hinweis: Da der Zeitaufwand für die Zentrifugation und Probenentnahmen, Zeitpunkte weniger thein 2 min waren abgesehen nicht möglich während unseres Verfahrens, so dass unsere Abtastintervallen waren einmal alle 2 min für 14 min. - Als Positivkontrolle für Zucker Nachweis und die Quantifizierung Verringerung umfassen die folgenden Mengen an N Acetylglucosamin (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 und 5.000. Bereiten Sie diese Proben in der gleichen Zeit wie Cortex Proben und führen zusammen mit den Cortex-Proben, so dass die Standard-Kurve an die Daten relevant sind, erzeugt durch Sporen keimen.
- Nachdem alle Zeitpunkt Proben gesammelt werden, lyophilisieren die Proben.
Anmerkung: Wir gefriergetrocknet, unsere Proben in 2 ml mit Schraubverschluss Röhrchen.
2. Messung Cortex Fragmente
- lyophilisierte Proben in 120 ul 3 N HCl supplementiert mit 1% Phenol und 0,5% β-Mercaptoethanol resuspendieren.
- Übertragen Sie die resuspendierten Proben auf 2 ml mit Schraubverschluss Röhrchen.
Hinweis: Für die Reproduzierbarkeit, sicherzustellen, dass alle die gefriergetrocknete Probe suspendiert und übertragen wird. <li> Inkubieren der Proben in einem Umlaufwasserbad bei 95 ° C für 4 Stunden. - Nach der Inkubation, legen Sie die Proben auf Eis, bis sie kühl sind.
- Neutralisieren der Proben mit 120 ul 3 M NaOH.
- Hinzufügen, 80 ul einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 80 ul einer 5% Essigsäureanhydrid-Lösung zu jeder Probe und vortexen.
- Inkubieren der Proben bei Raumtemperatur für 10 min.
- Übertragen Sie die Proben zurück zu dem 95 ° C warmen Wasserbad für genau 3 min.
Hinweis: Dieser Schritt ist zeitkritisch und längere Zeiten nachgeschaltete Signalentwicklung beeinflussen können. - Entfernen Proben aus dem Wasserbad und kühlen auf Eis.
- In 400 ul 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O in jedes Röhrchen und Wirbel.
- Inkubieren der Proben in einem Umlaufwasserbad bei 95 ° C für genau 7 min.
Hinweis: Dieser Schritt ist zeitkritisch und längere Zeiten nachgeschaltete Signalentwicklung beeinflussen können. - Entfernendie Proben und auf Eis für 5 min.
3. Farbreagenz
- Während Proben auf Eis (Schritt 2.12) sind, bereiten Sie das Farbreagenz. Man löst 0,320 g p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; Ehrlich-Reagens) in 1,9 ml Eisessig.
Hinweis: Das Reagenz ist Zeit, Temperatur und lichtempfindlich und sollte nicht im Voraus gemacht werden. - Nachdem der DMAB vollständig auflöst, 100 ul 10 N HCl und Wirbel.
- 5 ml Eisessig und Wirbel.
4. kolorimetrische Reaktion
- Transfer 100 ul jeder gekühlten Kortex Probe in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- In 700 ul der frisch zubereiteten Farblösung zu jeder Probe.
- Unmittelbar übertragen Sie die Proben auf einem 37 ° C Wasserbad und für genau 20 min inkubiert.
- Übertragen Sie 200 ul jeder Probe auf eine klare 96-Well-Platte.
- Quantifizierung der Proben bei 585 nm auf einer PlatteLeser. Die Proben sollten bei einer gelben Farbe und eine positive Reaktion auf lila verschiebt starten. Je mehr Hirnrinde vorhanden ist, desto tiefer die violette Farbe.
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Representative Results
Tabelle 1 zeigt typische Ergebnisse mit NAG - Standards. Daten verwendet werden , um eine Standardkurve zu erzeugen. Die Tabelle 2 zeigt typische Ergebnisse von einem Keimungsassay in Keimung Puffer , ergänzt mit 100 mM Glycin und 10 mM TA (Keimung fördernden Bedingungen) oder 100 mM Glycin allein (nicht-keimende Bedingungen). In Abwesenheit von TA, C. difficile - Sporen keimen nicht , und es gibt wenig Änderung in Gegenwart von cortex Fragmente in der Lösung. Jedoch in Gegenwart von sowohl TA und Glycin, C. difficile - Sporen keimen und cortex Fragmente in die Lösung freizusetzen. Dies wird als eine Erhöhung der OD 585 im Laufe der Zeit der umgesetzten Proben beobachtet. Die Gesamtmenge an cortex Fragmente (nmol) während dieses Tests freigesetzt wurde unter Verwendung einer Standardkurve ähnlich berechnet auf 1B. In diesem Assay wird der größte Teil der Hirnrinde hydrolysiert (oder freigegeben) von 15 Minuten post-Keimungsinduktor Exposition, was darauf hindeutet , dass die meisten der Sporen in diesem Zeitrahmen gekeimt haben (Abbildung 2, die mit einer früheren Veröffentlichung 7).
Nach der Entwicklung der Proben in dem Farbreagenz zeigen die meisten Proben nicht die purpurrote Farbe für das bloße Auge. 1 eine repräsentative Probe von N-Acetylglucosamin erzeugt zeigt. Viele der Proben zeigen keine sichtbare purpurrote Farbe. Allerdings sind die 250 nmol, 500 nmol und 5000 nmol Proben erscheinen optisch unterscheidet sich von der Negativkontrolle (0 nmol). Wenn bei OD 585 nm gemessen, erzeugt das Signal am besten eine lineare Regression passt (R 2 = 0,999).
Abb . 1: Detecting N-Acetylglucosamin (A) N-Acetylglucosamin - Proben (0 nmol, 12,5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5,000 nmol) wurden lyophilisiert und zur Reaktion gebracht gemß dem beschriebenen Verfahren. (B) Die Proben wurden in einer 96-Well - Platte , und die Menge an umgesetztem Material bei 585 nm detektiert. Das Signal wurde verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen. 
Abbildung 2:. Grafische Darstellung der Keimung Ergebnisse Der berechnete nmol Kortex in Tabelle 2 wurde gegen die Zeit aufgetragen. (●), 100 mM Glycin + 10 mM TA; (■) 100 mM Glycin. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| NAG Konzentration (nmol) | OD 585 |
| 0 | 0,047 |
| 12.5 | 0,054 |
| 25 | 0,066 |
| 50 | 0,084 |
| 100 | 0,128 |
| 250 | 0,285 |
| 500 | 0,556 |
| 5000 | 4.0 |
| blank = | 0,046 |
Tabelle 1: NAG - Standard.
| Clostridium difficile Sporenauskeimung | ||||
| Keimlösung (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl) | ||||
| 100 mM Glycin + 10 mM TA | 100 mM Glycin | |||
| Zeit (Minuten) | OD 585 | Berechnet (nmol) | OD 585 | Berechnet (nmol) |
| 0 | 0,046 | 0.00 | 0,047 | 0.00 |
| 2 | 0,048 | 2,54 | 0,048 | 1,27 |
| 4 | 0,05 | 5,07 | 0,049 | 2,54 |
| 6 | 0,055 | 11.41 | 0,05 | 3.80 |
| 8 | 0,059 | 16.49 | 0,05 | 3.80 |
| 10 | 0,06 | 17,76 | 0,051 | 5,07 |
| 12 | 0,061 | 19,02 | 0,05 | 3.80 |
| 14 | 0,063 | 21.56 | 0,051 | 5,07 |
Tabelle 2: Beispiel Spore Germinatiauf die Ergebnisse.
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Discussion
Nach Stimulation unterzogen Sporen den Prozess der Keimung verlieren ihre Beständigkeitseigenschaften ohne die Notwendigkeit einer makromolekularen Synthese. Wenn Sporenauskeimung ausgelöst wird, 2 die Spore Kern freigibt DPA im Austausch für Wasser. Aufgrund der hohen DPA - Gehalt der ruhenden Spore, die sporen Kern unter intensiver osmotischen Druck und dem Fach Peptidoglycan, Hirnrinde, hilft durch Einwirken vermutlich als Barriere für Expansions 2 den Kern aufquellen verhindern.
Das oben beschriebene Verfahren verwendet, Ehrlich-Reagens (eine gelbe Lösung), um die Anwesenheit von reduzierenden Zuckern als messbare Verschiebung zu einer purpurroten Färbung zu erkennen. Während cortex Hydrolyse NAG NAM und Zucker freigesetzt werden (je nach dem Ausmaß der Hydrolyse von Enzymen können die Zucker als Disacchariden oder Polysacchariden befreit werden). Die Hydrolyse der glycosidischen Bindungen durch HCl (Schritt 2.1) erzeugt Monosaccharide mit freiem reduzierenden Enden 7. Nach Neutralizdie Säure mit einer gleichen Menge von Natriumhydroxid ing (Schritt 2.5), die Alkohole , die NAG und NAM Monosaccharide umgeben von Essigsäureanhydrid acyliert werden (Schritt 2.6) 13. Anschließend wird nicht umgesetztes Essigsäureanhydrid wird durch Erhitzen der Probe (Schritt 2,8) zu Essigsäure umgewandelt. Wie vermutet , von Morgan und Elson 20, wandelt das Terminal Aldehyd spontan auf die Enolform. Unter alkalischen Bedingungen (Schritt 2.10), kann diese Enolform mit dem benachbarten acetyl reagieren , um ein Oxazol - Derivat zu erzeugen , die mit Ehrlich-Reagens (Schritt 4.3) reagiert 15,20 eine purpurne Farbe zu erzeugen.
Dieses oben beschriebene Verfahren liefert eine konsistente, zuverlässige Ergebnisse zur Detektion von cortex Fragmente aus Sporen keimen, sowohl B. subtilis und C. difficile 9,16,17. Der Test erfordert besondere Aufmerksamkeit , um die Reaktionszeiten, Temperaturen und Verfahren , um sicherzustellen , werden mit Präzision durchgeführt. Ohne die richtige Aufmerksamkeitzum Detail, ist es einfach für die Reaktionsbedingungen reproduzieren zu versagen oder nicht zwischen den Experimenten 13. Allerdings ist die Einbeziehung eines NAG Standardhilfsmittel bei der Anwendung des Assays zwischen Laborumgebungen. Die NAG positive Kontrolle Standard enthalten in jedem Experiment Kontrollen für jede inter experimentelle Variabilität (zB geringfügige Schwankungen der Reaktionszeiten oder Wirksamkeit des Farbreagens). Reaktionen unter Verwendung von nur Pufferbedingungen und Reaktionen mit Sporen nicht in der Lage, sowohl Kortex Hydrolysieren ergaben keine Veränderung der Farbe.
Das häufigste Problem bei dieser Methode ist inter experimentelle Variabilität oder völlige Fehlen von Signal. Um zu steuern, für die Variabilität, müssen die Spore Präparate frei von jeder vegetativen Zelltrümmer sein. Diese Zelltrümmer werden Peptidoglycan-Fragmente (NAG und NAM) enthalten und in einem hohen Hintergrundsignal für die keimen Sporen führen. Um eine reine Spore Vorbereitung (> 99,9% Sporen) zu gewährleisten, beziehen sich auf die Literature für Methoden reinen Sporensuspensionen im Organismus zur Vorbereitung auf 7,9,21-23 untersucht werden.
Wenn der Assay nachweisbare Signal nicht nachgiebig, beobachteten wir, dass das Lyophilisieren Schritt Variabilität einführen kann. Aufgrund der Kraft, mit der das Vakuum aufgehoben wird, beobachteten wir, dass die getrocknete Probe Pulver kann aus dem Probenrohr geblasen werden. Zur Reduzierung der / dem vorzubeugen, verwenden Sie eine kleine Spritzennadel Löcher in den Spitzen von Probenröhrchen stecken. Die kleine Fläche der Löcher eingeführt wird, die Wahrscheinlichkeit der lyophilisierten Probe (nun in Pulverform) von Störungen zu reduzieren. Schließlich oben in den Verfahren, wie sie angegeben ist, sind die einzelnen Inkubationsschritte sehr zeitempfindlich. Stellen Sie sicher, dass alle zeitlich Schritte sorgfältig überwacht werden. Eine wichtige Überlegung für diesen Test ist, daß die cortex Fragmente aus dem keimen Sporen um detektiert zu werden freigegeben werden muss. Wenn die Rinde in große Fragmente hydrolysiert wird, können diese Fragmente zu groß sein rele seinasierend durch die Sporenhülle. Obwohl ein wichtiger Aspekt, wenn ein Experiment zur Fehlerbehebung, die kein Signal ergeben, empfehlen wir, um zu bestätigen, dass die Bedingungen verwendet, um die meisten der Sporen in der Lösung keimen und die anderen Optionen zur Fehlerbehebung hier vor aufgeführten Kortex Fragmentgröße als ein mögliches Problem in Anbetracht in der Assay.
Nicht alle Keimung Puffer / Bedingungen sind für diesen Test. Da dieser Test die Anwesenheit von reduzierenden Zuckern während der Keimung 13, jede Keimung Puffer, der Verringerung enthält Zucker oder jede germinant befreit erkennt, ist, selbst eine reduzierende Zucker (zB Glucose) führt zu einem starken Signal in diesem Test. Wenn dies der Fall ist, Hochdruck - Flüssigkeitschromatographie (HPLC) kann das Vorhandensein von cortex Fragmente 24-26 zu detektieren. Da jedoch nicht alle Labors mit einer solchen Instrumentierung ausgestattet sind, das hier beschriebene Verfahren kann durch die meisten verwendet werden,Labors und bietet eine einfache und leicht messbare Ergebnisse.
Die Keimung von Bakteriensporen hat in Bacillus und einige Clostridium - Arten untersucht 2,8 weitgehend worden. Das Verfahren wird im allgemeinen erhalten, jedoch Unterschiede bestehen. Wichtig ist , dass nicht alle Organismen mit Mechanismen der Sporenkeimung keimen als 9,27 in den Modell Sporenbildner beobachtet. Da die Keimung in vielfältiger Organismen untersucht immer beschriebene Assay oben kann auf diese Organismen angewendet werden, um Kortex Fragmente während der Sporenkeimung erkennen. Durch die Anwendung dieser Methode auf diese neu suchten Organismen können die Forscher bestimmen die Rolle verschiedener Keimung Proteine in der Rinde Hydrolyse spielen.
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Acknowledgments
Das Projekt beschrieben wird durch Verleihungsnummer 5R01AI116895 aus dem Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position des Nationalen Instituts für Allergien und Infektionskrankheiten oder die National Institutes of Health vertreten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
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