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Developmental Biology

Murine भ्रूण Hemogenic endothelial कोशिकाओं के अलगाव

Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/54150
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Departments of Medicine, Genetics and Biomedical Engineering, Yale Cardiovascular Research Center, Vascular Biology and Therapeutics Program, Yale Stem Cell Center, Yale University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPC) के विकास के दौरान विशेष (hemogenic) endothelial कोशिकाओं से निकाले जाते हैं, फिर भी थोड़ा प्रक्रिया है जिसके द्वारा कुछ endothelial कोशिकाओं को रक्त बनाने बनने के लिए निर्दिष्ट के बारे में जाना जाता है। हम एक प्रवाह cytometry आधारित पद्धति hemogenic endothelial कोशिकाओं और murine भ्रूण ऊतकों से HSPC के एक साथ अलगाव की इजाजत दी प्रदर्शित करता है।

Abstract

भ्रूण संवहनी endothelium से hemogenic endothelial कोशिकाओं के विनिर्देश अलग ऊतकों के भीतर संक्षिप्त विकासात्मक अवधि के दौरान होता है, और murine अतिरिक्त भ्रूण जर्दी थैली, नाल, नाल वाहिकाओं, और भ्रूण महाधमनी-gonad-मेसोनेफ्रॉस से निश्चित HSPC के उद्भव के लिए आवश्यक है ( एजीएम) क्षेत्र। क्षणिक प्रकृति और इस सेल की आबादी के छोटे आकार सावधान मात्रा का ठहराव और प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए अपनी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव तकनीकी रूप से कठिन बना देता है। हम जर्दी थैली और एजीएम में अपने चरम पीढ़ी समय के दौरान एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC के एक साथ अलगाव के लिए (FACS) आधारित प्रोटोकॉल की स्थापना की है। हम जर्दी थैली और माउस भ्रूण से एजीएम ऊतकों के विच्छेदन के लिए तरीकों का प्रदर्शन, और हम FACS के माध्यम से पहचान और पुनः प्राप्ति से पहले अधिक से अधिक सेल अस्तित्व के लिए अनुकूलित ऊतक पाचन विकार और एंटीबॉडी की स्थिति प्रस्तुत करते हैं। प्रतिनिधि FACS एनासेल भूखंडों कि hemogenic endothelial सेल और HSPC phenotypes की पहचान है, और एक प्रतिरूप स्तर पर उनके रक्त के गठन के संभावित मूल्यांकन के लिए एक methylcellulose आधारित परख का वर्णन दिखाए जाते हैं।

Introduction

एक कार्यात्मक संचार प्रणाली रक्त वाहिकाओं और रक्त कोशिकाओं के समानांतर विकास की आवश्यकता है। खून विकास (आदिम hematopoiesis) के शुरुआती दौर में erythroblasts के मूल सख्ती 1 बहस रहता है। इसके विपरीत, रक्त कोशिका विकास (निश्चित hematopoiesis) के बाद के चरणों में, यह तेजी से स्पष्ट है कि बहु-वंश HSPC विशेष संवहनी endothelial कोशिकाओं है कि जर्दी थैली, नाल के भीतर रक्त के गठन के संभावित (hemogenic endothelial कोशिकाओं) के अधिग्रहण, और एजीएम से उठता बन गया है 2-5, साथ ही पीतक और नाल वाहिकाओं, भ्रूण अंतर्हृदकला 6, और सिर वाहिका 7 में। ये अलग ऊतकों के भीतर hemogenic endothelial कोशिकाओं के विनिर्देश विकास के विशिष्ट चरणों में होता है; उदाहरण के लिए, ~ E8.25 पर जर्दी थैली के भीतर और ~ E10 8-12 पर एजीएम के भीतर। बहरहाल, यहां तक ​​कि इन विशिष्ट विकास खिड़कियों के दौरान, hemogenic एंडो की आबादी11,12 - (जर्दी थैली और एजीएम endothelial कोशिकाओं के 3% 1) thelial कोशिकाओं सभी endothelial कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व करता है। hemogenic endothelial सेल "विशिष्टता 'की प्रक्रिया के रूप में अच्छी तरह से मानव, hematopoiesis के रूप में, murine के लिए महत्वपूर्ण है। Hematopoietic कोशिकाओं की जर्दी थैली वाहिकाओं के endothelium और मानव भ्रूण 13 में महाधमनी से कली को दिखाया गया है, और कई प्रयोगशालाओं दिखा दिया है कि मानव स्टेम कोशिकाओं से रक्त कोशिका के उत्पादन एक endothelial सेल मध्यवर्ती 14-16 की आवश्यकता है। इस प्रकार, murine hemogenic endothelial कोशिकाओं के phenotype को परिभाषित करने और आणविक घटनाओं है कि इस पशु मॉडल में उनके विकास के लिए नेतृत्व मानव स्टेम कोशिकाओं से hemogenic endothelial कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए इन विट्रो प्रौद्योगिकियों की खोज की सुविधा चाहिए समझने। बदले में, बहु-वंश HSPC से विभेदित रक्त कोशिका प्रकार के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक दृष्टिकोण के अंतिम विकास - खुद को देरीमानव स्टेम कोशिकाओं से वेद एक physiologically प्रासंगिक hemogenic endothelial मध्यवर्ती सेल के माध्यम से - hematologic, Oncologic और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए अविश्वसनीय चिकित्सीय क्षमता होगा। इस लक्ष्य की ओर, हम embryogenesis दौरान निश्चित HSPC उत्पादन का 11 और एजीएम 12, दो प्रमुख स्थलों थैली murine जर्दी भीतर hemogenic endothelial कोशिकाओं के phenotype परिभाषित किया है, एक प्रतिरूप स्तर पर। वयस्क अस्थि मज्जा 17, भ्रूण hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC प्रदर्शनी Hoechst डाई तपका गुण भीतर HSPC और इसलिए तरह "पक्ष जनसंख्या" के भीतर एक FACS साजिश 5,11,12 (के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है) पर कोशिकाओं की (सपा) दिखाई देते हैं। इसके अलावा, हम भी पता चला है कि hemogenic endothelial कोशिकाओं दोनों endothelial के मार्करों व्यक्त करने और कोशिकाओं (Flk1 और cKit, क्रमशः) स्टेम, लेकिन hematopoietic वंश मार्कर, CD45 5,11,12 व्यक्त नहीं करते। इस प्रकार, hemogenic endothelial कोशिकाओं अध्यक्ष हो सकता हैified और FACS द्वारा पृथक रूप Flk1 + / cKit + / CD45- सपा कोशिकाओं, और हम पता चला है कि इन कोशिकाओं की जर्दी थैली और एजीएम कोशिकाओं 5,11,12 के Flk1- / cKit + / CD45 + सपा अंश के भीतर निहित HSPC को जन्म दे। Hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC पहचान की जा सकती है और जर्दी थैली या एजीएम ऊतकों या तो हौसले euthanized भ्रूण से काटा से अलग, या पूर्व vivo भ्रूण संस्कृति में अप करने के लिए 48 घंटे (चित्रा 1 में दिखाया गया के रूप में) के लिए सुसंस्कृत भ्रूण से। पूर्व vivo संस्कृति चयनात्मक परमिट औषधीय एजेंटों के साथ व्यक्तिगत भ्रूण के पूर्व उपचार, और भी वांछित ट्रांसजीन (यानी, lentiviral पारगमन द्वारा) के क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC साथ साथ वर्णित विधि द्वारा की पहचान FACS आनुवंशिक छेड़छाड़ माउस मॉडल में निश्चित hematopoietic विकास का एक मात्रात्मक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है; कोशिकाओं को भी रक्त एफओ सहित बाद में प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए लिया जा सकता हैrming assays, अभिव्यक्ति विश्लेषण, और प्रत्यारोपण।

पशु विषयों: उपयोग करता है और नैतिक आधार

साहित्य की बढ़ती शरीर भ्रूण के विकास के निश्चित hematopoiesis चरण के दौरान HSPC गठन के लिए hemogenic endothelial कोशिकाओं के महत्वपूर्ण योगदान की स्थापना की है। फिर भी, शारीरिक स्थिति और संकेत है कि एक hemogenic भाग्य की दिशा में endothelial कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या के विनिर्देश को बढ़ावा देने के खराब समझ रहते हैं, और इसलिए अभी तक इन विट्रो सेटिंग में मजाक उड़ाया नहीं जा सकता है। दरअसल, तकनीक इस पत्र में वर्णित हमारी प्रयोगशाला और अन्य समूहों द्वारा उपयोग hematovascular विकास, ऐसा है कि पूर्व vivo hemogenic endothelial सेल विनिर्देश और HSPC उत्पादन के लिए एक दृष्टिकोण एक दिन विकसित किया जा सकता है की इस क्षेत्र की समझ में सुधार करने में वर्तमान में कर रहे हैं। ऐसे समय में जब तक, हालांकि, क्षेत्र (जंगली प्रकार से प्राथमिक ऊतकों और जीन पर निर्भर रहता हैtically संशोधित) माउस भ्रूण आगे के अध्ययन के लिए hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC निर्दिष्ट प्राप्त करते हैं। Hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC मज़बूती से पहचान की है और या तो E8.5 से अलग किया जा सकता है (10 - 12 विखंड जोड़े) जर्दी थैली या E10.5 (35 - 40 विखंड जोड़े) एजीएम 11,12। Hemogenic endothelial कोशिकाओं के सापेक्ष कमी के कारण (आम तौर पर 1 का प्रतिनिधित्व - कुल endothelial कोशिकाओं इन ऊतकों के भीतर 11,12 के 3%) एकाधिक से ऊतकों की पूलिंग (~ 8 - 10) एक भी नमूना में littermates जोरदार क्रम में करने के लिए सिफारिश की है बाद में प्रयोग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करते हैं। सत्यापन कि hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC सफलतापूर्वक पहचान की गई है और अलग-थलग स्थिति है कि hematopoietic भेदभाव प्रेरित तहत लिया गया कोशिकाओं की संस्कृति के द्वारा पूरा किया जा सकता है। इन शर्तों के तहत, hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC बहु-वंश hematopoietic भेदभाव प्रदर्शन करेंगे, ery युक्त कालोनियों की उपस्थिति में जिसके परिणामस्वरूपthroid पूर्वज (BFU-ई), granulocyte और मैक्रोफेज पूर्वज (CFU जीएम), और granulocyte, एरिथ्रोसाइट, मैक्रोफेज, megakaryocyte पूर्वज कालोनियों (CFU-GEMM)।

Protocol

आचार कथन: प्रोटोकॉल नीचे उल्लिखित द्वारा समीक्षा की गई है, और की, येल विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों के अनुपालन में है।

1. पूरे भ्रूण जर्दी थैली अध्ययन के लिए पूर्व वी इवो संस्कृति (वैकल्पिक)

  1. E7.0 पर गर्भवती बांधों Euthanize - E7.5, और अधिक से अधिक विस्तार में वर्णित के रूप में नीचे (2.4 कदम - 2.7), बाँझ शर्तों के तहत गर्भाशय सींग निकाल दें।
  2. अलग पूरे भ्रूण के आसपास के पत्या से (जर्दी थैली बरकरार 12) के साथ, और 50 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में 50 मिलीलीटर पूरे चूहे सीरम में निलंबित।
  3. 5% सीओ 2 के साथ 3 मिनट के लिए गैस भ्रूण बोतलें तुरंत रूप में पहले 12,18 वर्णित है। 24 घंटे में इस चरण को दोहराएँ यदि 24 के लिए भ्रूण संवर्धन - 48 घंटा।
  4. अप करने के लिए 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस संस्कृति रोलिंग में सेते हैं।
    नोट: भ्रूण पूर्व vivo (इलाज किया जा सकता औषधीय एजेंटों के साथ यानी, पायदान अवरोध डीएपी।टी 12) या घुलनशील प्रोटीन (यानी, इस तरह के कारकों से युक्त मध्यम संस्कृति में अप करने के लिए 2 घंटे के लिए भ्रूण के पूर्व ऊष्मायन के माध्यम से फ़ाइब्रोनेक्टिन 19), या पूर्व vivo संस्कृति की पूरी लंबाई के लिए रोलिंग संस्कृति के माध्यम से उन कारकों के अलावा के माध्यम से अवधि। जीन अभिव्यक्ति 2 घंटा 12 के लिए बेहतर titered lentivirus के साथ भ्रूण के पूर्व ऊष्मायन द्वारा भ्रूण में हेरफेर किया जा सकता है। जर्दी थैली नाड़ी और hematopoietic विकास ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों और ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर वास्तविक समय में नजर रखी जा सकती है।

2. माउस भ्रूण से जर्दी थैली (वाई एस) या महाधमनी-gonad-मेसोनेफ्रॉस (एजीएम) के विच्छेदन

  1. छिड़काव और 70% इथेनॉल के साथ सभी सतहों नीचे पोंछते बाद सेल संस्कृतियों में प्रदूषण को कम करने के लिए प्रयोगशाला बेंच जीवाणुरहित। प्रयोगशाला बेंच की सतह पर एक शोषक underpad रखें।
  2. 70% इथेनॉल के साथ शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित। अनुशंसित सर्जिकल उपकरणों दो # 5 सीधे मजबूर कर रहे हैंपी एस, और एक 8.5 सेमी सीधे कैंची।
  3. पूर्व vivo संस्कृति से भ्रूण के साथ काम कर रहे हैं, तो ध्यान से 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब से पूरे भ्रूण को हटाने और तुरंत आगे बढ़ना करने के लिए कदम 2.8। अन्यथा, इस कदम को छोड़ और कदम करने के लिए 2.4 आगे बढ़ें।
  4. उचित भ्रूण साल की उम्र में गर्भवती बांध Euthanize (E8.5 यदि कटाई वाईएस; E10.5 यदि कटाई एजीएम)।
    नोट: वर्णित तकनीक एक दोहरे विधि इच्छामृत्यु दृष्टिकोण को रोजगार - एक अस्थिर संवेदनाहारी यांत्रिक ग्रीवा अव्यवस्था के बाद की घातक खुराक - पशु दर्द और संकट को कम करने के लिए, और पशु विषयों की न्यूनतम इनवेसिव और मानवीय समाप्ति सुनिश्चित करने के लिए। छोटे कृंतक इच्छामृत्यु के लिए इस संयुक्त तकनीक पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन द्वारा सिफारिश की है जब एक प्रशिक्षित और कुशल अन्वेषक (पशु की इच्छामृत्यु के लिए AVMA दिशानिर्देश: 2013 संस्करण) द्वारा किया जाता है।
    1. 5 मिनट - 3 के लिए isoflurane की एक घातक खुराक (> 2 हे में 5%) का उपयोग माउस anesthetize। (Cautiपर: Isoflurane एक जहरीले inhalant है; उचित सांस की व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ एक रासायनिक धूआं हुड के नीचे का उपयोग करें।)
    2. ठीक पलटा की हानि, पैर की अंगुली चुटकी पलटा की हानि, और सांस की दर में कमी - - isoflurane करने के लिए चूहों के जोखिम के बाद, एनेस्थेटिक स्तर के कम से कम तीन लक्षण जाँच विषयों सुनिश्चित करने के लिए यांत्रिक इच्छामृत्यु के साथ आगे बढ़ने से पहले एक गहरी संवेदनाहारी विमान हासिल किया है।
    3. Cervically बांध हटाना तेजी से मृत्यु के लिए प्रेरित करने के लिए।
  5. Underpad पर euthanized बांध लापरवाह रखें और उदारतापूर्वक पेट के निचले हिस्से स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ।
  6. पेट के निचले हिस्से की दीवार के midline के साथ एक ऊर्ध्वाधर चीरा। अतिरिक्त ~ 1 इंच क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर चीरों सही चीरा के मध्य से छोड़ा का विस्तार करें, और पूरी तरह से सही है और छोड़ दिया गर्भाशय सींग प्रत्येक युक्त कई gestating भ्रूण बेनकाब करने के लिए पेट की दीवार दूर काटना।
  7. संदंश का प्रयोग, दो गर्भाशय सींग से एक पकड़और कैंची का उपयोग mesometrium से अलग करने के लिए। बाँझ हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) में बर्फ पर विच्छेदित गर्भाशय एक 60 मिमी polystyrene टिशू कल्चर प्लेट में रखें। अन्य गर्भाशय सींग के लिए दोहराएँ।
  8. एक मानक प्रकाश विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, दूर गर्भाशय थैली की पेशी परत खींचने के लिए अंतर्निहित गर्भावस्था की थैली और पत्या प्रकट करने के लिए संदंश का उपयोग करें। धीरे संलग्न भ्रूण से थैली को हटाने के द्वारा वाईएस (2A चित्रा) अलग। भ्रूण पीतक वाहिकाओं के भ्रूण मूल में उचित से वाईएस ऊतक निकालें।
  9. एजीएम को अलग-थलग करने के लिए, वाईएस हटाने और दिल और आगे के हाथ के स्तर से नीचे भ्रूण आड़ा काट और छाती और सिर क्षेत्र त्यागें। अगले, सिर्फ hindlimbs के स्तर से नीचे भ्रूण आड़ा काट और हटाने और पूंछ ऊतक त्यागें। शेष खंड है, जो वार्षिक आम बैठक (चित्रा 2 बी) शामिल हैं से hindlimbs और अतिरिक्त उदर ऊतक निकालें।
  10. कई भ्रूण और दुकान से पूल वाईएस या एजीएम ऊतकोंHBSS + में बर्फ पर एक साफ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में (HbSS 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.3 मिलीग्राम / एमएल एल glutamine के साथ पूरक)।

एक एकल कक्ष निलंबन में प्राथमिक ऊतक 3. पाचन

  1. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 XG पर 5 मिनट के लिए काटा वाईएस या एजीएम ऊतकों युक्त ट्यूब।
  2. के 1 मिलीलीटर या तो 0.05% (वाईएस के लिए) या 0.2% collagenase प्रकार द्वितीय HBSS + में पतला (एजीएम के लिए) में सतह पर तैरनेवाला और resuspend ऊतक निकालें। 37 डिग्री सेल्सियस पर नहाने के पानी में 30 मिनट, ट्यूब हर 5 मिनट के मिश्रण करने के लिए inverting के लिए सेते हैं।
  3. धीरे यंत्रवत् एक P1000 पिपेट के माध्यम से नमूना 10 बार गुजर द्वारा ऊतक अलग कर देना। अगर कठिनाई आंशिक रूप से पचा ऊतक aspirating होने, पिपेट टिप बोर कैंची की एक जोड़ी के साथ टिप के ~ 5 मिमी काटने से चौड़ा किया जा सकता है।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 XG पर 5 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र। में 1 मिलीलीटर ठंडा HBSS + सतह पर तैरनेवाला और resuspend निकालें।
  5. 70 और के माध्यम से नमूना दर्रा# 956, एम सेल झरनी।
  6. एक मैनुअल या स्वचालित hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 XG पर 5 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र। DMEM में resuspend नमूना + पूर्व (4.5 छ / एल ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.3 मिलीग्राम / एमएल एल glutamine के साथ पूरक) 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया कि इस तरह की कोशिकाओं 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में कर रहे हैं।

4. न्यूक्लिक एसिड डाई और लेबलिंग Fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ साथ कोशिकाओं के उपचार

  1. अशेष एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए नए सिरे से 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में नमूने के कम से कम 100 μl (1 x 10 5 कोशिकाओं)।
  2. निम्न नमूना और आवश्यक नियंत्रण ट्यूबों में शामिल हैं: बेदाग; केवल cKit एपीसी; केवल CD45-FITC; केवल CD31 पीई; केवल Flk1-PECy7; Hoechst 33342 केवल; Hoechst 33342 केवल Verapamil +; नमूना (सभी रंग प्राप्त करता है, Verapamil प्राप्त नहीं होगा)। 1 एक्स 10 की एक न्यूनतम का उपयोग नोट: कक्षों की एक बड़ी मात्रा में हल किया Hemogenic चुनाव आयोग और HSPC की उपज को अधिकतम करने के लिए एक ही एकाग्रता में नमूना ट्यूब को जोड़ा जा सकता है।
  3. जोड़ें Verapamil "Hoechst 33342 केवल + Verapamil" 50 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए नियंत्रण ट्यूब के लिए 95% इथेनॉल (औचित्य के लिए चर्चा देखें) में पतला। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सभी ट्यूबों को सेते हैं। (चेतावनी: Verapamil एक शक्तिशाली कैल्शियम चैनल अवरुद्ध एजेंट है और बेहद जहरीला है दस्ताने के साथ संभाल।)।
  4. Hoechst 33342 5 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए "नमूना" ट्यूब के लिए Hoechst 33342 + Verapamil केवल नियंत्रित करने के लिए "Hoechst 33342 केवल" नियंत्रण में जोड़े,, और। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे, प्रकाश से सुरक्षित करने के लिए सभी ट्यूबों को सेते हैं। धीरे हर 15 मिनट inverting द्वारा मिश्रण। (चेतावनी: 33342 Hoechst एक विषैले परमाणु डाई है और दस्ताने के साथ संभाला जाना चाहिए)।
  5. अपकेंद्रित्र सभी samp4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 XG पर 5 मिनट के लिए लेस। तैरनेवाला निकालें और में ठंड HBSS + 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में सेल छर्रों resuspend।
  6. 2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए उचित एंटीबॉडी केवल नियंत्रण ट्यूबों के लिए, और "नमूना" ट्यूब के लिए fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें। 30 मिनट, प्रकाश से सुरक्षित लिए बर्फ पर सेते हैं।
  7. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 XG पर 5 मिनट के लिए सभी ट्यूबों। तैरनेवाला निकालें और 500 μl ठंडा HBSS में सेल गोली resuspend। 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene FACS ट्यूब और दुकान बर्फ पर, प्रकाश से सुरक्षित है, तत्काल FACS के लिए के जाल फिल्टर टोपी के माध्यम से तनाव नमूने हैं।

5. पहचान और Hemogenic endothelial कोशिकाओं के अलगाव और HSPC FACS द्वारा

नोट: इस प्रोटोकॉल एक बी.डी. FACSAria 5-लेजर एक 100 मेगावाट 355 एनएम यूवी लेजर के साथ सुसज्जित प्रणाली, एक 200 मेगावाट 405 एनएम वायलेट लेजर, एक 200 मेगावाट 488 एनएम ब्लू लेजर, एक 200 मेगावाट 532 एनएम ग्रीन लेसर का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था, और एक 150 मेगावाट 637 एनएम लाललेजर। प्रकोष्ठों म्यान तरल पदार्थ के रूप में और सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत बाँझ पीबीएस में हल किया गया है, और 1 का एक नमूना दबाव के लिए सेट प्रवाह की दर के साथ एक 100 माइक्रोन नोजल के माध्यम से इस तरह है कि 1500 की एक अधिकतम - 2,000 घटनाओं सेल तनाव कम करने के लिए प्रति सेकंड अर्जित कर रहे हैं।

  1. इन सेटिंग्स ऊपर वर्णित के तहत, "बेदाग" और एकल रंग नियंत्रण ट्यूबों का उपयोग FACS सेल सॉर्टर लेजर तीव्रता का अनुकूलन और निर्माता के निर्देशों के अनुसार बहु ​​रंग वर्णक्रम मुआवजा नियंत्रण करने के लिए। आगे का प्रयोग करें और पक्ष तितर बितर रहते सेल प्रदर्शन और कुल घटनाओं से भेदभाव नक़ल करने के लिए (अधिक जानकारी के लिए निर्माता के निर्देशों को देखें)।
    नोट: इस प्रोटोकॉल आमतौर पर ~ 70 में परिणाम है - 80% व्यवहार्य कोशिकाओं। समस्याओं को कम सेल व्यवहार्यता के साथ सामना कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि ऊतकों शुरू में बर्फ के ठंडे मीडिया में जल्दी से विच्छेदित कर रहे हैं, और कहा कि अन्यथा निर्दिष्ट करने के उन लोगों को छोड़कर सभी कदम बाहर बर्फ पर, कोमल pipetting के साथ बाल काटना और कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए किया जाता है(सेल व्यवहार्यता के संरक्षण पर अधिक से अधिक विस्तार के लिए चर्चा देखें)।
  2. पक्ष आबादी (सपा) घटनाक्रम (चित्रा 3 ए) की पहचान करने बनाम Hoechst ब्लू प्रतिदीप्ति Hoechst लाल की एक अंतर रेखीय पैमाने पर साजिश का प्रयोग करें। सत्यापित करने के लिए कि फाटक ठीक से नमूने के लिए तैयार कर रहे हैं एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में "Hoechst 33342 केवल + Verapamil" नियंत्रण का प्रयोग करें। सपा गैर सपा कोशिकाओं के बाईं ओर एक कंधे के रूप में दिखाई देगा, और Verapamil इलाज नियंत्रण में कम हो जाएगा। गैर-सपा आबादी गैर hemogenic चुनाव आयोग (चित्रा 3 बी) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  3. अतिरिक्त अंतर प्रतिदीप्ति भूखंडों (लॉग पैमाने पर कुल्हाड़ियों) बनाएँ और सपा hemogenic endothelial कोशिकाओं (चित्रा -3 सी-ई) की पहचान करने के लिए बेटी फाटकों आकर्षित।
    नोट: Hemogenic endothelial कोशिकाओं के रूप में Flk1 + / cKit + / CD45- सपा कोशिकाओं (चित्रा 3 डी) profiled रहे हैं, और HSPC Flk1- / cKit + / CD45 + सपा कोशिकाओं (चित्रा 3E) कर रहे हैं। Hemogenic endothelial गएल गैर hemogenic endothelial कोशिकाओं है, जो के रूप में CD31 + / CD45- गैर सपा कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) इस दृष्टिकोण में पहचान कर रहे हैं के साथ समानांतर में विश्लेषण किया जा सकता है।
  4. hemogenic endothelial सेल या hematopoietic संस्कृति के लिए प्लेटें युक्त methylcellulose पर HSPC अंश (देखें नीचे), या बाद के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए अन्य बफ़र्स में निकालते हैं।

6. संस्कृति हीमैटोपोयटिक भेदभाव

  1. 0.5 मिलीग्राम (135 μl / 2 सेमी) कमरे के तापमान पर 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के कुओं की वांछित संख्या को methylcellulose आधारित hematopoietic संस्कृति मीडिया जोड़ें। 0.5 मिलीलीटर वाष्पीकरण कम करने के लिए अप्रयुक्त कुओं में बाँझ पानी जोड़ें। नए सिरे से तैयार करने और उपयोग करें जब तक कमरे के तापमान पर रखने के लिए।
  2. क्रमबद्ध 1 - 10 कोशिकाओं प्रतिरूप विश्लेषण के लिए, या अप करने के लिए 1,000 hemogenic endothelial कोशिकाओं (Flk1 + / cKit + / CD45- सपा कोशिकाओं) या HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + सपा कोशिकाओं) के प्रत्येक कुएं में थोक विस्तार और भेदभाव के लिए सीधेप्लेट methylcellulose युक्त। 20% - कॉलोनी गठन लगभग 10 में पता चला है।
  3. एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में, टिप इसकी बोर को चौड़ा करने के लिए छंटनी के साथ एक P1000 टिप का उपयोग धीरे वरीयता प्राप्त methylcellulose मीडिया की हर अच्छी तरह resuspend करने के लिए 2 - 3 बार, देखभाल करने के बुलबुले के सृजन से बचने के लिए। इस इष्टतम विकास के लिए semisolid methylcellulose में हल कोशिकाओं के निलंबन सुनिश्चित करता है।
  4. अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  5. (चित्रा 4) समय के साथ अलग-अलग hematopoietic सेल कालोनियों के गठन के लिए एक सेल संस्कृतियों मॉनिटर। 1 दिन, 3, 7 पर नंबर और भेदभाव hematopoietic कालोनियों के प्रकार के कुओं स्कोर, और 14 विधि (ओं) कदम 6.7 में नीचे उल्लिखित द्वारा।
    1. 1 दिन स्कोर प्लेटों confluency और हल कोशिकाओं की निरंतर व्यवहार्यता पुष्टि करने के लिए।
    2. 3 दिन तक, "बड़ा कोयला के साथ पक्षपाती hemogenic endothelial सेल कालोनियों के प्रारंभिक गठन के लिए जाँचस्वर "आकृति विज्ञान (देखें गोल्डी एट अल। 11 और मार्सेलो एट अल। 12 दिन 3 आकृति विज्ञान के प्रतिनिधित्व के लिए)।
    3. द्वारा दिन 5 - 7, हल hemogenic चुनाव आयोग युक्त कुओं में गोल HSPC समूहों के गठन के लिए जाँच करें। HSPC hemogenic चुनाव आयोग एक "पत्थर" endothelial सेल आकृति विज्ञान प्रदर्शित चपटा से सटे मनाया जाना चाहिए।
      नोट: Hemogenic endothelial कोशिकाओं hematopoietic कालोनियों (hematopoietic कॉलोनी संख्या द्वारा निर्धारित) के रूप में करना चाहिए, और बहु-वंश भेदभाव क्षमता (एक एकल कोशिका से कई कॉलोनी प्रकार के अवलोकन के द्वारा निर्धारित) का प्रदर्शन करना चाहिए। हम पहले देखा है कि ~ FACS द्वारा लिया गया hemogenic चुनाव आयोग या HSPC के 20% फर्क और methylcellulose 11 हीमैटोपोयटिक कालोनियों proliferating फार्म के लिए जीवित रहते हैं।
  6. चरण माइक्रोस्कोपी द्वारा कॉलोनी गठन का आकलन करने के लिए:
    1. कल्पना और कम बढ़ाई und पर कालोनियों की गिनतीएर एक चरण प्रकाश माइक्रोस्कोप, और जैसा कि गोल्डी एट अल द्वारा वर्णित है, कॉलोनी आकृति विज्ञान द्वारा BFU ई, CFU-जीएम, और CFU-GEMM कालोनियों की पहचान। 11।
  7. सेल आकृति विज्ञान द्वारा कॉलोनी गठन का आकलन करने के लिए:
    1. अंत के साथ एक P1000 टिप में methylcellulose सतह से महाप्राण व्यक्ति कालोनियों बोर चौड़ा करने के लिए छंटनी की। यह चिपचिपा methylcellulose माध्यम की आकांक्षा की सुविधा और कॉलोनी के सफल पुनः प्राप्ति सुनिश्चित करता है।
    2. Resuspend 200 मिलीलीटर HBSS में कालोनियों और स्पिन 5 मिनट के लिए 28 XG पर एक cytocentrifuge का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर उठाया।
    3. 5 मिनट के लिए 100% मेथनॉल में स्लाइड्स ठीक करें (चेतावनी: मेथनॉल विषैला होता है और केवल उचित वेंटीलेशन और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ एक रासायनिक हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए)।
    4. 20 मिनट (सावधानी के लिए 0.04% Giemsa दाग में स्लाइड्स डूब:। Giemsa दाग मेथनॉल शामिल उचित वेंटीलेशन और व्यक्ति के साथ एक रासायनिक हुड में प्रयोग करेंअल सुरक्षा उपकरण)।
    5. विआयनीकृत पानी में स्लाइड्स कुल्ला।
    6. माउंट एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत coverslips, और उच्च बढ़ाई छवि के साथ स्लाइड, कि प्रतिष्ठित कि methylcellulose मीडिया में सुसंस्कृत हैं वयस्क अस्थि मज्जा से hematopoietic कोशिकाओं में मनाया करने के लिए सेल आकृति विज्ञान की तुलना। उदाहरण के लिए, कृपया निर्माता के निर्देशों को देखते हैं।
  8. FACS द्वारा hematopoietic वंश मार्कर की सेल अभिव्यक्ति द्वारा कॉलोनी गठन का आकलन करने के लिए:
    1. HBSS के 2 मिलीलीटर एक 24 अच्छी तरह से थाली 0.5 मिलीलीटर methylcellulose पर संवर्धित कालोनियों युक्त के प्रत्येक कुएं में जोड़ें (यानी, पतला वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध स्टॉक methylcellulose 1: 4)। पिपेट और नीचे मिश्रण करने के लिए, और ताजा ट्यूब (एस) के हस्तांतरण।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूना एक मानक टेबल टॉप microcentrifuge का उपयोग कर।
    3. में 1 मिलीलीटर HBSS + तैरनेवाला और resuspend सेल गोली (ओं) को हटाने, नमूने पूलिंग यदि ऐसा है तो वांछित।
    4. Centrifu4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर जीई नमूना।
    5. में 400 μl HBSS + तैरनेवाला और resuspend सेल गोली (ओं) निकालें।
    6. चार 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में अशेष नमूना इस प्रकार है: बेदाग; केवल B220-FITC; जीआर-1-FITC केवल; Ter119-FITC केवल।
    7. 2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए उपयुक्त ट्यूब के लिए fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और ठंडा 0.5 मिलीलीटर HBSS में सेल गोली resuspend।
    9. प्रत्येक hematopoietic वंश मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए FACS द्वारा प्रत्येक नमूना विश्लेषण करें: B220 के निशान बी कोशिकाओं 20; जीआर -1 के निशान माइलॉयड कोशिकाओं 21; Ter119 erythroid कोशिकाओं 22 निशान।
      ध्यान दें: अतिरिक्त अन्य hematopoietic वंश मार्कर को निशाना एंटीबॉडी, इस दृष्टिकोण में शामिल किया जा सकता है, यदि ऐसा है तो वांछित।

Representative Results

Hemogenic endothelial कोशिकाओं और भ्रूण HSPC वाईएस या एजीएम से आगे और पक्ष तितर बितर (नहीं दिखाया गया है) द्वारा FACS बिखराव मानक जीवित कोशिका और नक़ल भेदभाव बाद में चित्रा 3। प्रस्तुत प्रतिनिधि भूखंडों के समान भूखंडों निकलेगा के सफल लेबलिंग, पक्ष आबादी (सपा) घटनाओं के एक "कंधे" के रूप में Verapamil के अभाव में एक रेखीय Hoechst लाल बनाम ब्लू Hoechst अंतर साजिश में कल्पना कर रहे हैं (गैर सपा) घटनाक्रम (चित्रा 3 ए) के बहुमत से बाएं स्थानांतरित कर दिया। कुल व्यवहार्य वाईएस कोशिकाओं के 3% और 3 - - कुल व्यवहार्य एजीएम घटनाओं के 5% जब सपा गेट को ठीक से तैयार की है, सपा कोशिकाओं लगभग 1 का प्रतिनिधित्व करेंगे। Verapamil उपचार सपा की घटनाओं में से 50 में>% निषेध ऊतक स्रोत (चित्रा 3 ए, शीर्ष पैनल) की परवाह किए बिना परिणाम चाहिए। हम पहले से निर्धारित किया है कि अन्य आबादी है कि सपा कंधे के बाहर दिखाई देते हैं, लेकिन यह भी verapamil द्वारा अवरुद्ध कर रहे हैं Ter119 पॉजिटिव erythr हैंओब्लास्ट्स, और इसलिए हमारे सपा जनसंख्या 5 से बाहर रखा गया है।

सपा की तुलना में, गैर-सपा कोशिकाओं सपा "कंधे" (चित्रा 3) के लिए आसन्न कोशिकाओं के घने क्लस्टर के रूप में पहचाने जाते हैं। इस आबादी गैर Hemogenic चुनाव आयोग जो एक CD31 पीई बनाम CD45-FITC बेटी साजिश (चित्रा 3 बी) का उपयोग प्रतिष्ठित किया जा सकता, CD31 के रूप में + / CD45- घटनाओं में शामिल है। एजीएम (चित्रा 3 बी) या जर्दी थैली (नहीं दिखाया गया है), और इन कोशिकाओं की उच्च संख्या से गैर सपा कोशिकाओं के 5% रिश्तेदार आसानी से वापस हल किया जा सकता - गैर Hemogenic चुनाव आयोग आम तौर पर 2 हैं।

HSPC और Hemogenic चुनाव आयोग की पहचान के लिए, बेटी फाटकों सपा अंश से तैयार कर रहे हैं, CD45 + और ​​CD45- कोशिकाओं, जहां CD45 + कोशिकाओं को आम तौर पर कर रहे हैं की पहचान <दोनों एजीएम (चित्रा 3 सी) या वाई एस में कुल घटनाओं में से 20% (नहीं दिखाया गया है)। Hemogenic चुनाव आयोग बाद में एक अंतर है cKit एपीसी बनाम Flk1-PECy7 बेटी पी में CD45- कोशिकाओं से पहचाने जाते हैंडबल सकारात्मक घटनाओं के रूप में बहुत कुछ है, और आम तौर पर 1 प्रतिनिधित्व करते हैं - CD45- घटनाओं का 3% है जब या तो एजीएम (चित्रा 3 डी) या वाईएस से अलग () नहीं दिखाया। HSPC बनाम Flk1- / cKit + कोशिकाओं के रूप में Flk1-PECy7 बेटी साजिश एक अलग cKit एपीसी में CD45 + अंश से पहचाने जाते हैं, और यह भी आम तौर पर लगभग 25 प्रतिनिधित्व करते हैं - जब (नहीं तो वाईएस से प्राप्त CD45 + कोशिकाओं की छोटी सी आबादी का 30% दिखाया गया है) या वार्षिक आम बैठक (चित्रा 3 ई)। इस प्रकार, दोनों Hemogenic चुनाव आयोग और HSPC असाधारण दुर्लभ हैं (~ कुल सेल की घटनाओं में से 0.01%), और यह ठेठ इस प्रोटोकॉल के लिए भी जब कई भ्रूण से ऊतक जमा कर रहे हैं प्रत्येक कोशिका प्रकार के कुछ सौ लौटने के लिए है। बेटी भूखंडों में गेट्स नकारात्मक नियंत्रण समूहों के संदर्भ में स्थापित किया जाना चाहिए। आदेश में विशिष्ट और गैर विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला के बीच भेद करने में गेट्स ने शुरू में दोनों बेदाग नियंत्रण करने के लिए संदर्भ (चित्रा 3 में तैयार किया जाना चाहिएसी), साथ ही नमूने है कि fluorescently संयुग्मित निर्धारण मिलान (IgG2a या IgG2B) नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ इलाज किया गया है (नहीं दिखाया गया है)। यह बाद नियंत्रण का प्रदर्शन किया है कि गैर विशिष्ट धुंधला इस प्रोटोकॉल के द्वारा कम है, इसलिए जब तक हम अनुशंसा करते हैं कि निर्धारण मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी (जैसे।, IgG2a पीई या IgG2B-FITC) शुरू में FACS सॉर्टर सेटिंग्स को अनुकूलित और गेट सीमाओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा , हम भी पाते हैं कि बेदाग नियंत्रण छँटाई दिनचर्या FACS दौरान गेट चौके और प्रयोगात्मक गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए पर्याप्त हैं। फाटक ठीक से तैयार कर रहे हैं, कम से कम सकारात्मक बिखराव जब बेदाग या निर्धारण मिलान नियंत्रण से रिकॉर्डिंग एकल या डबल सकारात्मक फाटकों में मनाया जाना चाहिए।

एजीएम और HSPC से Hemogenic endothelial कोशिकाओं methylcellulose (चित्रा 4 ए) में संस्कृति के 14 दिनों में hematopoietic भेदभाव से गुजरना। कॉलोनी प्रकार के रिश्तेदार अनुपात आम तौर पर इन में मनायासंस्कृतियों ऊतक स्रोत पर निर्भर है। Hemogenic endothelial BFU ई, CFU-जीएम, और कुछ CFU-GEMM से 5 E8.5-E9.5 को वृद्धि पर जर्दी थैली ऊतकों से अलग कक्षों, जबकि hemogenic endothelial E10.5 एजीएम से अलग कक्षों वृद्धि मुख्य रूप से CFU के लिए दे -GEMM 12 है, हालांकि अन्य प्रजातियों अभी भी मनाया जाता है, के रूप में चित्रा 4 बी (ऊपर बाएं पैनल) में दिखाया गया है। HSPC E10.5 एजीएम से अलग भी हालांकि इन कोशिकाओं के रूप में भी अच्छी तरह से अन्य hematopoietic कॉलोनी प्रकार में अलग होगा, (चित्रा 4 बी, शीर्ष मध्य पैनल) methylcellulose में संस्कृति पर CFU-GEMM करने के लिए मुख्य रूप से जन्म दे। गैर-hemogenic endothelial कोशिकाओं (CD31 + / CD45- गैर सपा) ने भी (चित्रा 4 बी, शीर्ष सही पैनल) चढ़ाया गया है। इन कोशिकाओं को 14 दिनों के बाद hematopoietic संस्कृति में कोई विकास नहीं प्रदर्शित करता है।

व्यक्तिगत सतह मार्कर व्यक्त प्रकार की कोशिकाओं के hematopoietic क्षमता के साथ, और hematopoietic एक की अभिव्यक्ति के बिना कोशिकाओं सहित की Assaysएन डी endothelial मार्कर CD31, Flk1, सी-किट, VE-पाजी, CD41, और E10.5 पर एजीएम के एसपी अंश के भीतर CD45 प्रदर्शन किया गया है और E10.5 एजीएम में है कि बहु-वंश कॉलोनी बनाने गतिविधि का प्रदर्शन प्रतिबंधित है CD31 + करने के लिए, VE-cadherin +, सी-किट +, CD41 + और ​​CD45 + सपा कोशिकाओं 12। दिलचस्प है, कॉलोनी बनाने गतिविधि दोनों FLK-1 + और FLK-1- सपा कोशिकाओं में नोट किया गया था, लेकिन केवल Flk1 + C-किट + CD45- सपा कोशिकाओं एक endothelial monolayer मध्यवर्ती दोनों "पत्थर की विशेषता के माध्यम से बहु-वंश कालोनियों को जन्म दिया "endothelial सेल आकृति विज्ञान (चित्रा 4 बी, नीचे बाएं पैनल) और 'दिल-AcLDL तेज 12 से। इसके अलावा, सी-किट की अभिव्यक्ति एजीएम सपा कोशिकाओं 12 की hematopoietic गतिविधि के लिए आवश्यक है।

यह दिखाया गया है कि एक ओर जहां कुछ माइलॉयड पूर्वज समान शब्द के भागों के लक्षण हैं जब hemogenic endothelial कोशिकाओं की तुलना में, माइलॉयड पूर्वज कोशिकाओं CD45 व्यक्त करने और बहु-वंश कालोनियों उत्पन्न नहीं कर सकते 12,23 की कमी है और एक अंतर्निहित endothelial monolayer (चित्रा 4 बी, नीचे सही पैनल) के बिना गोल सेल समूहों को जन्म दे। इसलिए, जनसंख्या के रूप में हम hemogenic endothelium को परिभाषित (या, FLK-1 + / C-किट + / CD45-सपा कोशिकाओं) सहित रक्त बनाने की क्षमता और मजबूत hematoendothelial जीन अभिव्यक्ति के साथ endothelial कोशिकाओं, का प्रतिनिधित्व gata-1/2, Lmo2, एससीएल / ताल-1, Runx -1, सी-किट, CD34, CD41, और CD45 11 कि hematopoietic स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज, साथ ही उनके गैर hemogenic endothelial सेल समकक्षों से अलग कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. समग्र कार्यप्रवाह। संक्षेप में, भ्रूण गर्भवती बांधों से हटा रहे हैं, और वाईएस या एजीएम ऊतकों काटा जाता है। भ्रूण वैकल्पिक 2 के लिए संवर्धित किया जा सकता है 4 - 48 घंटा पूर्व vivo ऊतक फसल से पहले। काटा वाईएस या एजीएम ऊतकों एक एकल कक्ष निलंबन को पचा रहे हैं, नियंत्रण और नमूना ट्यूबों में aliquoted, और Hoechst डाई और / या fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी की उपस्थिति में incubated। Verapamil, एक कैल्शियम चैनल अवरोध भी सपा अंश का सही gating के सत्यापन के लिए आवश्यक एक नकारात्मक नियंत्रण उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Hemogenic endothelial कोशिकाओं FACS द्वारा पहचान कर रहे हैं के रूप में Flk1 + / cKit + / CD45- सपा कोशिकाओं, HSPC कोशिकाओं के Flk1- / cKit + / CD45 + सपा अंश के भीतर समाहित कर रहे हैं, जबकि; दोनों प्रकार की कोशिकाओं hemogenic क्षमता की पुष्टि के लिए methylcellulose पर क्रमबद्ध हैं। इसके अतिरिक्त, गैर hemogenic endothelial कोशिकाओं साथ भेदभाव किया जा सकता है (और, यदि ऐसा है तो पुनः प्राप्त वांछित) CD31 + / CD45- गैर सपा कोशिकाओं। के रूप में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2. वाईएस और एजीएम ऊतकों के विच्छेदन। ए) वाईएस E8.5 भ्रूण से दूर विच्छेदित किया जाता है, और बाद में पाचन। बी के लिए बाँझ HBSS + में पूरी रखा) E10.5 भ्रूण के ट्रंक दोनों forelimb और hindlimb कलियों नीचे क्षैतिज कटौती करने से अलग है। एजीएम तो अंग कलियों और उदर ऊतक का उपयोग संदंश से अलग किया जाता है। सी) उज्ज्वल क्षेत्र छवियों दोनों वाईएस और एक E10.5 भ्रूण (पैमाने = 1 मिमी) से एजीएम के विच्छेदन दिखा। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि भूखंडों भेदभाव के लिए गेट पदानुक्रम दिखातेE8.5 वाईएस से Hemogenic Endothelial सेल एस (Flk1 + / cKit + / CD45- सपा कोशिकाओं), HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + सपा कोशिकाओं), और गैर-hemogenic endothelial कोशिकाओं (CD31 + / CD45- गैर सपा) FACS द्वारा की या E10.5 एजीएम। जीना सेल और नक़ल आगे करके या तो वाईएस (बाएं पैनल) या वार्षिक आम बैठक (सही पैनल) से कोशिकाओं के भेदभाव और पक्ष तितर बितर (नहीं दिखाया गया है), ए) की ओर जनसंख्या के बाद (सपा) के गेट खींचा और सत्यापित है Verapamil इलाज नकारात्मक नियंत्रण में सपा अंश का एक महत्वपूर्ण कमी से। गैर-सपा आबादी के लिए सपा सन्निकट कक्षों के घने क्लस्टर के रूप में पहचान की है। प्रस्तुत भूखंडों में से प्रत्येक में 20,000 घटनाओं प्रदर्शित कर रहे हैं बी) गैर-hemogenic endothelial कोशिकाओं गैर सपा अंश के भीतर CD31 + / CD45- कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं, और 2 प्रतिनिधित्व करते हैं -। गैर सपा कोशिकाओं एजीएम से प्राप्त है कि क्या के 5% (दिखाए ) या वाई एस (नहीं दिखाया गया है)। discri करने के लिएminate Hemogenic चुनाव आयोग या HSPC, सी) बेटी द्वार से या तो एजीएम (दिखाया गया है) या वाई एस (नहीं दिखाया गया), अतिरिक्त बेटी फाटकों तैयार कर रहे हैं hemogenic endothelial कोशिकाओं की पहचान के लिए CD45 + और ​​CD45- कोशिकाओं। डी) की पहचान करने के लिए सपा अंश से तैयार कर रहे हैं CD45- अंश से cKit + (बनाम cKit-) और Flk1 + (बनाम Flk1-) कोशिकाओं को अलग करने के लिए। (दिखाए CD45 + कोशिकाओं एजीएम से हल किया है कि क्या के 30% - या तो वाईएस या एजीएम से Hemogenic चुनाव आयोग आम तौर पर कर रहे हैं ~ 1 -। 3 CD45- घटनाओं ई) HSPC CD45 + के रूप में cKit + और ​​Flk1- अंश से पहचाने जाते हैं, और आम तौर पर 20 प्रतिनिधित्व के% ) या वाई एस () नहीं दिखाया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. visuaHemogenic endothelial कोशिकाओं की संस्कृति और HSPC निम्नलिखित पर Methylcellulose। ए) methylcellulose पर चढ़ाना के 7 दिनों के भीतर हल व्यक्ति की कोशिकाओं से कालोनियों के रूप में Hematopoietic भेदभाव के lization। मल्टी-वंश hematopoietic संभावित कई hematopoietic कॉलोनी प्रकार के अवलोकन से इसकी पुष्टि की जा सकती है, विशिष्ट कॉलोनी morphologies 11। बी) के अनुसार क्रमबद्ध hemogenic चुनाव आयोग और HSPC एजीएम से (या वाई एस के पहले चरण सूक्ष्म इमेजिंग, नहीं दिखाया गया) बहु-वंश hematopoietic दिखाने के आकलन के द्वारा की पहचान methylcellulose संस्कृति के माध्यम में संस्कृति के 7 दिनों के बाद कॉलोनी गठन। एजीएम से गैर-hemogenic चुनाव आयोग (या वाईएस, नहीं दिखाया गया है) इन शर्तों के तहत विकास का प्रदर्शन नहीं करते। उच्च बढ़ाई, शास्त्रीय "पत्थर" endothelial सेल आकृति विज्ञान (सफेद तीर) के साथ पक्षपाती कोशिकाओं संस्कृति में hematopoietic कोशिकाओं के समूहों को जन्म देने के देखा जा सकता हैhemogenic चुनाव आयोग की Tures; ऐसी कोई endothelial कोशिकाओं को हल HSPC (पैमाने = 100 माइक्रोन) की संस्कृतियों में मनाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

तकनीकी क्षणिक और छोटे सेल आबादी है कि विशिष्ट विकास खिड़कियों के दौरान केवल उभरने के अध्ययन में निहित कठिनाइयों की वजह से क्षेत्र में अपनी प्रारंभिक अवस्था में है कि - वहाँ hematovascular विकास के क्षेत्र में कई अनुत्तरित सवाल बने हुए हैं। तकनीक ऊपर उल्लिखित hemogenic endothelial सेल से भी एकल कक्षों और अभिकर्मकों और उपकरण है कि आमतौर पर सबसे अधिक प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं का उपयोग महत्वपूर्ण विकास समय बिंदुओं पर भ्रूण के ऊतकों में HSPC आबादी के अलगाव के लिए अनुमति देकर इन कठिनाइयों के कई उन्नति। हमारी प्रोटोकॉल भी वाईएस और एजीएम से गैर hemogenic endothelial सेल भिन्न, जो बाद के विश्लेषण में hemogenic endothelial सेल अंश के लिए स्वतंत्र विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या के रूप में नियंत्रण के समानांतर अलगाव के लिए अनुमति देता है।

इस बहुरंगा FACS आधारित पद्धति का उपयोग कर hemogenic endothelial कोशिकाओं का अलगाव में एक प्रमुख मुद्दा उचित वर्णक्रम सह हैmpensation और एकल रंग फाटक के सटीक ड्राइंग। जैसे, यह पुरजोर सिफारिश की है कि सभी प्रयोगात्मक रन में बेदाग और एकल रंग नियंत्रण शामिल किया जाना है, और वे कहते हैं कि - निर्धारण मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ इलाज के नमूने के साथ - शुरू में उचित मुआवजा वर्णक्रम के लिए और फाटकों के ड्राइंग स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। हालांकि, गैर विशिष्ट धुंधला इस प्रोटोकॉल, इस प्रकार बेदाग और एकल रंग नियंत्रण फाटकों की दिनचर्या सत्यापन के लिए पर्याप्त एक बार FACS सॉर्टर सेटिंग्स अनुकूलित किया गया है द्वारा कम है।

गलत खींचा सपा फाटकों दृष्टिकोण इस रिपोर्ट में वर्णित के साथ एक विशेष चिंता का विषय हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि multipotent स्टेम कोशिकाओं Hoechst लाल 17 के तरजीही तपका दिखा रहे हैं, FACS द्वारा सपा में उनकी उपस्थिति के लिए शारीरिक आधार बनाने। हम जानते हैं कि hemogenic endothelial कोशिकाओं से पता चला है और HSPC इसी तरह सपा सेल अंश 5,11 के भीतर पाए जाते हैं। ऐसे में कैल्शियम चैनल के रूप में औषधhibitor Verapamil transmembrane बहुऔषध प्रतिरोध ट्रांसपोर्टरों की एक किस्म की रुकावट के माध्यम से सपा कोशिकाओं में इस Hoechst डाई तपका व्यवहार ब्लॉक। Hematopoietic स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं में, यह मुख्य रूप से ABCG2 / BCRP1 ट्रांसपोर्टर 24 के माध्यम से होता है। आमतौर पर verapamil लाती> की सपा 50% रुकावट, हालांकि, Hoechst तपका के समग्र डिग्री और Verapamil द्वारा इसके बाद रुकावट देखा संभवतः कारण अंतर Hoechst के साथ कई बहुऔषध प्रतिरोधी ट्रांसपोर्टर प्रकार की अभिव्यक्ति को बदलने के लिए, विकास के समय से प्रभावित हो दिखाया गया है तपका क्षमता है, और Verapamil 5 के प्रति संवेदनशीलता। इस प्रकार, यह पुरजोर सिफारिश की है कि Verapamil इलाज Hoechst से सना हुआ नकारात्मक नियंत्रण standardly सुनिश्चित करने के लिए उचित सपा gating शामिल किया: अगर एक सपा गेट को ठीक से तैयार की है, सपा कोशिकाओं की संख्या में उल्लेखनीय कमी में Hoechst के साथ दाग नमूनों में पता लगाया जाना चाहिए Verapamil की उपस्थिति।

हम पहले से पता चला है कि हल कियाE9.5 murine जर्दी थैली से सपा कोशिकाओं को एक ~ 80 है - 90 गुना अधिक से अधिक methylcellulose आधारित hematopoietic संस्कृति में HSPC उत्पन्न करने के लिए जब E9.5 unfractionated की एक मिलान संख्या की तुलना में क्षमता, गैर Hoechst पूरे वाईएस ऊतक कोशिकाओं 5 दाग। सपा आगे लक्षण वर्णन से पता चला है कि जल्दी hematopoietic और E8.0 पर संवहनी विकास के दौरान murine जर्दी थैली में, वहाँ VE-cadherin और FLK-1 की सराहनीय अभिव्यक्ति है, लेकिन स्टेम (सी-किट) और hematopoietic मार्कर की कम अभिव्यक्ति है (CD45)। इस प्रकार, इस विकास timepoint, मौलिक (गैर hemogenic) चुनाव आयोग, FLK-1 + / CD31 + / CD45- गैर सपा कोशिकाओं प्रबल रूप में परिभाषित किया है। Endothelial मार्कर अभिव्यक्ति कम हो जाती है और CD45 और सी-किट अभिव्यक्ति बढ़ जाती है, एक बढ़ती हुई E9.5 और E11.5 5 के बीच इन विट्रो में HSPC उत्पन्न करने की क्षमता के साथ सहवर्ती के रूप में यह अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पाली। यह पता चलता है वाईएस ऊतक के hematopoietic गतिविधि के भीतर सपा निहित है E9.5 और E11.5, और occurr के बीच सबसे अधिक स्पष्ट होता जा रहाendothelial विशेषताओं और hematopoietic क्षमता का क्रमिक अधिग्रहण के एक समय पर नुकसान के माध्यम से हैैं। जैसे, बहुऔषध प्रतिरोध ट्रांसपोर्टरों कि सपा phenotype को जन्म दे की अभिव्यक्ति hemogenic endothelium 5 के एक महत्वपूर्ण प्ररूपी मार्कर कर रहे हैं; वास्तव में, एजीएम से गैर सपा कोशिकाओं रक्त बनाने संभावित 12 प्रदर्शन नहीं करते। इस प्रकार, दोनों वाईएस और एजीएम में Hoechst धुंधला के माध्यम से सपा सफल अलगाव सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं को इस अंश के भीतर एक दिया ऊतक के hematopoietic स्टेम सेल डिब्बे, और कोशिकाओं के बाद एंटीबॉडी धुंधला से सुलझा लिया जाएगा hemogenic के भेदभाव की अनुमति देगा (FLK -1 + / सी किट + / CD45-) HSPC बनाम (Flk1- / C-किट + / CD45 +) आबादी 5,11,12। इसके अलावा, यह पहले से किया गया है कि संतोष व्यक्त भीतर जर्दी थैली और एजीएम ऊतकों की सपा CD41 + कोशिकाओं methylcellulose आधारित संस्कृति 11,12 में बहु-वंश कॉलोनी गठन करने में सक्षम हैं। हम Flk1 + C-किट + CD45- सपा सेल के रूप में hemogenic endothelial कोशिकाओं को परिभाषितCD45 hematopoietic वंश के एक नामित मार्कर के रूप में उपयोग कर के बजाय CD41 हमारे Flk1 और CD45 की है कि अभिव्यक्ति खोजने दिया द्वारा रों लगभग परस्पर अनन्य 5,11 है। (FLK-1) यह भीतर सपा दोनों endothelial है कि कोशिकाओं का एक शुद्ध अलगाव की अनुमति देता है और hematopoietic संक्रमण के लक्षण (सी-किट) endothelial के लिए आवश्यक स्टेम लेकिन जैसा कि इन में CD45 के अभाव के द्वारा निर्धारित किया जाता है, जो अभी तक इस बदलाव नहीं आया है, कोशिकाओं। यह HSPC आबादी के उप-विभाजन, के रूप में FLK-1- / C-किट + / CD45 + / सपा कोशिकाओं में परिभाषित किया गया, Csf1r + (ऊतक मैक्रोफेज) और Csf1r- (एचएससी) अंश में विचार करने के लिए उपयोगी हो सकता है के रूप में हाल ही में गोमेज़ और उनके सहयोगियों द्वारा रिपोर्ट 25, के रूप में यह सच HSPC का अधिक से अधिक संकल्प बनाम ऊतक मैक्रोफेज पूर्वज आबादी प्रदान करेगा, लेकिन इस hemogenic endothelial सेल अंश जिसका अलगाव हम Csf1r के बाद से रेखांकित किया है बृहतभक्षककोशिका पूर्वज 26 के एक मार्कर है की अखंडता को प्रभावित नहीं होना चाहिए।

Hemogenic endothelial कोशिकाओं दोनों वाईएस और एजीएम (जिसमें 1 - endothelial कोशिकाओं के 3%) में एक दुर्लभ उप-जनसंख्या हैं, और इसलिए उनके अध्ययन में एक बड़ी चुनौती बाद अनुप्रयोगों के लिए अपर्याप्त सेल उपज है। इस प्रोटोकॉल आमतौर पर केवल 10-20% के साथ भी इष्टतम परिस्थितियों में छँटाई का समय है, और एक ठेठ hemogenic endothelial सेल जमा ऊतकों से कई भ्रूण से प्राप्त प्रकार से व्यवहार्य शेष कोशिकाओं के 70-80% में यह परिणाम केवल कुछ सौ कोशिकाओं उपज हो सकती है के methylcellulose उत्पादन कालोनियों में एम्बेडेड कोशिकाओं लिया गया। हल सेल नंबर को अधिकतम करने के लिए, यह पुरजोर सिफारिश की है कि जांचकर्ताओं प्रक्रिया के हर कदम भर ऊतक और सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए कदम उठाने के लिए: ऊतकों तेजी से विच्छेदित और जमा किया जाना चाहिए, और नमूने संभव बर्फ पर रखा जाना चाहिए, जब भी। नमूने नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए तुरंत FACS छँटाई करने से पहले, और संग्रह methylcellulose संस्कृति में उच्च सीरम सामग्री, या सीधे युक्त वर्णन के रूप में ट्यूबों में हलऊपर घ। अगर व्यवहार्यता समस्या जारी रहती है, संग्रह ट्यूब भी सीरम के साथ पूर्व लेपित किया जा सकता है आगे हल सेल अस्तित्व को बढ़ाने के लिए। hemogenic endothelial सेल उपज कम रहता है, वयस्क अस्थि मज्जा या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध fluorophore संयुग्मित मोती यहाँ बताया भ्रूण ऊतक व्युत्पन्न एकल रंग नियंत्रण के एवज में वर्णक्रम मुआवजे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हल कोशिकाओं संस्कृति के लिए इरादा कर रहे हैं, तो hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC टिशू कल्चर कुओं में सीधे हल किया जाना चाहिए। हल कोशिकाओं के डीएनए या आरएनए से संबंधित जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, hemogenic और गैर-hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC लिए इरादा कर रहे हैं संग्रह सेल नुकसान को कम करने के लिए नमूना lysis बफर युक्त ट्यूबों में सीधे हल किया जा सकता है।

उल्लिखित तकनीक में एक ही भ्रूण के ऊतकों से hemogenic और गैर-hemogenic endothelial कोशिकाओं के सफल (और एक साथ) अलगाव, साथ ही HSPC और परिपक्व रक्त कोशिका अंशों परमिट। यह दृष्टिकोण आगे संवर्धन में सक्षम बनाता हैमहत्वपूर्ण बदलाव होते हैं कि के रूप में endothelial कोशिकाओं को रक्त उत्पन्न की आणविक आधार के वाई। इन विकासात्मक अध्ययन से प्राप्त इनसाइट्स तो pluripotent से मानव hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC संतान की पीढ़ी के अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और संभवतः ऑटोलॉगस, प्रचलित hematopoietic विकारों के इलाज के लिए स्टेम कोशिकाओं।

Disclosures

इस काम अनुदान HL128064 byNIH का समर्थन किया था, HL096360, EB017103, और सीटी नवाचार 15 RMB-येल 04, KKH करने के लिए, और NICHD / एनआईएच T32HD007094 अनुदान।

Acknowledgments

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) Sigma D5942 TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling.
Absorbent bench underpad Covidien 7134
#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein  50033 TOXIC inhalant: Use in fume hood.
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine)  Invitrogen 10378016
Type II Collagenase Worthington LS004174
Falcon 70 μM nylon cell strainer Corning CLS431751
Anti-Mouse CD45-FITC eBioscience 11-0451-81
Anti-Mouse CD31 - PE eBioscience 12-0311-81
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 BD Pharmingen 561259
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) Sigma 14533 TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H2O, store aliquots at -20 °C until ready for use.
Verapamil Hydrochloride Sigma 1711202  TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling.   Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol.  Store at -20 °C until ready for use 
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
MethoCult GF M3434 Stem Cell Technologies 3434 Thaw and aliquot per manufacturer's instructions
Modified Giemsa Stain Sigma GS500 TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution.
Cytospin Centrifuge Thermo Scientific A78300003
Clipped Funnel Starter Kit Thermo Scientific 3120110 Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge
Anti-Mouse B-220 - FITC BD Pharmingen 553088
Anti-Mouse Gr-1-FITC eBioscience 11-5931-85
Anti-Mouse Ter-119-FITC eBioscience 11-5921-85
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Scientific 10437-077
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L) Life Technologies  11965-092
Hank's Buffered Salt Solution Life Technologies  14175-095
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate EMD Millipore PIFB24P05
IgG2A-PE BD Pharmingen 553930
IgG2B-FITC BD Pharmingen 556923

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 112 hemogenic endothelium निश्चित hematopoiesis नाड़ी विकास माउस भ्रूण FACS hematopoietic स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज
Murine भ्रूण Hemogenic endothelial कोशिकाओं के अलगाव
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Fang, J. S., Gritz, E. C., Marcelo, K. L., Hirschi, K. K. Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (112), e54150, doi:10.3791/54150 (2016).

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