Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/54150
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Departments of Medicine, Genetics and Biomedical Engineering, Yale Cardiovascular Research Center, Vascular Biology and Therapeutics Program, Yale Stem Cell Center, Yale University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

للدم الجذعية والسلف الخلايا (HSPC) مستمدة من المتخصصة (مكون للدم) الخلايا البطانية خلال تطوير، ولكن لا يعرف الكثير عن العملية التي بعض الخلايا البطانية تحدد لتصبح تكوين الدم. ونحن لشرح طريقة التدفق الخلوي على أساس السماح العزلة في وقت واحد من الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC من الأنسجة الجنينية في الفئران.

Abstract

وتحدث هذه المواصفات من الخلايا البطانية مكون للدم من بطانة الأوعية الدموية الجنينية أثناء فترات النمو وجيزة داخل أنسجة متميزة، وضرورية لظهور نهائية HSPC من الفئران اضافية الكيس الجنيني صفار البيض، والمشيمة، والأوعية السري، والجنينية الشريان الأورطي، الغدد التناسلية-mesonephros ( إجتماع الجمعية العامة العادية) المنطقة. يجعل طبيعة عابرة وصغر حجم هذه الفئة من السكان زنزانة انفرادية استنساخه من أجل تقدير دقيق والتطبيقات التجريبية من الصعب من الناحية الفنية. أنشأنا مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) بروتوكول المستندة لعزل في وقت واحد من الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC خلال أوقات الذروة جيل في الكيس المحي والجمعية العمومية. ونحن لشرح طرق للتشريح من الكيس المحي والأنسجة AGM من أجنة الفئران، ونحن تقديم الأمثل الهضم الأنسجة وتصريف الأجسام المضادة شروط بقاء الخلية القصوى قبل تحديد واسترجاع عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية. ممثل FACS آناوترد المؤامرات تحلل التي تحدد الخلية البطانية مكون للدم والظواهر HSPC، ووصف مقايسة على أساس ميثيل لتقييم دمائهم تشكيل إمكانيات على مستوى نسيلي.

Introduction

يتطلب نظام الدورة الدموية وظيفية لتطور مواز للأوعية الدموية وخلايا الدم. في المراحل الأولى من تطوير الدم (تكون الدم بدائية)، وأصل الأرومة الحمراء لا تزال ناقش بقوة 1. في المقابل، في مراحل لاحقة من تطوير خلايا الدم (تكون الدم نهائيا)، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن تعدد النسب HSPC تنشأ من الخلايا المتخصصة الأوعية الدموية البطانية التي تحصل على الدم تشكيل المحتملة (الخلايا البطانية مكون للدم) داخل الكيس المحي، المشيمة، واجتماع الجمعية العامة العادية 2-5، وكذلك في المحي والأوعية السري، البطانة الجنينية 6، ورئيس الأوعية الدموية 7. مواصفات من الخلايا البطانية مكون للدم داخل هذه الأنسجة متميزة تحدث في مراحل معينة من التنمية؛ على سبيل المثال، داخل الكيس المحي في ~ E8.25 وفي اجتماع الجمعية العمومية في ~ E10 8-12. ومع ذلك، وحتى خلال هذه النوافذ التنموية محددة، فإن عدد سكان إندو مكون للدمخلايا thelial تمثل جزء صغير من جميع الخلايا البطانية (1-3٪ من الكيس المحي والخلايا البطانية إجتماع الجمعية العامة العادية) 11،12. عملية مكون للدم خلية "مواصفات" البطانية هو أمر حاسم لالفئران، وكذلك الإنسان، تكون الدم. وقد ثبت أن الخلايا المكونة للدم لبرعم من البطانة من السفن الكيس المحي والشريان الأورطي في الأجنة البشرية 13، ولقد أظهرت العديد من المختبرات أن إنتاج خلايا الدم من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يتطلب خلية البطانية المتوسطة 14-16. وهكذا، وتحديد النمط الظاهري الخلايا البطانية مكون للدم الفئران وفهم الأحداث الجزيئية التي تؤدي إلى تطوير في هذا النموذج الحيواني ينبغي أن تيسر السعي من التقنيات في المختبر لتوليد الخلايا البطانية مكون للدم من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان. بدوره، التنمية في نهاية المطاف من نهج لتوليد نطاق واسع من أنواع خلايا الدم متباينة من HSPC متعددة النسب - أنفسهم درعيفيد من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان عن طريق الخلايا البطانية مكون للدم ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وسيطة - سيكون لها الإمكانات العلاجية المذهلة لالدموية، علم الأورام والطب التجديدي. وتحقيقا لهذا الهدف، قمنا بتحديد النمط الظاهري الخلايا البطانية مكون للدم، على مستوى نسيلي، للصفار داخل الفئران كيس 11 و AGM 12، واثنين من المواقع الرئيسية لإنتاج HSPC نهائي خلال مرحلة التطور الجنيني. مثل HSPC ضمن الكبار نخاع العظم 17، والخلايا البطانية مكون للدم الجنينية وHSPC معرض هويشت خصائص صبغ هروب رأس المال، وبالتالي تظهر ضمن "سكان الجانب" (SP) من الخلايا في مؤامرة FACS 5،11،12 (كما هو موضح في الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا أيضا أن الخلايا البطانية مكون للدم تعبر عن علامات على حد سواء البطانية والخلايا الجذعية (Flk1 وcKit، على التوالي)، ولكن لا تعبر عن علامة النسب المكونة للدم، CD45 5،11،12. وهكذا، يمكن أن الخلايا البطانية مكون للدم أن يكون الرمزكخلايا Flk1 + / + cKit / CD45- ليرة سورية، وأظهرنا ified ومعزولة من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية أن هذه الخلايا تفرز HSPC الواردة في / cKit + / CD45 + SP جزء Flk1- من الكيس المحي والخلايا اجتماع الجمعية العامة العادية 5،11،12. الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC يمكن تحديد وعزل من الكيس المحي أو الأنسجة إجتماع الجمعية العامة العادية حصادها إما من الأجنة الموت الرحيم حديثا، أو من أجنة مثقف لمدة تصل إلى 48 ساعة في فيفو السابقين الثقافة الجنين (كما هو مبين في الشكل 1). وتسمح خارج الحي ثقافة انتقائية المعالجة المسبقة للأجنة الفردية مع وكلاء الدوائية، ويسمح أيضا للتعبير عابر الجينات المحورة المطلوب (أي من قبل تنبيغ lentiviral). تحديد نظام مراقبة الأصول الميدانية من الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC بالطريقة الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم مقياس كمي للتنمية المكونة للدم نهائية في نماذج الماوس التلاعب بها وراثيا. ويمكن أيضا أن الخلايا يمكن استرجاعها لتطبيقات تجريبية لاحقة، بما في ذلك الدم فوالمقايسات rming، تحليل التعبير، والزرع.

الموضوعات الحيوان: الاستخدامات والاعتبارات الأخلاقية

وقد أنشأت مجموعة متزايدة من الأدب مساهمة مهمة من الخلايا البطانية مكون للدم لتشكيل HSPC خلال المرحلة تكون الدم نهائية من التطور الجنيني. ومع ذلك، فإن الظروف والإشارات الفيزيولوجية التي تعزز مواصفات جزء من السكان من الخلايا البطانية نحو مصير دموي المنشأ لا تزال غير مفهومة تماما، وبالتالي لا يمكن حتى الآن تحاكي في الإعداد في المختبر. في الواقع، التقنيات الموضحة في هذه الورقة هي حاليا قيد الاستخدام من قبل مختبرنا وجماعات أخرى لتحسين الفهم للحقل التنمية hematovascular، بحيث نهجا لخارج الحي مواصفات الخلايا البطانية مكون للدم والإنتاج HSPC قد وضعت يوم واحد. حتى هذا الوقت، ومع ذلك، لا يزال هذا المجال يعتمد على الأنسجة الأولية من النوع البري (والجينتعديل tically) أجنة الفئران للحصول على تحديد الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC لمزيد من الدراسة. الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC يمكن التعرف بشكل صحيح وعزل من أي E8.5 (10-12 أزواج الجسيدة) الكيس المحي أو E10.5 (35 - 40 أزواج الجسيدة) إجتماع الجمعية العامة العادية 11،12. بسبب الندرة النسبية للخلايا البطانية مكون للدم (عادة ما يمثل 1-3٪ من مجموع الخلايا البطانية 11،12 داخل هذه الأنسجة) تجميع للأنسجة متعددة (~ 8-10) تتزاحم في عينة واحدة من المستحسن ل الحصول على خلايا كافية للتجريب لاحق. التحقق من أن الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC وقد تم تحديد بنجاح وعزل ويمكن تحقيق ذلك عن طريق الثقافة من الخلايا التي تم استردادها في ظل الظروف التي تحفز المكونة للدم التمايز. في ظل هذه الظروف، فإن الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC يحمل متعددة النسب المكونة للدم التمايز، مما أدى إلى ظهور المستعمرات التي تحتوي على ريهاالأسلاف throid (الاتحاد البلغاري-E)، محببة والبلاعم الأسلاف (كفو-GM)، ومحببة وكرات الدم الحمراء، بلعم، المستعمرات النواء السلف (كفو-GEMM).

Protocol

بيان الأخلاق: تم مراجعة بروتوكول المبينة أدناه من قبل، وليس وفقا للمبادئ التوجيهية لل، رعاية الحيوان المؤسسية جامعة ييل واللجنة الاستخدام.

1. الأجنة الجامعة بحكم الخامس ايفو الثقافة للدراسات الكيس المحي (اختياري)

  1. الموت ببطء السدود الحوامل في E7.0 - E7.5، وإزالة قرون الرحم تحت ظروف معقمة، كما هو موضح بمزيد من التفصيل أدناه (الخطوات 2،4-2،7).
  2. الأجنة منفصلة كليا (مع الكيس المحي سليمة 12) من الساقط المحيطة بها، وتعلق في 50 مل كله مصل الفئران في 50 مل أنابيب البوليسترين.
  3. زجاجات الجنين الغاز لمدة 3 دقائق مع 5٪ CO 2 مباشرة كما هو موضح سابقا 12،18. كرر هذه الخطوة في 24 ساعة إذا زرع الأجنة ل24 - 48 ساعة.
  4. احتضان في المتداول 37 ° C الثقافة لمدة تصل إلى 48 ساعة.
    ملاحظة: الأجنة يمكن علاج خارج الحي مع وكلاء الدوائية (أي الشق المانع DAP.تي 12) أو القابلة للذوبان البروتينات (أي الفيبرونكتين 19) خلال مرحلة ما قبل الحضانة من الأجنة لمدة تصل إلى 2 ساعة في المتوسط ​​الثقافة التي تحتوي على هذه العوامل، أو من خلال إضافة هذه العوامل إلى مستنبت المتداول لطول ثقافة فيفو السابقين فترة. التعبير الجيني يمكن التلاعب في الأجنة عن طريق مرحلة ما قبل الحضانة من الأجنة مع الفيروسة البطيئة titered الأمثل لمدة 2 ساعة 12. يمكن رصدها صفار الأوعية الدموية الكيس والتنمية المكونة للدم في الوقت الحقيقي باستخدام الفئران المعدلة وراثيا مراسل وتقنيات التصوير الضوئي.

2. تشريح الكيس المحي (يس) أو الأورطي، الغدد التناسلية-mesonephros (AGM) من أجنة الفئران

  1. تعقيم مختبر مقاعد البدلاء عن طريق الرش ومسح أسفل جميع الأسطح مع الايثانول 70٪ للحد من التلوث في مزارع الخلايا لاحقة. وضع underpad ماصة على سطح مقاعد البدلاء المختبر.
  2. تعقيم الأدوات الجراحية مع 70٪ من الإيثانول. الأدوات الجراحية الموصى بها اثنان # 5 قوة التواليملاحظة، واحد مقص 8.5 سم على التوالي.
  3. إذا كان يعمل مع الأجنة من الثقافة خارج الحي، وإزالة بعناية أجنة كاملة من 50 مل أنابيب الصقر والشروع فورا في خطوة 2.8. خلاف ذلك، تخطي هذه الخطوة وانتقل إلى الخطوة 2.4.
  4. الموت ببطء السد حامل في العمر الجنيني المناسب (E8.5 إذا YS الحصاد؛ E10.5 إذا حصاد الجمعية العمومية).
    ملاحظة: تقنية وصفها توظف نهج القتل الرحيم المزدوج طريقة - جرعة قاتلة من مخدر متقلبة تليها خلع عنق الرحم الميكانيكية - لتقليل ألم وأسى الحيوان، وضمان إنهاء مينيملي وإنسانية على الحيوانات. ويوصى باستخدام هذه التقنية جنبا إلى جنب للقتل الرحيم القوارض الصغيرة من قبل الجمعية الأميركية للطب البيطري عندما يقوم بها محقق المدربين ويتقن (المبادئ التوجيهية اخر احصاء للالقتل الرحيم للحيوانات: 2013 الطبعة).
    1. تخدير الماوس باستخدام جرعة قاتلة من الأيزوفلورين (> 5٪ في O 2) ل3-5 دقيقة. (CAUTION: الأيزوفلورين هو المستنشق السامة. استخدام تحت غطاء الدخان الكيميائية مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة في الجهاز التنفسي.)
    2. وبعد تعرض الفئران لالأيزوفلورين، تحقق على الأقل ثلاثة علامات مستوى مخدر - فقدان المنعكس التقويمي، وفقدان منعكس قرصة أخمص قدميه، والحد من معدل التنفس - لضمان المواضيع حققت طائرة التخدير العميق قبل الشروع في القتل الرحيم الميكانيكية.
    3. Cervically خلخل السد للحث بسرعة الموت.
  5. ضع الموت الرحيم مستلق سد على underpad وبتحرر رش أسفل البطن مع الايثانول 70٪.
  6. جعل شق عمودي على طول خط الوسط من جدار البطن السفلي. جعل شقوق إضافية ~ 1 بوصة أفقية تمتد اليمين واليسار من نقطة الوسط من شق عمودي، وتشريح بعيدا جدار البطن للكشف تماما قرون الرحم اليمين واليسار تحتوي كل منها على عدة أجنة يختمر.
  7. باستخدام ملقط، عقد واحد من قرون الرحم اثنينواستخدام المقص لفصلها عن مسراق الرحم. وضع الرحم تشريح على الجليد في معقم هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) في 60 ملم لوحة زراعة الأنسجة البوليسترين. أكرر للقرن الرحم الآخرين.
  8. تحت المجهر القياسية ضوء تشريح، واستخدام الملقط لسحب بعيدا الطبقة العضلية من كيس الرحم للكشف عن كيس الحمل الأساسي والساقط. عزل YS (الشكل 2A) عن طريق إزالة بلطف كيس من الجنين المغلقة. إزالة الأنسجة YS من الجنين السليم في الأصل الجنيني للسفن المحية.
  9. لعزل اجتماع الجمعية العامة العادية، وإزالة YS والقطع الجنين أقل من مستوى القلب والأطراف الأمامية وتجاهل الصدر ورئيس المنطقة. بعد ذلك، القطع الجنين أقل بقليل من مستوى hindlimbs وإزالة والتخلص من الأنسجة الذيل. إزالة hindlimbs والأنسجة بطني الزائدة من قسم المتبقية، والتي تحتوي على اجتماع الجمعية العامة العادية (الشكل 2B).
  10. تجمع YS أو الجمعية العامة العادية أنسجة من الأجنة المتعددة ومخزنعلى الجليد في HBSS + (HBSS تستكمل مع 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 0.3 ملغ / مل L-الجلوتامين) في أنبوب 1.5 مل نظيف.

3. الهضم من الأنسجة الأولية إلى تعليق خلية واحدة

  1. أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على YS حصادها أو الأنسجة إجتماع الجمعية العامة العادية لمدة 5 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية.
  2. إزالة طاف والأنسجة resuspend في 1 مل من أي 0.05٪ (لYS) أو 0.2٪ (لانعقاد الجمعية العادية) نوع كولاجيناز الثاني مخففة في HBSS +. احتضان لمدة 30 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية، وعكس أنبوب كل 5 دقائق لخلط.
  3. بلطف ميكانيكيا فصل الأنسجة عن طريق تمرير العينة 10 مرات من خلال ماصة P1000. إذا كان وجود صعوبة الشفط الأنسجة هضمها جزئيا، قد اتسعت ماصة تتحمل بقطع ~ 5 ملم من طرف مع زوج من مقص.
  4. عينة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend في 1 مل الجليد الباردة HBSS +.
  5. تمرير العينة من خلال 70 و# 956؛ م مصفاة الخلية.
  6. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات اليدوي أو الآلي.
  7. عينة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية. عينة resuspend في DMEM + (4.5 غرام / تستكمل L الجلوكوز Dulbecco لتعديل النسر متوسطة مع 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 0.3 ملغ / مل L-الجلوتامين) مسبقا تحسنت إلى 37 درجة مئوية بحيث الخلايا بتركيز نهائي من 1 × 10 6 خلية / مل.

4. علاج الخلايا مع الأحماض النووية صبغ وصفها مع Fluorescently مترافق الأجسام المضادة

  1. قسامة لا يقل عن 100 ميكرولتر من عينة (1 × 10 5 خلايا) إلى الطازج 1.5 مل أنابيب للحضانة الأضداد.
  2. وتشمل العينة التالية وأنابيب المراقبة الضرورية: غير ملوثين. cKit-APC فقط؛ CD45-FITC فقط؛ CD31-PE فقط؛ Flk1-PECy7 فقط؛ هويشت 33342 فقط؛ هويشت 33342 + فقط فيراباميل. عينة (يتلقى كل الألوان، لن تتلقى فيراباميل). استخدام ما لا يقل عن 1 × 10 ملاحظة: يمكن إضافة وحدة تخزين أكبر من الخلايا إلى أنبوب عينة في نفس التركيز على تعظيم العائد من فرز مكون للدم EC وHSPC.
  3. إضافة فيراباميل مخففة في 95٪ من الإيثانول (انظر مناقشة لمنطق) إلى "هويشت 33342 فقط + فيراباميل" أنبوب تحكم إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر. احتضان جميع الأنابيب لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. (تنبيه: فيراباميل هو قوي قناة الكالسيوم وكيل الحجب وغير سامة للغاية التعامل مع قفازات).
  4. إضافة هويشت 33342 إلى "هويشت 33342 فقط" التحكم، + فيراباميل السيطرة الوحيدة هويشت 33342، وإلى أنبوب "عينة" لتركيز النهائي من 5 ميكروغرام / مل. احتضان جميع الأنابيب لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية، محمية من الضوء. المزيج بلطف عكس كل 15 دقيقة. (تنبيه: هويشت 33342 هو صبغ النووية السامة، وينبغي التعامل مع قفازات).
  5. أجهزة الطرد المركزي كل عصيدةليه لمدة 5 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend الكريات خلية في تركيز 1 × 10 5 خلية / مل في البرد HBSS +.
  6. إضافة الأجسام المضادة مترافق fluorescently لأنابيب ضبط الأجسام المضادة الوحيدة المناسبة، وإلى أنبوب "عينة" لتركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، ومحمية من الضوء.
  7. الطرد المركزي جميع الأنابيب لمدة 5 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في HBSS 500 ميكرولتر الجليد الباردة. عينات سلالة من خلال شبكة غطاء فلتر من 5 مل جولة أسفل أنبوب البوليسترين FACS ومتجر على الجليد، محمية من الضوء، لنظام مراقبة الأصول الميدانية المباشرة.

5. تحديد وعزل الخلايا مكون للدم غشائي وHSPC بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام نظام BD FACSAria 5-ليزر مجهزة 100 ميغاواط 355 نانومتر ليزر الأشعة فوق البنفسجية، 200 ميغاواط 405 نانومتر البنفسج الليزر، 200 ميغاواط 488 نانومتر الليزر الأزرق، 200 ميغاواط 532 نانومتر ليزر أخضر، و 150 ميغاواط 637 نانومتر الأحمرالليزر. تم فرز الخلايا في برنامج تلفزيوني العقيمة كسائل غمد وتحت ظروف معقمة، ومن خلال فوهة 100 ميكرومتر مع معدل التدفق لتعيين ضغط عينة من 1 مثل ما لا يزيد عن 1500 - 2000 الأحداث التي حصلت في الثانية لتقليل الإجهاد الخلية.

  1. في ظل هذه الإعدادات الموضحة أعلاه، استخدام "غير ملوثين" واحد أنابيب التحكم في الألوان لتحسين نظام مراقبة الأصول الميدانية شدة الليزر خلية فارز وأداء متعدد الألوان السيطرة تعويض الطيفي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام الأمام والجانب مبعثر لأداء الخلية الحية وصدرة ضيقة التمييز من مجموع الأحداث (انظر تعليمات الشركة الصانعة لمزيد من التفاصيل).
    ملاحظة: هذا البروتوكول النتائج عادة في ~ 70 - خلايا قابلة للحياة 80٪. إذا واجهت مشاكل مع بقاء الخلية منخفضة، تأكد من أن الأنسجة وتشريح في البداية بسرعة في الثلج وسائل الإعلام البارد، والتي يتم تنفيذ جميع الخطوات باستثناء تحديد خلاف ذلك خارجا على الجليد، مع pipetting لطيف للحد من القص وخلية الموت(انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل على الحفاظ على بقاء الخلية).
  2. استخدام مؤامرة التفاضلية الخطية النطاق للهويشت الأحمر مقابل مضان هويشت الأزرق لتحديد الأحداث السكان الجانبية (SP) (الشكل 3A). استخدام "هويشت 33342 فقط + فيراباميل" التحكم كعنصر تحكم السلبية للتحقق من بوابات يتم رسمها بشكل صحيح للعينة. ستظهر SP كما في الكتف إلى اليسار من الخلايا غير SP، وسيتم انخفضت في السيطرة يعامل فيراباميل. وسوف تستخدم السكان غير SP-لتحديد غير مكون للدم EC (الشكل 3B).
  3. خلق المؤامرات التفاضلية مضان إضافية (محاور تسجيل النطاق)، ورسم بوابات ابنة ليرة سورية لتحديد الخلايا البطانية مكون للدم (الشكل 3C-E).
    ملاحظة: لمحة عن الخلايا البطانية مكون للدم إلى خلايا Flk1 + / + cKit / CD45- SP (الشكل 3D)، وHSPC هي Flk1- / cKit + / CD45 + خلايا ليرة سورية (الشكل 3E). مكون للدم البطانية جويمكن تحليل ملتعلمي اللغة اإلنكليزية بالتوازي مع الخلايا البطانية غير مكون للدم، والتي تم تحديدها في هذا النهج كما CD31 + / CD45- خلايا غير SP (الشكل 3B).
  4. استرداد الخلايا البطانية مكون للدم أو HSPC جزء على ميتيل تحتوي على لوحات لثقافة المكونة للدم (أنظر أدناه)، أو إلى مخازن أخرى للمعالجة وتحليل لاحقة.

6. المكونة للدم التمايز في الثقافة

  1. إضافة 0.5 مل (135 ميكرولتر / سم 2) للدم سائل الإعلام والثقافة القائمة على ميتيل إلى العدد المرغوب فيه من الآبار من 24 لوحة جيدا زراعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 0.5 مل من الماء المعقم في الآبار غير المستخدمة لتقليل التبخر. إعداد جديدة والحفاظ على درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
  2. نوع 1-10 خلايا لتحليل نسيلي، أو ما يصل إلى 1000 الخلايا البطانية مكون للدم (Flk1 + / cKit + / خلايا CD45- SP) أو HSPC (خلايا Flk1- / cKit + / CD45 + SP) للتوسع الأكبر والتمايز مباشرة في كل بئر منلوحة تحتوي على ميثيل. تم الكشف عن تشكيل مستعمرة في حوالي 10-20٪.
  3. في نسيج الثقافة هود العقيمة، واستخدام غيض P1000 مع طرف قلص لتوسيع تجويف لها، ل resuspend بلطف كل بئر من وسائل الإعلام ميثيل المصنفة 2-3 مرات، مع الحرص على تجنب خلق فقاعات. وهذا يضمن وقف الخلايا مصنفة في ميثيل نصف صلب للنمو الأمثل.
  4. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  5. مراقبة الثقافات خلية واحدة لتشكيل متباينة مستعمرات الخلايا المكونة للدم على مر الزمن (الشكل 4). تسجيل الآبار لعدد ونوع من المستعمرات المكونة للدم متباينة في أيام 1 و 3 و 7 و 14 من طريقة (ق) المبينة أدناه في الخطوة 6.7.
    1. لوحات النتيجة يوم 1 لتأكيد confluency واستمرار بقاء الخلايا فرزها.
    2. يوم 3، تحقق من التعجيل بتشكيل مكون للدم ملتصقة مستعمرات الخلايا البطانية مع "الحصىلهجة "مورفولوجيا (انظر غولدي وآخرون. 11 ومارسيلو وآخرون. (12) لتمثيل يوم 3 التشكل).
    3. قبل أيام 5-7، تحقق لتشكيل مجموعات HSPC مدورة في الآبار التي تحتوي فرز مكون للدم EC. HSPC ينبغي مراعاتها المجاور لبالارض مكون للدم EC عرض على "الحصوه" مورفولوجيا الخلايا البطانية.
      ملاحظة: يجب أن الخلايا البطانية مكون للدم تشكل المستعمرات المكونة للدم (يحدده عدد مستعمرة المكونة للدم)، ويجب أن تثبت قدرة التمايز متعددة النسب (تحدد من خلال رصد أنواع متعددة مستعمرة من خلية واحدة). وقد لاحظنا سابقا أن ~ 20٪ من المفوضية الأوروبية مكون للدم أو HSPC استردادها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية البقاء على قيد الحياة لتشكيل التفريق وتنتشر المستعمرات المكونة للدم في ميتيل 11.
  6. لتقييم تشكيل مستعمرة من قبل مرحلة المجهر:
    1. تصور وعدد المستعمرات في انخفاض اوند التكبيرإيه المجهر المرحلة ضوء، وتحديد الاتحاد البلغاري-E، كفو المعدلة وراثيا، وكفو-GEMM المستعمرات التي مورفولوجيا مستعمرة، كما وصفها غولدي وآخرون. 11.
  7. لتقييم تشكيل مستعمرة من قبل مورفولوجيا الخلايا:
    1. قلص نضح المستعمرات الفردية من سطح ميثيل في تلميح P1000 مع نهاية لتوسيع تجويف. هذا يسهل تطلع المتوسطة ميثيل لزج ويضمن استرجاع الناجح للمستعمرة.
    2. اختار و resuspend المستعمرات إلى 200 مل HBSS وتدور على شريحة زجاجية باستخدام cytocentrifuge في 28 x ج لمدة 5 دقائق.
    3. إصلاح الشرائح في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق (تنبيه: الميثانول السامة وينبغي أن تستخدم فقط في غطاء الكيميائية مع التهوية المناسبة ومعدات الحماية الشخصية).
    4. غمر الشرائح في 0.04٪ بالغيمزا صمة عار لمدة 20 دقيقة (تحذير: يحتوي بالغيمزا صمة عار الميثانول استخدام في غطاء الكيميائية مع التهوية المناسبة والشخصآل معدات الحماية).
    5. شطف الشرائح في الماء منزوع الأيونات.
    6. جبل الشرائح مع coverslips، وصورة في تضخم عالية تحت المجهر ضوء معيار، مقارنة مورفولوجيا الخلايا لتلك التي لوحظت كلاسيكيا في الخلايا المكونة للدم من نخاع العظام الكبار التي هي مثقف في وسائل الإعلام ميثيل. فعلى سبيل المثال، يرجى الاطلاع على تعليمات الشركة الصانعة.
  8. لتقييم تشكيل مستعمرة من قبل التعبير خلية من علامات النسب المكونة للدم عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية:
    1. إضافة 2 مل من HBSS إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا تحتوي على المستعمرات مثقف على 0.5 مل ميثيل (أي تمييع المتاحة تجاريا ميثيل الأوراق المالية 1: 4). ماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج، ونقل إلى أنبوب جديد (ق).
    2. عينة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية باستخدام معيار طاولة قمة microcentrifuge ل.
    3. إزالة وطاف بيليه الخلايا و resuspend (ق) في 1 مل HBSS +، وتجميع عينات إذا رغبت في ذلك.
    4. Centrifuعينة جنرال الكتريك في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    5. إزالة وطاف بيليه الخلايا و resuspend (ق) في 400 ميكرولتر HBSS +.
    6. عينة قسامة إلى أربعة أنابيب 1.5 مل على النحو التالي: غير ملوثين. B220-FITC فقط؛ GR-1-FITC فقط؛ Ter119-FITC فقط.
    7. إضافة الأضداد fluorescently مترافق إلى أنبوب المناسب لتركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    8. عينة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في الجليد الباردة 0.5 مل HBSS.
    9. تحليل كل عينة عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية للتعبير عن كل علامة النسب المكونة للدم: B220 يصادف الخلايا البائية 20؛ GR-1 علامات خلايا الدم النخاعي 21؛ Ter119 يصادف خلايا محمر 22.
      ملاحظة: قد يتم إدراج الأجسام المضادة إضافية تستهدف علامات النسب المكونة للدم الأخرى في هذا النهج، إذا رغبت في ذلك.

Representative Results

وضع العلامات الناجحة من الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC من YS الجنينية أو الجمعية العامة العادية سوف تسفر FACS المؤامرات مبعثر مماثلة لمؤامرات التمثيلية المعروضة في الشكل (3). وبعد الخلية الحية القياسية والتمييز صدرة من الأمام والجانب مبعثر (لا يظهر)، والسكان الجانب (SP) وتصور الأحداث في هويشت الأحمر مقابل هويشت الأزرق مؤامرة التفاضلية الخطية في غياب فيراباميل بأنه "الكتف" اليسار تحول، من غالبية (غير SP) أحداث (الشكل 3A). عندما يوجه بوابة SP بشكل صحيح، وخلايا ليرة سورية تمثل حوالي 1-3٪ من مجموع الخلايا YS قابلة للحياة و3-5٪ من مجموع الأحداث إجتماع الجمعية العامة العادية قابلة للحياة. العلاج فيراباميل ينبغي أن يؤدي إلى> 50٪ من تثبيط الأحداث SP بغض النظر عن مصدر الأنسجة (الشكل 3A، لوحات أعلى). لقد وضحنا سابقا أن الشعوب الأخرى التي تظهر خارج الكتف SP ولكنها منعت أيضا فيراباميل وerythr Ter119 إيجابيةوبالتالي يتم استبعاد أقاليم، ومن السكان ليرة سورية لدينا 5.

مقارنة ليرة سورية، ويتم تحديد خلايا غير SP-باسم كتلة كثيفة من الخلايا المجاورة ليرة سورية "الكتف" (الشكل 3A). يحتوي هذه الفئة من السكان غير مكون للدم-EC التي يمكن تمييزها باستخدام CD31-PE مقابل CD45-FITC ابنة مؤامرة (الشكل 3B)، كما CD31 + / أحداث CD45-. غير مكون للدم EC عادة ما تكون 2-5٪ من الخلايا غير SP-من اجتماع الجمعية العامة العادية (الشكل 3B) أو الكيس المحي (لا يظهر)، وأعداد كبيرة من هذه الخلايا يمكن فرز الظهر مع السهولة النسبية.

لتحديد HSPC ومكون للدم EC، يتم رسمها أبواب ابنة من الكسر ليرة سورية، وتحديد CD45 + وCD45- الخلايا، حيث CD45 + الخلايا عادة <20٪ من مجموع الأحداث في كل من الجمعية العامة العادية (الشكل 3C) أو YS (لا يظهر). يتم تحديد مكون للدم EC في وقت لاحق من خلايا CD45- في التفاضلي cKit-APC مقابل Flk1-PECy7 ابنة صالكثير عن الأحداث المزدوج إيجابية، وتمثل عادة 1-3٪ من أحداث CD45- عندما عزل من أي إجتماع الجمعية العامة العادية (الشكل 3 D) أو YS (لا يظهر). يتم تحديد HSPC من جزء CD45 + في منفصلة cKit-APC مقابل Flk1-PECy7 مؤامرة ابنة كما Flk1- / cKit + الخلايا، وأيضا تمثل عادة حوالي 25 - 30٪ من عدد صغير من السكان CD45 + الخلايا عندما تم الحصول عليها من أي YS (لا معروضة) أو الجمعية العامة العادية (الشكل 3 E). وهكذا، كل من مكون للدم EC وHSPC نادرة للغاية (~ 0.01٪ من إجمالي الأحداث الخلية)، وأنه هو نموذجي لهذا البروتوكول للعودة بضع مئات من كل نوع من الخلايا حتى عندما يتم تجميع الأنسجة من أجنة متعددة. وينبغي إنشاء بوابات في المؤامرات ابنة مع الإشارة إلى مجموعات المراقبة السلبية. من أجل التمييز بين تلطيخ محددة وغير محددة الأجسام المضادة، ينبغي بوابات ضعت في البداية في إشارة إلى كل الضوابط غير ملوثين (الشكل 3C)، وكذلك العينات التي تم التعامل مع مطابقة نمط إسوي (IgG2A أو IgG2B) الأجسام المضادة السيطرة fluorescently مترافق (لا يظهر). وقد أثبتت هذه السيطرة الأخيرة التي تلطيخ غير محددة هو الحد الأدنى من هذا البروتوكول، وبالتالي بينما نحن نوصي بأن الأجسام المضادة ضبط مطابقة نمط إسوي (على سبيل المثال، IgG2A-PE أو IgG2B-FITC) أن تستخدم في البداية لتحسين إعدادات فارز FACS وتحديد الحدود البوابة نجد أيضا أن الضوابط غير ملوثين كافية للتحقق من الحدود البوابة وجودة التجريبية خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية الروتينية الفرز. إذا يتم رسمها البوابات بشكل صحيح، ينبغي مراعاة مبعثر إيجابي في الحد الأدنى من بوابات المفرد أو المزدوج إيجابية عند التسجيل من الضوابط غير ملوثين أو مطابقة نمط إسوي.

الخلايا البطانية مكون للدم من اجتماع الجمعية العامة العادية وHSPC الخضوع التمايز للدم أكثر من 14 يوما للثقافة في ميثيل (الشكل 4A). الحصة النسبية من أنواع مستعمرة احظ عادة في هذهثقافات تعتمد على مصدر الأنسجة. الخلايا البطانية مكون للدم معزولة عن الأنسجة الكيس المحي في E8.5-E9.5 ارتفاع العطاء إلى الاتحاد البلغاري-E، كفو جنرال موتورز، وعدد قليل كفو-GEMM 5، في حين أن الخلايا البطانية مكون للدم معزولة عن E10.5 اجتماع الجمعية العامة العادية تثير في الغالب كفو -GEMM 12، على الرغم من الأنساب الأخرى لا تزال لاحظ، كما هو مبين في الشكل 4B (أعلى يسار لوحة). HSPC معزولة عن E10.5 اجتماع الجمعية العامة العادية أيضا إعطاء الارتفاع في الغالب إلى كفو-GEMM على الثقافة في ميثيل (الشكل 4B، أعلى لوحة المتوسطة)، على الرغم من أن هذه الخلايا سوف يفرق أيضا إلى أنواع مستعمرة المكونة للدم الأخرى كذلك. الخلايا البطانية غير مكون للدم (CD31 + / CD45- غير SP) كما تم مطلي (الشكل 4B، أعلى اللوحة اليمنى). وتظهر هذه الخلايا أي نمو في الثقافة المكونة للدم بعد 14 يوما.

فحوصات للدم القدرة الفردية علامة السطح معربا عن أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا مع وبدون التعبير المكونة للدم لالثانية علامات البطانية تم تنفيذها وإثبات أن النشاط مستعمرة متعددة النسب تشكيل في E10.5 اجتماع الجمعية العامة العادية يقتصر CD31، Flk1، ج كيت، VE-نذل، CD41، CD45 وداخل جزء SP الجمعية العامة العادية للفي E10.5 لCD31 +، VE كادهيرين +، ج كيت +، CD41 + CD45 و+ SP الخلايا 12. ومن المثير للاهتمام، لوحظ مستعمرة تشكيل النشاط في كل من خلايا + وFLK-1- SP-1 FLK، ولكنه لم يعط فقط Flk1 + ج + كيت CD45- SP الخلايا يؤدي إلى مستعمرات متعددة النسب عن طريق أحادي الطبقة البطانية المتوسطة التي تتميز على حد سواء "الحصوه "البطانية خلية التشكل (الشكل 4B، لوحة الأيسر السفلي) وديل-AcLDL امتصاص 12. وعلاوة على ذلك، التعبير عن ج-كيت ضروري للنشاط للدم من خلايا اجتماع الجمعية العامة العادية SP 12.

في حين تبين أن بعض الأسلاف النخاعي لديها الخصائص المورفولوجية مماثلة بالمقارنة مع الخلايا البطانية مكون للدم، وخلايا الدم النخاعي السلف تعبر عن CD45 و لا يمكن أن تولد مستعمرات متعددة النسب 12،23 وتؤدي إلى مجموعات الخلايا مدورة دون أحادي الطبقة البطانية الأساسية (الشكل 4B، لوحة اليمنى السفلى). ولذلك، فإن السكان نحدد البطانة كما مكون للدم (أو خلايا FLK-1 + / ج كيت + / CD45-SP) تمثل الخلايا البطانية مع الدم تشكيل التعبير المحتملين وقوي جين hematoendothelial، بما في ذلك GATA-1/2، Lmo2، SCL / تل-1، Runx-1، ج كيت، CD34، CD41، CD45 و11 التي تختلف من الجذعية والسلف الخلايا المكونة للدم، وكذلك غير مكون للدم نظرائهم الخلايا البطانية الخاصة بهم.

شكل 1
الشكل 1. عموما سير العمل. باختصار، يتم إزالة الأجنة من السدود الحوامل، ويتم حصاد YS أو الأنسجة إجتماع الجمعية العامة العادية. قد يكون اختياريا مثقف الأجنة لمدة 2 4-48 ساعة خارج الحي قبل الحصاد الأنسجة. يتم هضمها YS حصادها أو الأنسجة إجتماع الجمعية العامة العادية لتعليق خلية واحدة، aliquoted إلى سيطرة وعينة الأنابيب، وحضنت في وجود هويشت صبغ و / أو الأجسام المضادة fluorescently مترافق. فيراباميل، مثبط قناة الكالسيوم ويستخدم أيضا لتوليد سيطرة سلبية أساسية للتحقق من النابضة دقيق للجزء SP. ويتم تحديد الخلايا البطانية مكون للدم عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية كما Flk1 + / + cKit / CD45- SP الخلايا، في حين ترد HSPC داخل Flk1- / cKit + / CD45 + SP جزء من الخلايا. كلا يتم فرز أنواع الخلايا على ميتيل لتأكيد إمكانية مكون للدم. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا البطانية غير مكون للدم يمكن التمييز (واسترجاعها، إذا رغبت في ذلك) كما CD31 + / CD45- خلايا غير SP. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

igure 2 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg "/>
الشكل 2. تشريح YS واجتماع الجمعية العامة العادية الأنسجة. أ) يتم تشريح YS بعيدا عن الأجنة E8.5، وضعت كلها في العقيمة HBSS + لاحق الهضم. ب) يتم عزل الجذع من أجنة E10.5 بجعل التخفيضات الأفقية أدناه كل من forelimb وhindlimb البراعم. ثم يتم فصل AGM من براعم الأطراف وملقط الأنسجة باستخدام بطني. C) وصور مشرق الميدان تظهر تشريح كل من يس وAGM من جنين E10.5 (مقياس = 1 مم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. مؤامرات التمثيلية إظهار بوابة التسلسل الهرمي للالتمييزمن مكون للدم الخلية البطانية الصورة (Flk1 + / cKit + / خلايا CD45- SP)، HSPC (Flk1- / cKit + / خلايا CD45 + SP)، والخلايا البطانية غير مكون للدم (CD31 + / CD45- غير SP) من نظام مراقبة الأصول الميدانية من E8.5 YS أو E10.5 اجتماع الجمعية العامة العادية وبعد الحية الخلية وصدرة تمييز الخلايا من أي YS (من اليسار وحات) أو الجمعية العامة العادية (لوحات اليمين) من الأمام والجانب مبعثر (لا يظهر)، A) السكان الجانب (ويوجه SP) بوابة والتحقق منها من انخفاض ملحوظ في نسبة SP في السيطرة السلبية يعامل فيراباميل. يتم تعريف السكان غير SP-باسم كتلة كثيفة من الخلايا المجاورة ليرة سورية. في كل من المؤامرات عرض يتم عرض 20،000 الأحداث التي حددت ب) الخلايا البطانية غير مكون للدم إلى خلايا CD31 + / CD45- داخل جزء غير SP-وتمثل 2 - 5٪ من خلايا غير SP-سواء تم الحصول عليها من الجمعية العامة العادية (كما هو موضح ) أو YS (لا يظهر). لdiscriminate مكون للدم EC أو HSPC، C) يتم رسمها أبواب ابنة من الكسر ليرة سورية لتحديد CD45 + وCD45- الخلايا. D) لتحديد الخلايا البطانية مكون للدم من أي إجتماع الجمعية العامة العادية (كما هو موضح) أو YS (لا يظهر)، يتم رسمها أبواب ابنة إضافية من جزء CD45- للتمييز + (مقابل cKit-) وFlk1 + (مقابل Flk1-) خلايا cKit. مكون للدم EC من أي YS أو الجمعية العامة العادية وعادة ما تكون ~ 1-3٪ من أحداث CD45- يتم تحديد E) HSPC من CD45 + جزء كما cKit + وFlk1-، وعادة ما تمثل 20 - 30٪ من CD45 + الخلايا سواء مرتبة من اجتماع الجمعية العامة العادية (كما هو موضح ) أو YS (لا يظهر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. Visualization من للدم التمايز التالية ثقافة مكون للدم الخلايا البطانية وHSPC على ميثيل. أ) شكل المستعمرات من الخلايا الفردية فرزها خلال 7 أيام من الطلاء على ميثيل. ويمكن التأكد متعددة النسب المكونة للدم الإمكانات من خلال رصد عدة أنواع مستعمرة المكونة للدم، التي حددها تقييم الأشكال التضاريسية مستعمرة متميزة (11). ب) المرحلة التصوير المجهري للمرتبة EC مكون للدم وHSPC من اجتماع الجمعية العامة العادية (أو يس، لا معروضة) عرض متعدد النسب المكونة للدم تشكيل مستعمرة بعد 7 أيام من الثقافة في مستنبت ميثيل. غير مكون للدم EC من اجتماع الجمعية العامة العادية (أو يس، لا يظهر) لا تثبت النمو في ظل هذه الظروف. في أعلى التكبير، الخلايا الملتصقة مع الكلاسيكية "الحصوه" مورفولوجيا الخلايا البطانية (السهم الأبيض) يمكن أن ينظر إليه مما أدى إلى مجموعات من الخلايا المكونة للدم في طريق مسدودتوريس من مكون للدم المجموعة الأوروبية؛ لم يلاحظ أي تلك الخلايا البطانية في ثقافات HSPC فرزها (مقياس = 100 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

لا تزال هناك الكثير من علامات الاستفهام في مجال التنمية hematovascular - حقل التي لا تزال في مهدها بسبب الصعوبات التقنية الكامنة في دراسة عابرة وعدد صغير من الخلايا التي تظهر فقط خلال نوافذ تنموية محددة. التقنيات المذكورة أعلاه وتخفف كثيرا من هذه الصعوبات من خلال السماح لعزل الخلايا حتى واحدة من الخلايا البطانية مكون للدم والسكان HSPC في الأنسجة الجنينية في نقطة زمنية التنموية الحرجة باستخدام الكواشف والمعدات المتوفرة في معظم المختبرات عادة. كما يسمح بروتوكول لدينا لعزل موازية من غير مكون للدم كسور الخلايا البطانية من YS واجتماع الجمعية العامة العادية، والتي يمكن استخدامها لتحليل مستقلة، أو ضوابط لمكون للدم جزء الخلايا البطانية في التحليلات اللاحقة.

وهناك نقطة رئيسية في عزل الخلايا البطانية مكون للدم باستخدام هذا الأسلوب متعدد الألوان المعتمدة على نظام مراقبة الأصول الميدانية هي شارك الطيفي المناسبmpensation والرسم الدقيق للبوابات أحادية اللون. على هذا النحو، فمن المستحسن أن يتم تضمين الضوابط غير ملوثين وأحادية اللون في جميع أشواط التجريبية، وأنها - جنبا إلى جنب مع عينات تعامل مع الأجسام المضادة ضبط مطابقة نمط إسوي - استخدامها لإنشاء مبدئيا تعويض الطيفي السليم ورسم البوابات. ومع ذلك، وتلطيخ غير محددة هو الحد الأدنى من هذا البروتوكول، وبالتالي التحكم غير ملوثين وأحادية اللون كافية للتحقق روتيني من البوابات مرة واحدة وقد تم تحسين إعدادات فارز FACS.

بوابات SP رسمها بشكل غير دقيق هو مصدر قلق خاص مع النهج المبينة في هذا التقرير. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المعرض هروب رأس المال تفضيلية من هويشت الأحمر 17، والتي تشكل أساسا فسيولوجيا لظهورها في SP بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية. لقد أظهرنا أن الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC توجد بالمثل في جزء الخلية SP 5،11. المخدرات مثل قناة الكالسيوم فيhibitor فيراباميل منع هذا السلوك هويشت صبغ هروب رأس المال في الخلايا SP عبر انسداد مجموعة متنوعة من النقل عبر الغشاء المقاومة للأدوية المتعددة. في الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف، ويحدث هذا في المقام الأول عن طريق نقل ABCG2 / BCRP1 24. وعادة ما يؤدي الى فيراباميل> 50٪ انسداد ليرة سورية، ومع ذلك، فقد أظهرت الدرجة الكلية للهويشت هروب رأس المال وانسداد لاحقا من قبل فيراباميل يرى أن تتأثر توقيت التنموي، ويفترض بسبب تغير تعبير عن أدوية المتعددة متعددة الأنواع نقل المقاومة مع الفارق هويشت القدرة هروب رأس المال، والحساسية للفيراباميل 5. وبالتالي، فمن المستحسن أن فيراباميل المعالجة هويشت الملطخة سلبية السيطرة إدراجها standardly لضمان النابضة SP الصحيح: إذا ويوجه بوابة SP بشكل صحيح، يجب أن يتم الكشف عن انخفاض ملحوظ في عدد الخلايا SP في عينات ملطخة هويشت في وجود فيراباميل.

لقد أظهرنا في وقت سابق ان فرزخلايا ليرة سورية من الكيس E9.5 الفئران صفار لها ~ 80-90 أضعاف قدرة أكبر على توليد HSPC في الثقافة المكونة للدم القائم على ميثيل بالمقارنة مع عدد متطابق من E9.5 غير المجزأ، الملطخة غير هويشت-كلها خلايا الأنسجة YS 5. وقد أظهرت المزيد من توصيف ليرة سورية أنه في الكيس المحي الفئران خلال المكونة للدم في وقت مبكر والتنمية الأوعية الدموية في E8.0، هناك تعبير ملموس من VE كادهيرين وFLK-1، ولكن انخفاض التعبير الجذعية (ج كيت) وعلامات المكونة للدم (CD45). وهكذا، في هذا timepoint التنموي، الأساسي (غير مكون للدم) EC، الذي يعرف بأنه FLK-1 + / CD31 + / CD45- خلايا غير SP تسود. هذا الملف التعبير التحولات كما يقلل التعبير علامة البطانية وCD45 وج كيت زيادات التعبير، بالتزامن مع القدرة المتزايدة لتوليد HSPC في المختبر بين E9.5 وE11.5 5. وهذا يشير إلى ويرد النشاط للدم من الأنسجة YS داخل SP، لتصبح أكثر وضوحا بين E9.5 وE11.5، وoccurrجي من خلال خسارة في الوقت المناسب من الخصائص البطانية والاستحواذ التدريجي للقدرة للدم. على هذا النحو، تعبيرا عن نقل المقاومة للأدوية المتعددة التي تؤدي إلى النمط الظاهري ليرة سورية وعلامة المظهرية الهامة من البطانة مكون للدم 5؛ في الواقع، خلايا غير SP-من اجتماع الجمعية العامة العادية لا يحمل المحتملين 12 المكونة للدم. وهكذا، العزلة الناجحة ليرة سورية عن طريق تلطيخ هويشت في كل من يس وAGM يضمن أن الخلايا ستحفظ من حجرة للدم الخلايا الجذعية من نسيج معين، ولاحق تلوين الأجسام المضادة للخلايا داخل هذا الجزء سوف تسمح التمييز من مكون للدم (FLK -1 + / ج كيت + / CD45-) مقابل HSPC (Flk1- / ج طقم + / CD45 +) السكان 5،11،12. وعلاوة على ذلك، فقد كان سابقا لاحظت أن CD41 + الخلايا داخل SP من الكيس المحي والأنسجة اجتماع الجمعية العامة العادية قادرة على تشكيل مستعمرة متعددة النسب في ميثيل ثقافة تقوم 11،12. نحدد الخلايا البطانية مكون للدم كما Flk1 + ج كيت + خلية CD45- SPالصورة باستخدام CD45 كعلامة المعينة من النسب المكونة للدم وليس CD41 نظرا لدينا العثور على هذا التعبير من Flk1 وCD45 يكاد يستبعد بعضها بعضا 5،11. هذا يسمح للعزلة نقية من الخلايا داخل SP أن يكون كل من البطانية (FLK-1) ووقف الخصائص (ج كيت) اللازمة لالبطانية إلى الانتقال للدم ولكن التي لم تخضع بعد هذا التغيير، على النحو الذي يحدده غياب CD45 في هذه الخلايا. سيكون من المفيد النظر في تجزئة الفرعية من السكان HSPC، الذي يعرف باسم خلايا FLK-1- / ج كيت + / CD45 + / ليرة سورية، في Csf1r + (بلعم الأنسجة) وCsf1r- (شهادة الثانوية العامة) جزء كما ذكرت مؤخرا جوميز والزملاء 25، وهذا من شأنه أن يوفر دقة أكبر من HSPC الحقيقية مقابل السكان بلعم الأنسجة السلف، ولكن هذا لا ينبغي أن تؤثر على سلامة مكون للدم جزء الخلايا البطانية التي ذكرناها منذ Csf1r العزلة هو علامة من الأسلاف بلعم 26.

Hemogشبكة naric الخلايا البطانية هي جزء من السكان نادر في كل من يس واجتماع الجمعية العامة العادية (التي تضم 1-3٪ من الخلايا البطانية)، وبالتالي يشكل تحديا كبيرا في دراستهم غير كاف العائد خلية للتطبيقات اللاحقة. هذا البروتوكول النتائج عادة في 70-80٪ من الخلايا المتبقية قابلة للتطبيق في الوقت الفرز، ومكون للدم نوع الخلايا البطانية نموذجية من الأنسجة المجمعة تم الحصول عليها من الأجنة المتعددة قد تسفر سوى بضع مئات من الخلايا حتى في ظل الظروف المثلى مع فقط 10-20٪ من استرداد خلايا جزءا لا يتجزأ في إنتاج ميثيل المستعمرات. لتحقيق أقصى قدر من عدد الخلايا التي تم فرزها، فمن المستحسن أن المحققين تتخذ خطوات لضمان الأنسجة وبقاء الخلية في جميع أنحاء كل خطوة من خطوات الإجراء: الأنسجة يجب أن تشريح بسرعة وتجميع، ويجب أن تبقى عينات على الجليد كلما أمكن ذلك. وينبغي إعداد العينات الطازجة مباشرة قبل FACS الفرز، وفرزها في أنابيب جمع تحتوي على محتوى الدم المرتفع، أو مباشرة إلى ثقافة ميثيل وصفهد أعلاه. إذا استمرت المشاكل جدوى، أنابيب جمع ويمكن أيضا أن يكون ما قبل المغلفة مع المصل لتعزيز بقاء الخلية فرزها. إذا يبقى مكون للدم العائد الخلايا البطانية منخفضة، ونخاع العظام الكبار أو الخرز fluorophore مترافق المتاحة تجاريا يمكن أن تستخدم لتعويض الطيفي بدلا من الضوابط لون واحد المشتقة من الأنسجة الجنينية الموصوفة هنا. فإذا ما كان القصد خلايا فرز للثقافة، يجب أن يتم فرز الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC مباشرة في الآبار زراعة الأنسجة. فإذا ما كان القصد خلايا فرز الحمض النووي أو تحليل التعبير الجيني المتعلقة RNA، والخلايا البطانية مكون للدم وغير مكون للدم وHSPC قد يتم فرزها مباشرة إلى أنابيب جمع تحتوي على عينة العازلة تحلل للحد من فقدان الخلية.

وتسمح هذه التقنية المبينة العزلة الناجحة (وفي وقت واحد) من الخلايا البطانية مكون للدم وغير مكون للدم، وكذلك HSPC وخلايا الدم الناضجة كسور من نفس الأنسجة الجنينية. هذا النهج يتيح مزيدا من عشيقذ من الأسس الجزيئية للالتحولات الهامة التي تحدث في الخلايا البطانية تولد الدم. ويمكن بعد ذلك الخبرات المكتسبة من هذه الدراسات التنموية أن تستخدم لتحسين توليد الخلايا البطانية مكون للدم الإنسان وHSPC ذرية من المحفزة، ويحتمل أن تكون ذاتي، الخلايا الجذعية لعلاج اضطرابات المكونة للدم السائدة.

Disclosures

وأيد هذا العمل byNIH منح HL128064 والابتكارات HL096360، EB017103، والتصوير المقطعي تمنح 15 يوان ييل-04، لKKH، ومعاهد الصحة القومية / المعاهد الوطنية للصحة T32HD007094.

Acknowledgments

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) Sigma D5942 TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling.
Absorbent bench underpad Covidien 7134
#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein  50033 TOXIC inhalant: Use in fume hood.
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine)  Invitrogen 10378016
Type II Collagenase Worthington LS004174
Falcon 70 μM nylon cell strainer Corning CLS431751
Anti-Mouse CD45-FITC eBioscience 11-0451-81
Anti-Mouse CD31 - PE eBioscience 12-0311-81
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 BD Pharmingen 561259
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) Sigma 14533 TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H2O, store aliquots at -20 °C until ready for use.
Verapamil Hydrochloride Sigma 1711202  TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling.   Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol.  Store at -20 °C until ready for use 
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
MethoCult GF M3434 Stem Cell Technologies 3434 Thaw and aliquot per manufacturer's instructions
Modified Giemsa Stain Sigma GS500 TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution.
Cytospin Centrifuge Thermo Scientific A78300003
Clipped Funnel Starter Kit Thermo Scientific 3120110 Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge
Anti-Mouse B-220 - FITC BD Pharmingen 553088
Anti-Mouse Gr-1-FITC eBioscience 11-5931-85
Anti-Mouse Ter-119-FITC eBioscience 11-5921-85
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Scientific 10437-077
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L) Life Technologies  11965-092
Hank's Buffered Salt Solution Life Technologies  14175-095
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate EMD Millipore PIFB24P05
IgG2A-PE BD Pharmingen 553930
IgG2B-FITC BD Pharmingen 556923

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschi, K. K. Hemogenic endothelium during development and beyond. Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).
  2. Boisset, J. C., et al. et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).
  5. Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development. Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).
  6. Nakano, H., et al. Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis. Nat Commun. 4, 1564 (2013).
  7. Li, Z., et al. Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).
  8. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  9. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  10. de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo. Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).
  11. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  12. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  13. Tavian, M., et al. Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood. 87 (1), 67-72 (1996).
  14. Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).
  15. Kelly, M. A., Hirschi, K. K. Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).
  16. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  17. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  18. Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), (2010).
  19. Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation. Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).
  20. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  21. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  22. Kina, T., et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage. British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).
  23. Jackson, K. A., et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).
  24. Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
  25. Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  26. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 112، البطانة مكون للدم، تكون الدم نهائيا، وتطوير الأوعية الدموية، وأجنة الفئران، نظام مراقبة الأصول الميدانية، المكونة للدم الجذعية والسلف الخلايا
عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, J. S., Gritz, E. C., Marcelo,… More

Fang, J. S., Gritz, E. C., Marcelo, K. L., Hirschi, K. K. Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (112), e54150, doi:10.3791/54150 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter