Summary
Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.
Abstract
De specificatie van hemogenic endotheelcellen van embryonale vasculaire endotheel optreedt tijdens korte ontwikkelingsperiodes in verschillende weefsels, en is nodig voor de totstandkoming van definitieve HSPC van de muizen extra embryonale dooierzak, placenta, navelstreng schepen en de embryonale aorta-gonaden-mesonephros ( AGM) regio. De voorbijgaande aard en de geringe omvang van deze cel bevolking maakt haar reproduceerbare isolatie voor een zorgvuldige kwantificering en experimentele toepassingen technisch moeilijk. We hebben een fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) -gebaseerde protocol voor gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC tijdens hun hoogtepunt generatietijden in de dooierzak en AGM vastgesteld. We tonen methoden voor dissectie van de dooierzak en AGM weefsels van muizenembryo's, en we presenteren geoptimaliseerd weefsel spijsvertering en antilichaam vervoeging voorwaarden voor maximale overleving van de cel voorafgaand aan de identificatie en opzoeken via FACS. Vertegenwoordiger FACS analysis percelen zijn aangetoond dat de hemogenic endotheelcellen en HSPC fenotypes te identificeren en beschrijven een-methylcellulose gebaseerde test voor het evalueren van hun bloedvormende potentieel op een klonale niveau.
Introduction
Een functionele vaatstelsel vereist de parallelle ontwikkeling van bloedvaten en bloedcellen. Bij de vroegste stadia van de ontwikkeling van het bloed (primitieve hematopoiese), blijft de oorsprong van erytroblasten heftig gedebatteerd 1. In tegenstelling, in latere stadia van bloedcellen ontwikkeling (definitieve hematopoiese), het is steeds duidelijker dat multi-lijn HSPC voortvloeien uit gespecialiseerde vasculaire endotheliale cellen die bloedvormende potentiële (hemogenic endotheelcellen) binnen de dooierzak, placenta te verwerven, en AGM geworden 2-5, en in de vitelline en navelstreng schepen, de embryonale endocardium 6 en 7 hoofd vasculatuur. De specificatie van hemogenic endotheliale cellen in deze verschillende weefsels komt op specifieke ontwikkelingsstadia; bijvoorbeeld in de dooierzak bij ~ E8.25 en in de AVA bij ~ E10 8-12. Niettemin, zelfs tijdens deze specifieke ontwikkelingsstoornissen ramen, de bevolking van hemogenic endothelial cellen slechts een klein deel van alle endotheelcellen (1-3% van de dooierzak en AGM endotheelcellen) 11,12. Werkwijze hemogenic endotheelcellen "specificatie" cruciaal voor murine, alsook menselijke, hematopoiese. Hematopoëtische cellen is aangetoond dat knop van het endotheel van vaten dooierzak en aorta in menselijke embryo's 13 en verschillende laboratoria hebben aangetoond dat bloedcellen uit pluripotente stamcellen humane endotheelcellen een tussenproduct 14-16 vereist. Aldus definieert het fenotype van muizen hemogenic endotheelcellen en begrijpen van de moleculaire gebeurtenissen die leiden tot de ontwikkeling in dit diermodel zou streven in vitro technieken voor het genereren van hemogenic endotheelcellen van humane pluripotente stamcellen te vergemakkelijken. Op zijn beurt, de uiteindelijke ontwikkeling van een aanpak voor grootschalige productie van gedifferentieerde bloedcellen types van multi-lijn HSPC - zelf Derived uit menselijke pluripotente stamcellen via een fysiologisch relevante hemogenic endotheelcellen intermediair - zou ongelooflijk therapeutisch potentieel voor hematologische, oncologische en regeneratieve geneeskunde. Om dit doel hebben wij het fenotype van hemogenic endotheelcellen gedefinieerd, op een klonaal niveau binnen het muizen dooierzak 11 en AGM 12, twee belangrijke gebieden van definitieve HSPC productie tijdens embryogenese. Zoals HSPC in volwassen beenmerg 17, embryonale hemogenic endotheelcellen en HSPC vertonen Hoechst kleurstof efflux eigenschappen en dus op in de 'side population "(SP) cellen op een FACS plot 5,11,12 (zie figuur 3). Bovendien hebben we aangetoond dat hemogenic endotheelcellen tot expressie markers van zowel endotheelcellen en stamcellen (Flk1 en cKit, respectievelijk), maar de hematopoietische afkomst marker, CD45 5,11,12 niet uitdrukken. Zo kan hemogenic endotheelcellen ident zijnceerde en geïsoleerd door FACS zoals Flk1 + / cKit + / CD45- cellen SP, en we hebben aangetoond dat deze cellen aanleiding geven tot HSPC opgenomen in de Flk1- / cKit + / CD45 + SP fractie van dooierzak en AGM cellen 5,11,12. Hemogenic endotheelcellen en HSPC kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd uit dooierzak of AGM weefsels geoogst uit hetzij vers gedood embryo's of uit embryo's gekweekt gedurende maximaal 48 uur in ex vivo embryokweek (zoals weergegeven in figuur 1). Ex vivo kweken maakt selectieve voorbehandeling van individuele embryo's met farmacologische middelen, en laat ook tijdelijke expressie van gewenste transgenen (namelijk met lentivirale transductie). FACS identificatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC met de hierin beschreven werkwijze kan worden gebruikt als kwantitatieve maat definitieve hematopoietische ontwikkeling van genetisch gemanipuleerde muismodellen; de cellen verkregen kunnen worden voor volgende experimentele toepassingen, met inbegrip van bloed-forming assays, expressie analyse, en transplantatie.
Animal onderwerpen: Bestedingen en ethische overwegingen
Een groeiende hoeveelheid literatuur heeft de belangrijke bijdrage van hemogenic endotheelcellen HSPC formatie tijdens de definitieve hematopoiese stadium van de embryonale ontwikkeling vastgesteld. Toch blijven de fysiologische omstandigheden en signalen die specificatie van een subpopulatie van endotheelcellen aan een hemogenic lot bevorderen slecht begrepen, en dus kan nog niet worden nagebootst in een in vitro omgeving. Sterker nog, de in dit document beschreven technieken zijn momenteel in gebruik door onze lab en andere groepen op het gebied van kennis van hematovascular ontwikkeling, zodanig dat een aanpak voor ex vivo hemogenic endotheelcellen specificatie en HSPC productie zou een dag worden ontwikkeld verbeteren. Tot die tijd, echter, het gebied blijft afhankelijk van primaire weefsels van wild-type (en gentisch gemodificeerde) muizenembryo's te verkrijgen gespecificeerde hemogenic endotheelcellen en HSPC voor verdere studie. Hemogenic endotheelcellen en HSPC betrouwbaar worden geïdentificeerd en geïsoleerd uit ofwel E8.5 (10-12 somieten paar) dooierzak of E10.5 (35-40 somieten paren) AGM 11,12. Als gevolg van de relatieve schaarste van hemogenic endotheelcellen (typisch vertegenwoordigen 1-3% van de totale endotheelcellen 11,12 binnen deze weefsels) het bundelen van weefsels van meerdere (~ 8-10) nestgenoten in een enkel monster wordt sterk aanbevolen om verkrijgen voldoende cellen voor daaropvolgende experimenten. Controle of hemogenic endotheelcellen en HSPC met succes geïdentificeerd en geïsoleerd kunnen worden gebracht door kweken van teruggewonnen cellen onder omstandigheden die hematopoietische differentiatie induceren. Onder deze omstandigheden zal hemogenic endotheelcellen en HSPC multi-lijn hematopoëtische differentiatie vertonen, wat resulteert in het verschijnen van kolonies met erythroid voorlopers (BFU-E), granulocyten en macrofaag voorlopercellen (CFU-GM), en granulocyten, erytrocyten, macrofaag, megakaryocytaire stamvader kolonies (CFU-GEMM).
Protocol
Ethiek Verklaring: Het protocol hieronder beschreven is door en in overeenstemming is met de richtlijnen van, Yale University's Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Hele Embryo Ex V ivo Cultuur voor Yolk Sac Studies (optioneel)
- Euthanize zwangere dammen bij E7.0 - E7.5 en verwijder baarmoederhoorns onder steriele omstandigheden, zoals in meer detail hieronder (stappen 2,4-2,7).
- Aparte hele embryo's (met dooierzak intact 12) uit de omliggende decidua en te schorten in 50 ml hele rat serum in 50 ml polystyreen buizen.
- Gas embryo flessen voor 3 minuten met 5% CO 2 direct zoals eerder beschreven 12,18. Herhaal deze stap bij 24 uur als het kweken van embryo's voor 24 - 48 uur.
- Incubeer bij 37 ° C rolling kweek gedurende 48 uur.
Let op: Embryo's kunnen worden behandeld ex vivo met farmacologische middelen (dat wil zeggen, Notch inhibitor DAP.T 12) of oplosbare eiwitten (bijv fibronectine 19) door middel van pre-incubatie van embryo's voor maximaal 2 uur in kweekmedium dat dergelijke factoren, hetzij door toevoeging van deze elementen aan het rollen kweekmedium voor de gehele lengte van het ex vivo kweken periode. Genexpressie kan worden gemanipuleerd embryo door voorincubatie van embryo's met optimaal getitreerd lentivirus gedurende 2 uur 12. Dooierzak vasculaire en hematopoietische ontwikkeling kan worden gecontroleerd in real-time met behulp van transgene reporter muizen en optische beeldvormende technieken.
2. Dissectie van Yolk Sac (ys) of Aorta-gonaden-mesonephros (AVA) van muizenembryo's
- Steriliseren labtafel door het sproeien en vegen neer alle oppervlakken met 70% ethanol om besmetting in de daaropvolgende celculturen te verminderen. Goed absorberende onderlegger op labtafel oppervlak.
- Steriliseren chirurgische instrumenten met 70% ethanol. Aanbevolen chirurgische instrumenten zijn twee # 5 rechte krachtps, en een 8,5 cm recht schaar.
- Als het werken met embryo's uit ex vivo cultuur, verwijder voorzichtig hele embryo's uit 50 ml Falcon buizen en ga direct naar stap 2.8. Anders, deze stap overslaan en ga dan naar stap 2.4.
- Euthanaseren zwangere dam op geschikte embryonale leeftijd (E8.5 als het oogsten YS; E10.5 indien oogsten AVA).
Opmerking: De beschreven techniek maakt gebruik van een dual-methode euthanasie aanpak - dodelijke dosis van een vluchtig anestheticum gevolgd door een mechanische cervicale dislocatie - te minimaliseren dier pijn en angst, en minimaal invasieve en humane beëindiging van proefdieren te waarborgen. Deze gecombineerde techniek voor kleine knaagdieren euthanasie wordt aanbevolen door de American Veterinary Medical Association wanneer deze wordt uitgevoerd door een opgeleide en ervaren onderzoeker (AVMA Richtlijnen voor de euthanasie van dieren: 2013 Edition).- Verdoven muis met een letale dosis isofluraan (> 5% in O 2) gedurende 3-5 min. (CautiON: Isofluraan is een giftig inhalatie; gebruiken onder een chemische dampkap met geschikte adembescherming persoonlijke beschermingsmiddelen.)
- Na blootstelling van muizen aan isofluraan, controleren ten minste drie tekenen van verdoving niveau - meer verlies van evenwicht, verlies van teen knijpen reflex, en vermindering van de ademfrequentie - onderwerpen te verzekeren hebben een diepe narcose vlak voorafgaand bereikt om te gaan met mechanische euthanasie.
- Cervicaal ontwrichten dam om snel de dood veroorzaken.
- Plaats geëuthanaseerd dam liggende op onderlegger en royaal spuiten onderbuik met 70% ethanol.
- Voeg een verticale incisie langs de middellijn van de onderbuik. Voeg extra ~ 1 inch horizontaal uitstrekkende insnijdingen rechts en links van het midden van de verticale incisie en ontleden weg de buikwand naar rechts en links baarmoederhoorns elk meerdere dragende embryo volledig bloot.
- Met behulp van een tang, houdt u een van de twee baarmoederhoornsen gebruik een schaar om het scheiden van de mesometrium. Plaats ontleed baarmoeder op ijs in steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in een 60 mm polystyreen weefselkweek plaat. Herhaal dit voor andere baarmoeder hoorn.
- Onder een standaard licht dissectie microscoop, een tang om spierlaag van de baarmoeder sac weg te trekken om de onderliggende vruchtzak en decidua onthullen. Isoleer YS (Figuur 2A) door voorzichtig verwijderen van de zak uit de bijgevoegde embryo. Verwijderen YS weefsel van embryo in de embryonale oorsprong van vitelline schepen.
- Aan de AVA te isoleren, verwijder de YS en doorsnijden het embryo onder het niveau van het hart en de voorpoten en gooi de borstkas en het hoofd regio. Vervolgens doorsnijden het embryo net onder het niveau van de achterpoten en te verwijderen en gooi de staart weefsel. Verwijder de achterpoten en overtollige ventrale weefsel van de overblijvende sectie, die de AVA (Figuur 2B) bevat.
- Pool YS of AGM weefsels van meerdere embryo's en op te slaanop ijs in HBSS + (HBSS aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en 100 E / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,3 mg / ml L-glutamine) in een schone buis van 1,5 ml.
3. Digestie van Primary weefsel in een enkele celsuspensie
- Centrifugebuis die geoogst YS of AGM weefsels gedurende 5 minuten bij 2000 xg bij 4 ° C.
- Verwijder supernatant en resuspendeer weefsel in 1 ml van ofwel 0,05% (voor ys) of 0,2% (voor AGM) collagenase type II verdund in HBSS +. Incubeer gedurende 30 min in een waterbad bij 37 ° C, het buisje elke 5 min te mengen.
- Voorzichtig mechanisch distantiëren weefsel door het passeren van het monster 10 keer door middel van een P1000 pipet. Als problemen met het opzuigen van gedeeltelijk verteerd weefsel, kan pipetpunt boring worden verruimd door het afsnijden van ~ 5 mm van de tip met een schaar.
- Centrifugeer monster gedurende 5 min bij 2000 xg bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer in 1 ml ijskoude HBSS +.
- Passeren monster door een 70 &# 956; m cel zeef.
- Aantal cellen met een handmatige of geautomatiseerde hemocytometer.
- Centrifugeer monster gedurende 5 min bij 2000 xg bij 4 ° C. Resuspendeer monster in DMEM + (4,5 g / l glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en 100 E / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,3 mg / ml L-glutamine) pre- verwarmd tot 37 ° C zodanig dat cellen in een eindconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml.
4. De behandeling van cellen met nucleïnezuur Dye en Labeling met fluorescent geconjugeerde antilichamen
- Aliquot tenminste 100 gl monster (1 x 10 5 cellen) in vers 1,5 ml buizen voor antilichaam incubatie.
- Neem de volgende monster en de nodige controle buizen: Ongekleurde; Alleen cKit-APC; Alleen CD45-FITC; Alleen CD31-PE; Alleen Flk1-PECy7; Hoechst 33342 alleen; Hoechst 33342 alleen + verapamil; Monster (ontvangt alle kleuren, zal Verapamil niet ontvangen). Gebruik ten minste 1 x 10
- Voeg Verapamil verdund in 95% ethanol (zie Lees rationale) aan de "Hoechst 33342 Alleen + verapamil" controlebuis tot een eindconcentratie van 50 uM. Incubeer alle buizen gedurende 5 minuten bij 37 ° C. (LET OP: Verapamil is een krachtige calcium-kanaal blokkerende middel en is zeer giftig Handle with handschoenen.).
- Voeg Hoechst 33342 van "Hoechst 33342 only" control, de Hoechst 33342 + Verapamil alleen controle en het "Monster" buis tot een eindconcentratie van 5 ug / ml. Incubeer alle buizen gedurende 1 uur bij 37 ° C, beschermd tegen licht. Voorzichtig meng door elke 15 min. (LET OP: Hoechst 33342 is een giftig nucleair kleurstof en moet met handschoenen worden behandeld).
- Centrifuge alle samples gedurende 5 minuten bij 2000 xg bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellets in een concentratie van 1 x 10 5 cellen / ml in koude HBSS +.
- Voeg fluorescent geconjugeerde antilichamen passende antilichaam alleen controlebuizen en het "Monster" buis tot een eindconcentratie van 2 ug / ml. Incubeer op ijs gedurende 30 min, beschermd tegen licht.
- Centrifuge alle buizen gedurende 5 minuten bij 2000 xg bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer de cel pellet in 500 ul ijskoude HBSS. Strain monsters door middel van mesh filter cap van 5 ml ronde bodem polystyreen FACS buis en op te slaan op ijs, beschermd tegen licht, voor onmiddellijke FACS.
5. Identificatie en isolatie van Hemogenic endotheelcellen en HSPC door FACS
Opmerking: Dit protocol werd geoptimaliseerd onder toepassing van een BD FACSAria 5-lasersysteem met een 100 mw 355 nm UV laser, een 200 mw 405 nm Violet laser, een 200 mw 488 nm blauwe laser, een 200 mw 532 nm groene laser en een 150 mw 637 nm Redlaser. Cellen werden gesorteerd in steriele PBS als omhullingfluïdum en onder aseptische omstandigheden, en door een 100 um mondstuk met stromingssnelheid ingesteld op een gemeten druk van 1, zodat maximaal 1500 - 2000 events per seconde verworven celstress minimaliseren.
- Onder deze hierboven beschreven instellingen gebruik "Ongekleurde" en één kleurcontrole buizen FACS celsortering laserintensiteiten optimaliseren en uitvoeren meerkleurige spectrale compensatieregeling volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik vooruit en zijwaartse verstrooiing naar levende cellen uit te voeren en doublet discriminatie van total evenementen (zie de instructies van de fabrikant voor meer informatie).
Opmerking: Dit protocol resulteert typisch in ~ 70-80% levensvatbare cellen. Als er problemen worden ondervonden met lage levensvatbaarheid van de cellen, ervoor te zorgen dat de weefsels in eerste instantie snel worden ontleed in ijskoude media, en dat alle stappen met uitzondering van die op andere wijze te specificeren op ijs worden uitgevoerd, met zachte pipetteren te snijden en celdood te minimaliseren(Zie: Lees meer details over het behoud van levensvatbaarheid van de cellen). - Gebruik een differentiële lineaire schaal perceel van Hoechst Red versus Blue Hoechst fluorescentie side population (SP) evenementen (figuur 3A) te identificeren. Gebruik "Hoechst 33342 alleen + Verapamil" control als een negatieve controle om te controleren of de juiste poorten worden getrokken voor de steekproef. SP weergegeven als schouder links van de niet-SP cellen, en zal afnemen in de verapamil-behandelde controle. De niet-SP bevolking worden gebruikt om niet-hemogenic EC (figuur 3B) te identificeren.
- Maak extra differentiële fluorescentie plots (log-schaal assen) en trek dochter poorten van de SP om hemogenic endotheelcellen (Figuur 3C-E) te identificeren.
Opmerking: Hemogenic endotheelcellen geprofileerd als Flk1 + / cKit + / CD45- cellen SP (Figuur 3D) en HSPC zijn Flk1- / cKit + / CD45 + cellen SP (Figuur 3E). Hemogenic endotheliale cells kunnen parallel worden geanalyseerd met niet-hemogenic endotheelcellen, waarvan in deze benadering CD31 + / CD45- non-SP cellen (Figuur 3B). - Ophalen hemogenic endotheelcel of HSPC fractie op methylcellulose bevattende platen voor hematopoietische kweek (zie hieronder), of in andere buffers voor verdere verwerking en analyse.
6. hematopoietische Differentiatie in Cultuur
- Voeg 0,5 ml (135 pl / cm2)-methylcellulose gebaseerde hematopoietische kweekmedia gewenste aantal putten van een 24-well weefselkweekplaat bij kamertemperatuur. Voeg 0,5 ml steriel water in ongebruikte putten om verdamping te minimaliseren. Bereid fris en houden bij kamertemperatuur tot gebruik.
- Sorteren 1-10 cellen voor klonale analyse, of tot 1000 hemogenic endotheelcellen (Flk1 + / cKit + / CD45- SP cellen) of HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP cellen) voor bulk expansie en differentiatie direct in elk putje van deplaat met methylcellulose. Kolonievorming wordt aangetroffen bij ongeveer 10 - 20%.
- In een steriele weefselkweek kap, gebruik dan een P1000 tip met het uiteinde bijgesneden tot de boring te verbreden, om voorzichtig resuspendeer elk putje van de gezaaide methylcellulose media 2-3 keer, en zorg voor de schepping van luchtbellen te vermijden. Hierdoor suspensie van de gesorteerde cellen in de halfvaste methylcellulose voor optimale groei.
- Incubeer plaat bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende maximaal 2 weken.
- Monitor enkelvoudige celkweken voor de vorming van gedifferentieerde hematopoëtische cellen kolonies tijd (figuur 4). Score putjes aantal en type van gedifferentieerde hematopoëtische kolonies op dag 1, 3, 7 en 14 met methode (s) hieronder weergegeven in stap 6,7.
- Score platen op dag 1 tot confluentie en levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen bevestigen.
- Per dag 3, kijk voor de vroege vorming van hechtende hemogenic endotheelcellen kolonies met "kasseientone "morfologie (zie Goldie et al. 11 en Marcelo et al. 12 voor de vertegenwoordiging van de dag 3 morfologie).
- Per dag 5-7, controleer voor de vorming van afgeronde HSPC clusters in putjes die naargelang hemogenic EC. HSPC moeten naast worden genomen om hemogenic EG van het weergeven van een "geplaveide" endotheelcellen morfologie afgevlakt.
Opmerking: Hemogenic endotheelcellen moet hematopoïetische kolonies (bepaald volgens hematopoietische kolonieaantal) te vormen, en moeten aantonen multi-lijn differentiatievermogen (bepaald door waarneming van meerdere types kolonie van een enkele cel). We hebben eerder opgemerkt dat ~ 20% van hemogenic EG of HSPC opgehaald door FACS overleven te vormen differentiëren en prolifereren hematopoiëtische kolonies in methylcellulose 11.
- Om de vorming van kolonies door fase microscopie te beoordelen:
- Visualiseren en te tellen kolonies bij een lage vergroting under een fase lichtmicroscoop en identificeren BFU-E, CFU-GM, en CFU-GEMM kolonies door koloniemorfologie, zoals beschreven door Goldie et al. 11.
- Om de vorming van kolonies door celmorfologie te beoordelen:
- Aspireren individuele kolonies van methylcellulose oppervlak in een P1000 tip met het uiteinde bijgesneden tot boring verbreden. Dit vergemakkelijkt het streven van de viskeuze methylcellulose medium en zorgt voor succesvolle ophalen van de kolonie.
- Resuspendeer kolonies opgepikt in 200 ml HBSS en centrifugeren op een glasplaatje met behulp van een cytocentrifuge bij 28 xg gedurende 5 minuten.
- Fix dia's in 100% methanol gedurende 5 minuten (LET OP: Methanol is giftig en mag alleen worden gebruikt in een chemische kap met gepaste ventilatie en persoonlijke beschermingsmiddelen).
- Dompel dia's in 0,04% Giemsa kleuring gedurende 20 min (LET OP:. Giemsa stain bevat methanol Gebruik in een chemische kap met gepaste ventilatie en persoonal beschermingsmiddelen).
- Spoel de dia's in gedemineraliseerd water.
- Mount dia's met dekglaasjes, en het beeld bij een sterke vergroting onder een standaard lichtmicroscoop, het vergelijken van celmorfologie met die klassiek waargenomen in hematopoietische cellen uit volwassen beenmerg die gekweekt in methylcellulose media. Voor voorbeelden, zie instructies van de fabrikant.
- Om de vorming van kolonies door cel expressie van hematopoietische afkomst markers door FACS te beoordelen:
- Voeg 2 ml HBSS aan elk putje van een 24-well plaat met kolonies gekweekt op 0,5 ml methylcellulose (bijv verdunde commercieel verkrijgbare voorraad methylcellulose 1: 4). Pipet op en neer om te mengen, en transfer naar nieuwe buis (s).
- Centrifugeer monster bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C met een standaard tafelmodel microcentrifuge.
- Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet (s) in 1 ml HBSS +, het bundelen van monsters indien gewenst.
- centrifugalege monster bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet (s) in 400 ul HBSS +.
- Aliquot monster in vier 1,5 ml buizen als volgt: Ongekleurde; Alleen B220-FITC; GR-1-FITC alleen; Alleen TER119-FITC.
- Add fluorescent geconjugeerd antilichaam aan juiste buisje een eindconcentratie van 2 ug / ml. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Centrifugeer monster bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer de cel pellet in ijskoude 0,5 ml HBSS.
- Analyseer elk monster door FACS op expressie van elke hematopoietische afkomst marker: B220 markeert B-cellen 20; GR-1 merken myeloïde cellen 21; TER119 markeert erythroïde cellen 22.
Opmerking toevoeg antilichamen gericht op andere hematopoietische afkomst merkers kunnen in deze benadering worden opgenomen, indien gewenst.
Representative Results
Succesvolle etikettering van hemogenic endotheelcellen en HSPC uit embryonale YS of AGM zal FACS spreidingsdiagrammen vergelijkbaar met de representatieve percelen in figuur 3. Na standaard levende cellen en doublet discriminatie opleveren in voorwaartse en zijwaartse verstrooiing (niet getoond), side population (SP) gebeurtenissen worden gevisualiseerd in een lineaire Hoechst Hoechst Red versus Blue differentieel plot in afwezigheid van verapamil als een "schouder" links verschoven van de meeste (non-SP) events (Figuur 3A). Als de SP poort goed is opgesteld, zal SP cellen vertegenwoordigen ongeveer 1-3% van de totale levensvatbare YS cellen en 3-5% van de totale levensvatbare AGM evenementen. Verapamil behandeling leiden tot> 50% remming van SP gebeurtenissen ongeacht weefselbron (Figuur 3A, bovenste panelen). We hebben eerder vastgesteld dat andere populaties die buiten de SP schouder weergegeven maar worden ook geblokkeerd door verapamil zijn TER119-positieve erythroblasts, en worden daarom uit de SP bevolking 5 uitgesloten.
Vergeleken met de SP worden de niet-SP cellen geïdentificeerd als de dichte cluster van cellen grenzend aan de SP "schouder" (Figuur 3A). Deze populatie bestaat uit niet-Hemogenic EG, die kunnen worden onderscheiden met behulp van een CD31-PE versus CD45-FITC dochter perceel (Figuur 3B), zoals CD31 + / CD45- evenementen. Niet-Hemogenic EC typisch 2-5% niet-SP cellen van AGM (figuur 3B) of dooierzak (niet getoond), en hoge aantallen van deze cellen terug met relatief gemak worden gesorteerd.
Voor de identificatie van HSPC en Hemogenic EG zijn dochter gates getrokken uit de SP fractie identificeren CD45 + en CD45- cellen, waarbij CD45 + cellen typisch <20% van de totale gevallen in beide AGM (figuur 3C) of YS (niet getoond). Hemogenic EG worden vervolgens geïdentificeerd uit CD45- cellen in een differentiële cKit-APC vs. Flk1-PECy7 dochter ppartij als dubbel-positieve gebeurtenissen en typisch vertegenwoordigen 1-3% van CD45- gebeurtenissen wanneer geïsoleerd uit ofwel AGM (Figuur 3 D) of YS (niet getoond). HSPC worden geïdentificeerd uit de CD45 + fractie in een aparte cKit-APC versus Flk1-PECy7 dochter plot als Flk1- / cKit + cellen, en ook typisch vertegenwoordigen ongeveer 25 - 30% van de kleine populatie CD45 + cellen als verkregen bij YS (niet getoond) of AGM (figuur 3 E). Dus zowel Hemogenic EG HSPC zijn uitzonderlijk zeldzaam (~ 0,01% van totaal cel gebeurtenissen), en het is typerend voor dit protocol om enkele honderden van elk celtype zelfs wanneer weefsel van meerdere embryo's worden samengevoegd terugkeren. Gates in dochter plots moet worden vastgesteld aan de hand van negatieve controle groepen. Voor het onderscheid tussen specifieke en niet-specifieke antilichaam kleuring moet poorten aanvankelijk opgesteld moet worden aan zowel Ongekleurde (Afbeelding 3C), alsook monsters die zijn behandeld met fluorescent geconjugeerd isotype-gematchte (IgG2A of IgG2b) controle-antilichamen (niet getoond). Deze laatste controle heeft aangetoond dat niet-specifieke kleuring minimaal is door dit Protocol, dus terwijl we raden isotype-gematchte controle antilichamen (bijv., IgG2A-PE of IgG2b-FITC) in eerste instantie worden gebruikt voor FACS sorter instellingen te optimaliseren en te bepalen gate grenzen , vinden we ook dat ongekleurde controles voldoende zijn om de poort grenzen en experimentele kwaliteit te controleren tijdens routine FACS sortering. Als de juiste poorten zijn opgesteld, dienen een minimale positieve scatter worden waargenomen in enkele of dubbele-positieve poorten bij het opnemen van ongekleurd of-isotype gematchte controles.
Hemogenic endotheliale cellen van de AVA en HSPC ondergaan hematopoietische differentiatie meer dan 14 dagen van cultuur in methylcellulose (Figuur 4A). Het relatieve aandeel van de kolonie types meestal waargenomen in dezeculturen afhankelijk weefselbron. Hemogenic endotheelcellen geïsoleerd uit dooierzak weefsels bij E8.5-E9.5 aanleiding geven tot BFU-E, CFU-GM, en weinig CFU-GEMM 5, terwijl hemogenic endotheelcellen geïsoleerd uit E10.5 AGM leiden overwegend CFU -GEMM 12, hoewel andere geslachten nog opgemerkt dat, zoals getoond in figuur 4B (linker paneel). HSPC geïsoleerd uit E10.5 AGM geven ook voornamelijk stijgen tot CFU-GEMM op cultuur in methylcellulose (figuur 4B, top middelste paneel), hoewel deze cellen zal ook differentiëren naar andere soorten hematopoietische kolonie ook. Non-hemogenic endotheelcellen (CD31 + / CD45- non-SP) zijn ook verzilverd (figuur 4B, hoogste rechter paneel). Deze cellen tonen geen groei in de hematopoietische cultuur na 14 dagen.
Assays van hematopoietische van de afzonderlijke oppervlakte marker expressie celtypen, waaronder cellen met en zonder expressie van een hematopoëtischend endotheliale markers CD31, Flk1, c-Kit, VE-cad, CD41, en CD45 binnen de SP fractie van de AVA op E10.5 zijn uitgevoerd en tonen aan dat multi-lijn kolonievormende activiteit in de E10.5 AVA wordt beperkt aan CD31 +, VE-cadherine +, c-Kit +, CD41 + en CD45 + cellen 12 SP. Interessant was kolonievormende activiteit opgemerkt in zowel Flk-1 + en Flk-1- SP-cellen, maar slechts Flk1 + c-Kit + CD45- cellen SP leidde multi-lijn kolonies via een endotheel monolaag tussenproduct gekenmerkt door zowel "kei "endotheelcellen morfologie (figuur 4B, linksonder paneel) en Dil-AcLDL opname 12. Bovendien expressie van c-kit is noodzakelijk voor hematopoietische activiteit van AGM SP 12 cellen.
Terwijl is aangetoond dat sommige myeloïde progenitoren vergelijkbare morfologische kenmerken dan hemogenic endotheelcellen, myeloïde progenitorcellen tot expressie CD45 en kan genereren multi-lijn kolonies
Figuur 1. Algemene workflow. Kortom, embryo's worden verwijderd uit zwanger dammen, en YS of AGM weefsels worden geoogst. Embryo's kunnen eventueel worden gekweekt voor 2 4-48 uur ex vivo voorafgaand aan weefsel oogsten. Geoogste YS of AGM weefsels gedigesteerd een enkele celsuspensie verdeeld in controle en monsterbuizen en geïncubeerd in aanwezigheid van Hoechst kleurstof en / of fluorescent-geconjugeerde antilichamen. Verapamil, een calciumkanaalblokker remmer, wordt ook gebruikt om een negatieve controle voor het controleren van nauwkeurige gating van de SP fractie te genereren. Hemogenic endotheelcellen worden geïdentificeerd door FACS zoals Flk1 + / cKit + / CD45- cellen SP, terwijl HSPC zijn opgenomen in de Flk1- / cKit + / CD45 + SP fractie van cellen; beide celtypen zijn gesorteerd op methylcellulose voor de bevestiging van hemogenic potentieel. Bovendien kunnen niet-hemogenic endotheelcellen worden gediscrimineerd (en opgehaald, indien gewenst) als CD31 + / CD45- non-SP-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
IGUUR 2 "src =" / files / ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg "/>
Figuur 2. Dissectie van YS en AGM Doekjes. A) De YS wordt verwijderd ontleed van E8.5 embryo's, en geplaatst geheel in steriele HBSS + voor de volgende spijsvertering. B) De stam van E10.5 embryo wordt geïsoleerd door het maken van horizontale bezuinigingen onder zowel de voorpoot en achterbeen knoppen. De AVA wordt dan gescheiden van de ledematen en het ventrale weefsel met behulp van een tang. C) Helder-gebied beelden tonen ontleding van zowel de YS en AGM van een E10.5 embryo (schaal = 1 mm). Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
Figuur 3. Representatieve Plots Aantonen Gate Hiërarchie Discriminatievan Hemogenic endotheelcellen s (Flk1 + / cKit + / CD45- SP-cellen), HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP-cellen), en niet-hemogenic endotheelcellen (CD31 + / CD45- non-SP) door FACS van E8.5 YS of E10.5 AGM. Na levende cellen en doublet discriminatie van cellen van ofwel YS (linker panelen) of AGM (rechter panelen) van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing (niet getoond), A) side population (SP) poort wordt vastgesteld en geverifieerd een significante daling van de SP fractie in het Verapamil behandelde negatieve controle. De niet-SP populatie is geïdentificeerd als de dichte cluster van cellen naast de SP. In elk van de gepresenteerde plots 20.000 gebeurtenissen worden B) Niet-hemogenic endotheelcellen worden geïdentificeerd als CD31 + / CD45- cellen in de niet-SP fractie en bedroeg 2 -. 5% van niet-SP cellen, ook verkregen van AGM (weergegeven ) of YS (niet getoond). om DISCRIminate Hemogenic EG of HSPC, C) dochter poorten zijn afkomstig uit de SP fractie CD45 + en CD45- cellen. D) identificeren identificeren hemogenic endotheelcellen van ofwel AGM (getoond) of YS (niet getoond) extra dochter poorten getekend van de CD45- fractie cKit + (vs. cKit-) en Flk1 + (vs. Flk1-) cellen te onderscheiden. Hemogenic EG van ofwel YS of AGM zijn meestal ~ 1-3% van CD45- gebeurtenissen E) HSPC worden geïdentificeerd uit de CD45 + fractie als cKit + en Flk1-, en typisch vertegenwoordigen 20 -. 30% van de CD45 + cellen, ook gesorteerd van AGM (getoond ) of YS (niet getoond). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Visuabiliseren van hematopoietische Differentiatie volgende Cultuur van Hemogenic endotheelcellen en HSPC op Methylcellulose. A) Kolonies vorm van gesorteerde individuele cellen binnen 7 dagen na plating op methylcellulose. Multi-lijn hematopoietische potentieel kan worden bevestigd door waarneming van meerdere hematopoëtische soorten kolonie, die door evaluatie van afzonderlijke kolonie morfologie 11. B) fase microscopische beeldvorming van gesorteerd hemogenic EG en HSPC van AGM (of YS, niet getoond) tonen multi-lijn hematopoietische kolonievorming na 7 dagen van de cultuur in methylcellulose kweekmedium. Niet-hemogenic EG AGM (of YS, niet getoond) niet aantonen groei onder deze omstandigheden. Bij hogere vergroting, kan hechtende cellen met klassieke "geplaveide" endotheliale celmorfologie (witte pijl) te zien die tot clusters van hematopoietische cellen in culturen van hemogenic EG; geen dergelijke endotheelcellen worden waargenomen in kweken van gesorteerde HSPC (schaal = 100 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Blijven er veel onbeantwoorde vragen op het gebied van hematovascular ontwikkeling - een gebied dat nog in de kinderschoenen staat als gevolg van de technische problemen die inherent zijn aan het bestuderen van voorbijgaande aard en kleine cel populaties die alleen ontstaan tijdens specifieke ontwikkelingsstoornissen ramen. De hierboven beschreven technieken verbeteren veel van deze problemen doordat voor isolatie van zelfs individuele cellen van de hemogenic endotheelcellen en HSPC populaties in embryonale weefsels op kritieke punten ontwikkelingstijd gebruiken reagentia en apparatuur die gewoonlijk in de meeste laboratoria zijn. Ons protocol maakt ook parallelle isolatie van niet-hemogenic endotheelcellen fracties uit de YS en AGM, die gebruikt kunnen worden voor onafhankelijke analyses of controles voor de hemogenic endotheliale celfractie in latere analyses.
Een belangrijk punt bij de isolatie van de hemogenic endotheelcellen met deze veelkleurige FACS gebaseerde methode is geschikt spectrale compensation en nauwkeurige tekening van één kleur poorten. Als zodanig is het sterk aanbevolen dat ongekleurde en single-color controles worden opgenomen in alle experimentele runs, en dat zij - samen met monsters die werden behandeld met isotype-gematchte controle antilichamen - worden gebruikt om de juiste spectrale compensatie en tekening van poorten in eerste instantie vast te stellen. Echter, niet-specifieke kleuring minimaal is door dit protocol, waardoor ongekleurde en single-color controles zijn toereikend voor routinematige controle van poorten eenmaal FACS sorter instellingen zijn geoptimaliseerd.
Onnauwkeurig opgesteld SP poorten zijn een bijzonder belang bij de aanpak in dit rapport beschreven. Eerdere studies hebben aangetoond dat multipotente stamcellen vertonen preferentiële efflux van Hoechst rood 17, die de fysiologische basis voor hun verschijning in de SP door FACS. We hebben aangetoond dat hemogenic endotheelcellen en HSPC zijn eveneens gevonden in de SP celfractie 5,11. Geneesmiddelen zoals calcium kanaalhibitor Verapamil Blokkeer deze Hoechst kleurstof uitstroom gedrag in de SP-cellen via blokkade van een verscheidenheid aan transmembraan multidrug resistance transporters. In hematopoietische stamcellen en voorlopercellen, dit gebeurt voornamelijk via de ABCG2 / BCRP1 transporter 24. Typisch verapamil induceert> 50% verstopping van de SP, maar de totale mate van Hoechst efflux en de daaropvolgende versperring door Verapamil gezien is aangetoond worden beïnvloed door faseveranderingen, vermoedelijk als gevolg van veranderende expressie van meerdere multidrug resistente soorten transporteur met differentiële Hoechst efflux capaciteit, en de gevoeligheid voor Verapamil 5. Zo is het sterk aanbevolen dat Verapamil behandeld Hoechst-gekleurde negatieve controle worden standaard meegeleverd om een goede SP gating verzekeren: als een SP-poort goed is opgesteld, moet een aanzienlijke vermindering van het aantal SP cellen worden gedetecteerd in monsters gekleurd met Hoechst in de aanwezigheid van verapamil.
We hebben eerder aangetoond dat gesorteerdSP cellen van het E9.5 muizen dooierzak een ~ 80 - 90-voudig groter vermogen om HSPC in methylcellulose gebaseerde hematopoietische kweek genereren in vergelijking met een vergelijkbare aantal E9.5 gefractioneerde, niet-Hoechst gekleurd hele YS weefselcellen 5. Verdere karakterisatie van de SP blijkt dat in de muizen dooierzak tijdens de vroege hematopoietische en vasculaire ontwikkeling bij E8.0 er aanzienlijke expressie van VE-cadherine en Flk-1, maar lage expressie van stamcellen (c-kit) en hematopoïetische merkers (CD45). Dus bij deze ontwikkelingsfase tijdstip, oorspronkelijke (niet-hemogenic) EG, gedefinieerd als Flk-1 + / CD31 + / CD45- cellen SP niet overheersen. Deze uitdrukking profiel verschuivingen als endotheliale marker expressie afneemt en CD45 en c-Kit expressie toeneemt, gelijktijdig met een toenemend vermogen om HSPC genereren in vitro tussen E9.5 en E11.5 5. Dit suggereert hematopoietische activiteit van YS weefsel wordt opgenomen in de SP, en werd het meest duidelijk tussen E9.5 en E11.5, en occurring door middel van een getimede verlies van endotheliale kenmerken en de geleidelijke overname van hematopoietische capaciteit. Als zodanig, expressie van het multidrug resistance transporters die aanleiding geven tot de SP fenotype belangrijke fenotypische marker van hemogenic endotheel 5; in feite, niet-SP cellen van de AVA geen bloed-vormende potentieel 12 vertonen. Aldus succesvolle isolatie van de SP via Hoechst kleuring in zowel de YS en AGM zorgt ervoor dat cellen worden gesorteerd van de hematopoietische stamcel compartiment van een bepaald weefsel, en daaropvolgende antilichaam kleuring van cellen in deze fractie zich onderscheid van de hemogenic mogelijk (Flk -1 + / c-kit + / CD45-) versus HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) populatie 5,11,12. Verder is eerder opgemerkt dat CD41 + cellen in het SP van de dooierzak en AGM weefsels kunnen multi-lijn kolonievorming in methylcellulose gebaseerde cultuur 11,12. We definiëren hemogenic endotheelcellen Flk1 + c-Kit + CD45- cellen SPs met behulp van CD45 als een aangewezen marker van hematopoietische afkomst in plaats van CD41 gezien onze vinden dat de expressie van Flk1 en CD45 is vrijwel wederzijds exclusief 5,11. Hierdoor kan een zuivere scheiding van cellen in de SP dat beide endotheel hebben (Flk-1) en stam kenmerken (c-kit) die nodig zijn voor endotheliale hematopoietische overgang, maar die nog niet ondergaan deze verandering, zoals bepaald door de afwezigheid van CD45 in deze cellen. Het zou nuttig zijn om sub-fractionering van de HSPC bevolking, gedefinieerd als Flk-1 / c-Kit + / CD45 + / SP cellen in Csf1r + (weefsel macrofagen) en Csf1r- (HSC) fractie beschouwen als recente rapporten van Gomez en collega 25, aangezien dit grotere resolutie van de ware HSPC versus weefsel macrofaag voorlopercellen bevolking zou bieden, maar dit mag niet van invloed op de integriteit van de hemogenic endotheelcellen breuk waarvan de isolatie we sinds Csf1r hebben geschetst is een marker van macrofaag voorlopercellen 26.
Hemogenic endotheelcellen zeldzame subpopulatie zowel YS en AGM (omvattende 1-3% van endotheliale cellen), en daarom een grote uitdaging in hun studie onvoldoende celopbrengst voor latere aanvragen. Dit protocol leidt meestal tot 70-80% van de cellen nog levensvatbaar tijde van sorteren en een typische hemogenic endotheelcel soort uit samengevoegde weefsel van meerdere embryo kan slechts enkele honderden cellen opbrengst zelfs onder optimale omstandigheden met slechts 10-20% opgehaalde cellen ingebed in methylcellulose producerende kolonies. Om gesorteerde aantal cellen te maximaliseren, is het sterk aanbevolen dat de onderzoekers te nemen stappen om weefsel en de levensvatbaarheid van de cellen in de gehele elke stap van de procedure: weefsels moeten snel worden ontleed en samengevoegd, en monsters moeten op het ijs zoveel mogelijk worden gehouden. De monsters moeten vers worden bereid onmiddellijk voorafgaand aan FACS sorteren, en gesorteerd in verzameling buizen met een hoog gehalte aan serum, of direct in methylcellulose cultuur als beschrijvend hierboven. Als levensvatbaarheid problemen blijven, verzamelbuizen kan ook vooraf bekleed met serum verder te verbeteren gesorteerde celoverleving. Als hemogenic endotheliale cel opbrengst laag blijft, kunnen volwassen beenmerg of in de handel verkrijgbare fluorofoor-geconjugeerde kralen worden gebruikt voor spectrale schadevergoeding in plaats van het embryonaal weefsel afgeleide enkele kleur controles hierin beschreven. Als gesorteerde cellen zijn bestemd voor cultuur, moet hemogenic endotheelcellen en HSPC direct worden gesorteerd in weefselkweek wells. Wanneer gesorteerde cellen bestemd voor DNA- of RNA-gerelateerde genexpressie analyse hemogenic en niet- hemogenic endotheelcellen en HSPC kunnen direct worden gesorteerd in verzamelbuizen bevattende monster lysisbuffer naar cel te minimaliseren.
De beschreven techniek maakt succesvolle (en gelijktijdig) isolatie van hemogenic en niet- hemogenic endotheelcellen, alsook HSPC en volgroeide bloedcel fracties uit dezelfde embryonale weefsels. Deze aanpak maakt het mogelijk verder study van de moleculaire onderbouwing van de kritische overgangen die optreden als endotheelcellen genereren bloed. Inzichten uit deze ontwikkeling studies kan vervolgens worden gebruikt voor het genereren van humane hemogenic endotheelcellen en HSPC nageslacht optimaliseren van pluripotente, en mogelijk autologe stamcellen voor de behandeling van hematopoietische voorkomende aandoeningen.
Disclosures
Dit werk werd ondersteund byNIH subsidies HL128064, HL096360, EB017103 en CT Innovaties verlenen 15-RMB-YALE-04, te KKH en NICHD / NIH T32HD007094.
Acknowledgments
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
| Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
| 100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
| Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
| Falcon 70 μM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
| Anti-Mouse CD31 - PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
| Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
| Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H2O, store aliquots at -20 °C until ready for use. |
| Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol. Store at -20 °C until ready for use |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
| Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
| Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
| Anti-Mouse B-220 - FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
| Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
| Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
| IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
| IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |
References
- Hirschi, K. K. Hemogenic endothelium during development and beyond. Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).
- Boisset, J. C., et al. et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).
- Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development. Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).
- Nakano, H., et al. Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis. Nat Commun. 4, 1564 (2013).
- Li, Z., et al. Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo. Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).
- Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
- Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
- Tavian, M., et al. Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood. 87 (1), 67-72 (1996).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).
- Kelly, M. A., Hirschi, K. K. Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), (2010).
- Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation. Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).
- Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).
- Kina, T., et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage. British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).
- Jackson, K. A., et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
