Introduction
Endospores er metabolsk sovende former for bakterier som gjør at bakterier til å vedvare i ugunstige miljøer. I mange sporedannende bakterier, er sporedannelse indusert av næringsmangel, men denne prosessen kan kontrolleres ved endringer i pH, eksponering for oksygen eller andre belastninger 1. Mens i deres metabolsk sovende sporeform, bakterier motstå UV-stråling, uttørking, høyere temperaturer, og frysing 2. Det meste av kunnskapen om sporulation prosessen kommer fra studier i modellorganisme, Bacillus subtilis. Den sporulering Prosessen begynner med DNA-replikasjon og dannelsen av en aksial filament 3,4. En asymmetrisk septum deler deretter cellen i to ulikt størrelse avdelinger. Jo større kupé, moren celle, omslutter mindre rommet, den forespore. Både mor celle og forespore koordinere genuttrykk å modne spore og moren cellen til slutt lyserer, slippe Dormant spore i det omkringliggende miljøet en.
Spore struktur og sammensetning er konservert på tvers av mange bakteriearter. Spore kjernen har et lavere vanninnhold enn den vegetative celle og er rik med dipikolinsyre (DPA) 1,2. I løpet av sporedannelse, er DPA pumpes inn i spore kjerne i bytte for vann. Rundt kjernen er en indre spore membran der, i de fleste sporedannende bakterier, er reseptorer som kjenner igjen de små molekyler som stimulerer spiring (germinants) ligger 2. Ligger like utenfor spore indre membran er et lag med cellevegg av peptidoglykan. En spesialisert peptidoglykan lag (cortex) omgir celleveggen peptidoglykan, og er sammensatt av mange av de samme komponentene som celleveggen peptidoglykan [vekslende N-acetylglukosamin (NAG) og N-acetylmuraminsyren (NAM)]. Men omtrent 50% av NAM-rester i cortex har blitt konvertert til muramic-δ-laktam 5,6 2.
Å styre prosessen med spiring er kritisk viktig for sporedannende bakterier. Spiring startes når spiren reseptorer samhandle med sine respektive germinants 2. I mange sporedannende bakterier, er disse germinants er aminosyrer, sukkere, nukleotider, ioner eller kombinasjoner av disse to. C. difficile sporespiringen initieres ved kombinasjoner av enkelte gallesyrer, [f.eks taurocholinsyre (TA)] og aminosyrer (f.eks glycin) 7-10. Selv om det er forskjeller mellom C. difficile spiring sti og trasé studert i andre sporedannendebakterier, såsom B. subtilis, felles for alle er den absolutt krav for å nedbryte spore cortex for å tillate en vegetativ celle for å vokse fra den spirende spore 2,8. Cortex degradering kan oppnås ved den SCLEs CwlJ / SleB (som finnes i B. subtilis) eller SleC (som finnes i mange Clostridia). Cortex hydrolyse reduserer begrensningen på celleveggen og den spore. Dette tillater full kjerne rehydrering, et nødvendig skritt for å reaktivisere mange av de proteinene som er nødvendige for cellenes stoffskifte to.
Når sporene spire, kan den sovende spore endringer fra en fase-lys tilstand til en fase-mørk tilstand og denne prosessen måles ved en endring i optisk tetthet (OD) ved 600 nm 11. En tidligere rapport tyder på at mye av denne endringen i OD skyldes frigjøring av DPA fra spore 12. Under vår siste undersøkelse, forsøkte vi å sammenligne tidspunktet for C. difficile spore spiring og overvåketfrigjøring av DPA og cortex fragmenter 9. For denne studien var det avgjørende å overvåke utgivelsen av cortex fragmenter som de begynte å bli utgitt av spirende sporer.
Den kolorimetrisk analyse som er brukt her er basert på en metode for påvisning av sukkere med reduserende ender utviklet Ghuysen et al., 13. Fordi andre har beskrevet protokoller for påvisning av reduserende sukker 14 eller har modifisert disse protokollene 15, kan den litteratur på området være forvirrende. Her har vi detalj en trinn-for-trinn fremgangsmåte for den kolorimetriske deteksjon av reduserende sukker frigjort fra spirende C. difficile sporer. Selv om denne studien bruker C. difficile sporer, de reduserende sukkere som frigjøres under spiring av sporer fra andre sporedannende bakterier er i stand til å bli detektert med denne protokollen 9,16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering Samples
- Heat aktivere C. difficile sporer ved 65 ° C i 30 min og butikken på is.
Merk: C. difficile spores kan bli produsert og renset som beskrevet tidligere 7,9,10. - Klargjør spiring løsningen ved X + 1 ml, hvor X er antall prøver som skal tas i løpet av analysen.
Merk: spiring løsningen er spesifikk for de arter av bakterier Spore blir studert. For å analysere C. difficile sporespiringen, anvendte vi en oppløsning av 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glycin og 10 mM taurocholinsyre i avionisert vann. - Før begynner med analysen, tegne en 1,0 ml prøve av spiring løsning uten sporer for å tjene som et emne for cortex fragment deteksjon.
- Legg spores til en OD 600 av ~ 3,0 til spiring løsning og virvle raskt.
Merk: For våre spiring studier i B. subtilis, brukte vi den samme OD 600 sporer som for C. difficile.
Merk: Denne mengden sporer fungerte bra for overvåking cortex fragment utgivelse under C. difficile spore spiring. Mengden av sporer anvendt i denne analyse må bestemmes eksperimentelt for hver enkelt bakterie eller belastning. - Fjern en 1,2 ml prøve umiddelbart etter tilsetting av sporer og sentrifuger ved romtemperatur i 1 min ved 14 000 x g. Dette er nulltidspunktet.
- Overfør 1,0 ml av supernatanten fra den sentrifugerte prøven til et nytt rør for etterfølgende cortex fragmentanalyse.
Bemerk: Dersom DPA må overvåkes, fjerner en separat 100 mL prøve for påvisning av DPA i oppløsning ved anvendelse av en analyse basert på terbium fluorescens 9,18,19. - Fryse den oppsamlede prøven ved -80 ° C.
- Gjenta trinn 1,4 og 1,5 med jevne mellomrom til alle tidspunkter fullført.
Merk: På grunn av tiden som kreves for sentrifugering og prøvetaking, tidspunkter mindre then 2 min fra hverandre var ikke mulig under prosedyren, slik at våre samplingsintervaller var en gang hver 2 min for 14 min. - Som en positiv kontroll for å redusere sukker deteksjon og kvantifisering, omfatter følgende mengder av N -acetylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, og 5000. Fremstilling av disse prøver ved samme tid som prøvene cortex og drives sammen med cortex prøver slik at standardkurven er relevant for data generert av spirende sporer.
- Etter at alle tid punkt prøvene er samlet inn, lyofilisere prøvene.
Merk: Vi lyofilisert våre prøver i 2 ml skrukork.
2. Måling Cortex Fragments
- Resuspender frysetørkede prøvene i 120 ul av 3 N HCl supplert med 1% fenol og 0,5% β-merkaptoetanol.
- Overfør resuspendert prøvene til 2 ml skrukork.
Merk: For reproduserbarhet, sikre all frysetørket prøve resuspendert og overføres. <li> Inkuber prøvene i et resirkulerende vannbad ved 95 ° C i 4 timer. - Etter inkubasjon plassere prøvene på is inntil de er kule.
- Nøytraliser prøvene med 120 ul 3 M NaOH.
- Legg 80 ul av en mettet natriumbikarbonat-oppløsning og 80 pl av en 5% eddiksyreanhydrid oppløsning til hver prøve og virvle.
- Inkuber prøvene ved romtemperatur i 10 min.
- Overfør prøvene tilbake til 95 ° C vannbad i nøyaktig 3 min.
Merk: Dette trinnet er tid sensitive og lengre tider kan påvirke nedstrøms signal utvikling. - Fjerne prøver fra vannbadet og avkjøles på is.
- Legg 400 mL av 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O til hvert rør og virvle.
- Inkuber prøvene i et resirkulerende vannbad ved 95 ° C i nøyaktig 7 min.
Merk: Dette trinnet er tid sensitive og lengre tider kan påvirke nedstrøms signal utvikling. - Fjerneprøvene og sted på is i 5 min.
3. Color Reagens
- Mens prøvene på is (trinn 2.12), forberede farge reagens. Oppløs 0,320 g p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; Ehrlich 's reagens) i 1,9 ml iseddik.
Merk: Reagenset er tid, temperatur og lysfølsomme og bør ikke gjøres på forhånd. - Etter DMAB helt oppløses, tilsett 100 mL av 10 N HCl og virvle.
- Tilsett 5 ml iseddik og virvle.
4. Colorimetric Reaction
- Overføre 100 ul av hver prøve avkjølt cortex i et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Legg 700 mL av nylaget fargeløsning til hver prøve.
- overfører straks prøvene til et 37 ° C vannbad og inkuberes i nøyaktig 20 min.
- Overfør 200 ul av hver prøve til en klar 96-brønns plate.
- Kvantifisere prøvene ved 585 nm på en plateleser. Prøvene skal begynne på en gul farge og en positiv reaksjon vil skifte til lilla. Jo mer cortex til stede, jo dypere lilla farge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 1 viser typiske resultater ved hjelp av NAG standarder. Data brukes til å generere en standardkurve. Tabell 2 viser typiske resultater fra en spiring analyse i spiring buffer supplert med 100 mM glycin og 10 mM TA (spiring fremmende betingelser) eller 100 mM glycin bare (ikke-spirebetingelser). I fravær av TA, C. difficile sporene ikke spirer, og det er liten endring i nærvær av cortex fragmenter i oppløsningen. Imidlertid, i nærvær av både TA og glycin, C. difficile sporer spirer og slipp cortex fragmenter inn i løsningen. Dette observeres som en økning i den ytre diameter 585 over tid av de reagerte prøver. Den totale mengde av cortex fragmenter (nmol) frigitt i løpet av denne analyse ble beregnet ved bruk av en standardkurve tilsvarende figur 1B. I denne analysen blir det meste av cortex hydrolysert (eller frigitt) av 15 minutter etterspiren eksponering, noe som tyder på at mesteparten av sporene har spiret i dette tidsrommet (figur 2, i samsvar med en tidligere publikasjon 7).
Etter å ha utviklet prøvene i fargereagens, kanskje de fleste prøver ikke viser lilla farge for det blotte øye. Figur 1 viser en representativ prøve som genereres fra N-acetylglukosamin. Mange av prøvene viser ikke et synlig lilla farge. Imidlertid, 250 nmol, 500 nmol og 5000 nmol eksempler vises visuelt forskjellig fra den negative kontrollen (0 nmol). Når målt ved OD 585 nm, det signal som genereres best passer en lineær regresjon (R2 = 0,999).
Figur 1:. Oppdager N-acetyl (A) N-acetyl-prøver (0 nmol, 12,5 nmol,25 nmol 50 nmol 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5000 nmol) ble frysetørket og omsatt i henhold til den beskrevne fremgangsmåte. (B) Prøver ble tilsatt til en 96-brønns plate og mengden av omsatt materiale som påvist ved 585 nm. Signalet ble brukt til å generere en standardkurve. 
Fig. 2: grafisk fremstilling spiring Resultater Den beregnede nmol cortex i tabell 2 ble plottet mot tid. (●) 100 mM glycin + 10 mM TA; (■) 100 mM glycin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| NAG Konsentrasjon (nmol) | OD 585 |
| 0 | 0,047 |
| 12,5 | 0,054 |
| 25 | 0,066 |
| 50 | 0,084 |
| 100 | 0,128 |
| 250 | 0,285 |
| 500 | 0,556 |
| 5000 | 4.0 |
| tomme = | 0,046 |
Tabell 1: NAG Standard.
| Clostridium difficile Spore Spiring | ||||
| Spiring løsning (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl) | ||||
| 100 mM Glysin + 10 mM TA | 100 mM Glysin | |||
| Tid (minutter) | OD 585 | Beregnet (nmol) | OD 585 | Beregnet (nmol) |
| 0 | 0,046 | 0,00 | 0,047 | 0,00 |
| 2 | 0,048 | 2,54 | 0,048 | 1.27 |
| 4 | 0,05 | 5,07 | 0,049 | 2,54 |
| 6 | 0,055 | 11.41 | 0,05 | 3,80 |
| 8 | 0,059 | 16.49 | 0,05 | 3,80 |
| 10 | 0,06 | 17.76 | 0,051 | 5,07 |
| 12 | 0,061 | 19.02 | 0,05 | 3,80 |
| 14 | 0,063 | 21.56 | 0,051 | 5,07 |
Tabell 2: Eksempel på Spore Germinatipå resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved stimulering, sporer som gjennomgår prosessen for spiring mister sine motstandsegenskaper uten behov for makromolekylære syntese. Når spore spiring utløses, spore kjernen utgivelser DPA i bytte for vann 2. På grunn av det høye innholdet av DPA sovende spore, er det spore kjernen under intens osmotisk trykk og den spesialiserte peptidoglykan, cortex, bidrar til å hindre at kjernen sveller ved å opptre, formodentlig som en barriere for utvidelse 2.
Fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor bruker Ehrlich 's reagens (en gul oppløsning) for å detektere nærværet av reduserende sukker som en målbar forskyvning til en fiolett fargetone. Under cortex hydrolysen, blir NAG og NAM sukkere frigjort (avhengig av graden av hydrolyserende enzymer, kan sukker bli frigjort som disakkarider eller polysakkarider). Hydrolyse av glykosidiske bindinger av HCl (trinn 2.1) genererer monosakkarider med gratis reduserende ender 7. etter neutralizing syren med en lik mengde av natriumhydroksyd (trinn 2.5), er alkoholene som omgir NAG og NAM-monosakkarider acyleres med eddiksyreanhydrid (trinn 2.6) 13. Deretter blir ikke-omsatt eddiksyreanhydrid omdannes til eddiksyre ved oppvarming av prøven (trinn 2.8). Som en hypotese av Morgan og Elson 20, terminalen aldehyd spontant omdannes til den enolformen. Under alkaliske betingelser (trinn 2.10), kan dette enolformen reagere med det tilstøtende acetyl å generere en oksazol-derivat som reagerer med Ehrlich 's reagens (trinn 4.3) for å generere et lilla farge 15,20.
Denne fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor er konsistent og pålitelige resultater for påvisning av bark fragmenter fra spirende sporer, både B. subtilis og C. difficile 9,16,17. Analysen krever spesiell oppmerksomhet for å sikre at reaksjonstider, temperaturer og prosedyrer utføres med presisjon. Uten riktig oppmerksomhetpå detaljer, er det lett for reaksjonsbetingelsene for å mislykkes eller ikke reprodusere mellom eksperimenter 13. Imidlertid inkludering av en NAG vanlige hjelpemidler i anvendelsen av analysen mellom laboratoriemiljøer. Den NAG positiv kontroll standard inkludert i hvert eksperiment kontroller for alle inter-eksperimentell variasjon (f.eks, små variasjoner i reaksjonstider eller effektiviteten av farge reagens). Reaksjoner med kun bufferbetingelser og reaksjoner med sporer ute av stand til å hydrolysere både cortex ga ingen endring i farge.
Det mest vanlige problem med denne metoden er inter-eksperimentell variabilitet eller fullstendig mangel på signal. For å kontrollere for variasjon, må spore forberedelsene være fri for vegetativ celleavfall. Denne cellerester vil inneholde peptidoglykan fragmenter (NAG og NAM) og vil resultere i et høyt bakgrunnssignal for de spirende sporer. For å sikre en ren spore forberedelse (> 99,9% sporer), se Literature for metoder for å fremstille rene sporesuspensjoner i organismen som skal undersøkes 7,9,21-23.
Hvis analysen ikke er gir noe påvisbart signal, observerte vi at lyofilisering trinnet kan innføre variabilitet. På grunn av den kraft med hvilken vakuumet slippes, observerte vi at den tørkede prøven pulver kan blåses ut av prøverøret. For å redusere / hindre at dette skjer, kan du bruke en liten sprøyte som stikker hull i toppen av prøverør. Det lille området av de innførte hullene vil redusere sannsynligheten for den frysetørkede prøven (nå i pulverform) fra å bli forstyrret. Til slutt, som nevnt i de ovennevnte metoder, flere inkubasjons-trinn er meget følsom tid. Sørg for at alle tidsbestemte trinn overvåkes nøye. En viktig faktor ved denne analyse er at cortex fragmentene må frigjøres fra spirende spore for å bli detektert. Hvis cortex er hydrolysert i store fragmenter, kan disse fragmentene være for stor til å være reledessuten økt gjennom spore strøk. Selv om en viktig faktor når du feilsøker et eksperiment som ikke gir et signal, anbefaler vi å bekrefte at vilkårene brukes til å spire de fleste av sporene i løsningen og de andre feilsøkings alternativene som er oppført her før du vurderer cortex fragment størrelse som et potensielt problem i analysen.
Ikke alle spiring buffere / forholdene er egnet for denne analysen. Fordi denne analysen påviser nærværet av reduserende sukker som frigjøres under spiring prosessen 13, noe spiring buffer som inneholder reduserende sukker, eller en hvilken som helst spiren som er, i seg selv, et reduserende sukker (som glukose) vil resultere i et sterkt signal i denne analysen. Dersom dette er tilfelle, kan høytrykks væskekromatografi (HPLC) anvendes for å detektere nærværet av cortex fragmenter 24-26. Imidlertid, fordi ikke alle laboratorier er utstyrt med en slik instrumentering, fremgangsmåten som her er beskrevet kan benyttes ved de flestelaboratorier og tilbyr enkle og lett målbare resultater.
Spiring av bakteriesporer har i stor grad vært studert i Bacillus og noen Clostridium arter 2,8. Fremgangsmåten blir vanligvis bevart, men forskjeller. Viktigere, ikke alle organismer spire hjelp mekanismer spore spiring som observert i modellspore-formers 9,27. Fordi spiring er å bli studert i flere forskjellige organismer, kan analysen beskrevet ovenfor anvendes på disse organismene for å detektere cortex fragmenter i løpet av sporespiringen. Ved å bruke denne metoden for å disse nylig studert organismer, kan forskerne finne ut hvilken rolle ulike spiring proteiner spille i cortex hydrolyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Prosjektet er beskrevet er støttet av Award Antall 5R01AI116895 fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
