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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/54150
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Departments of Medicine, Genetics and Biomedical Engineering, Yale Cardiovascular Research Center, Vascular Biology and Therapeutics Program, Yale Stem Cell Center, Yale University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) derivano da (hemogenic) cellule endoteliali specializzate durante lo sviluppo, ma poco si sa circa il processo attraverso il quale alcune cellule endoteliali specificano a diventare la formazione del sangue. Dimostriamo un metodo basato citometria a flusso che permette l'isolamento simultaneo di cellule endoteliali hemogenic e HSPC da tessuti embrionali murine.

Abstract

La specifica delle cellule endoteliali hemogenic da endotelio vascolare embrionale si verifica durante brevi periodi di sviluppo all'interno dei tessuti distinti, ed è necessario per la comparsa di definitiva HSPC dal murino sac in più embrionale vitellino, placenta, vasi ombelicali, e le embrionali aorta-gonade-mesonefro ( AGM) regione. La natura transitoria e piccola dimensione di questa popolazione cellulare rende il suo isolamento riproducibile per un'attenta quantificazione e applicazioni sperimentali tecnicamente difficile. Abbiamo stabilito una cella a fluorescenza-attivato (FACS), il protocollo per l'isolamento basata su simultanea di cellule endoteliali hemogenic e HSPC durante le loro ore di punta generazione nel sacco vitellino e AGM. Dimostriamo metodi per la dissezione del sacco vitellino e AGM tessuti da embrioni di topo, e vi presentiamo le condizioni di digestione dei tessuti e degli anticorpi Coniugazione ottimizzate per la sopravvivenza delle cellule massima prima di identificazione e il recupero tramite FACS. Rappresentante FACS anatrame di lisi sono mostrati che identificano il cellule endoteliali hemogenic e fenotipi HSPC, e descrivono un test a base di metilcellulosa per valutare il loro sangue potenziale formando a livello clonale.

Introduction

Un sistema circolatorio funzionale richiede lo sviluppo parallelo di vasi sanguigni e cellule del sangue. Nelle prime fasi di sviluppo del sangue (emopoiesi primitivo), l'origine di eritroblasti rimane vigorosamente dibattuto 1. Al contrario, nelle fasi successive di sviluppo delle cellule del sangue (emopoiesi definitiva), è diventato sempre più chiaro che il multi-lignaggio HSPC derivano da cellule specializzate vascolari endoteliali che acquisiscono la formazione di sangue potenziali (cellule endoteliali hemogenic) all'interno del sacco vitellino, placenta, e AGM 2-5, così come nel vitellina e vasi ombelicali, l'endocardio embrionali 6, e la testa vascolare 7. La specifica delle cellule endoteliali hemogenic all'interno di questi tessuti distinti avviene a fasi specifiche di sviluppo; per esempio, all'interno del sacco vitellino a ~ E8.25 e all'interno del AGM in ~ E10 8-12. Tuttavia, anche in queste specifiche finestre di sviluppo, la popolazione di endo hemogeniccellule thelial rappresenta una piccola frazione di tutte le cellule endoteliali (1 - 3% del sacco vitellino e cellule endoteliali AGM) 11,12. Il processo di "specificazione" hemogenic cellule endoteliali è fondamentale per murina, così come umana, emopoiesi. Cellule ematopoietiche hanno dimostrato di germogliare dalla endotelio dei vasi sac tuorlo e l'aorta in embrioni umani 13, e diversi laboratori hanno dimostrato che la produzione delle cellule del sangue da cellule staminali pluripotenti umane richiede un cellule endoteliali intermedio 14-16. Così, definendo il fenotipo delle cellule endoteliali hemogenic murine e comprendere gli eventi molecolari che portano al loro sviluppo in questo modello animale dovrebbero facilitare ricerca di tecnologie in vitro per la generazione di cellule endoteliali hemogenic da cellule staminali pluripotenti umane. A sua volta, l'eventuale sviluppo di un approccio per la generazione su larga scala di tipi di cellule del sangue differenziate da multi-lignaggio HSPC - si derived da cellule staminali pluripotenti umane attraverso un fisiologicamente rilevanti di cellule endoteliali hemogenic intermedio - avrebbe potenziale terapeutico incredibile per ematologiche, oncologiche e la medicina rigenerativa. Verso questo obiettivo, abbiamo definito il fenotipo delle cellule endoteliali hemogenic, a livello clonale, entro il tuorlo murino sac 11 e 12 AGM, due principali siti di produzione HSPC definitiva durante l'embriogenesi. Come HSPC all'interno del midollo osseo adulto 17, embrionali e cellule endoteliali hemogenic HSPC mostra Hoechst proprietà colorante di efflusso e quindi apparire all'interno della "popolazione lato" (SP) di cellule su un terreno FACS 5,11,12 (come mostrato in Figura 3). Inoltre, abbiamo anche dimostrato che le cellule endoteliali hemogenic esprimono i marcatori di entrambi endoteliali e cellule staminali (rispettivamente Flk1 e CKIT,), ma non esprimono il marcatore lignaggio ematopoietico, CD45 5,11,12. Così, le cellule endoteliali hemogenic possono essere identified e isolati da FACS come cellule Flk1 + / CKIT + / CD45- SP, e ci hanno mostrato che queste cellule danno origine a HSPC contenuta all'interno della / CKIT + / CD45 + SP frazione Flk1- del sacco vitellino e cellule AGM 5,11,12. Cellule endoteliali Hemogenic e HSPC possono essere identificati e isolati dal sacco vitellino o tessuti AGM raccolte sia da embrioni appena eutanasia, o da embrioni in coltura per un massimo di 48 ore in ex vivo della cultura dell'embrione (come illustrato nella Figura 1). Ex vivo cultura permette selettivo pre-trattamento dei singoli embrioni con agenti farmacologici, e consente anche per l'espressione transiente dei transgeni desiderati (cioè, di trasduzione lentivirale). individuazione FACS di cellule endoteliali hemogenic e HSPC con il metodo qui descritto può essere usato come una misura quantitativa di sviluppo ematopoietiche definitiva in modelli murini geneticamente manipolati; le cellule possono anche essere recuperati per le successive applicazioni sperimentali, compreso il sangue-FOsaggi rming, analisi di espressione, e il trapianto.

Soggetti ANIMAL: Usi e considerazioni etiche

Un corpo crescente di letteratura ha stabilito l'importante contributo delle cellule endoteliali hemogenic alla formazione HSPC durante la fase di ematopoiesi definitivo dello sviluppo embrionale. Tuttavia, le condizioni fisiologiche e segnali che promuovono specifica di una sottopopolazione di cellule endoteliali verso un destino hemogenic ancora non completamente chiaro, e quindi non possono ancora essere simulati in un ambiente in vitro. Infatti, le tecniche descritte in questo documento sono attualmente in uso dal nostro laboratorio e altri gruppi per migliorare la comprensione del campo dello sviluppo hematovascular, tale che possa essere sviluppato un metodo per ex vivo specifica delle cellule endoteliali hemogenic e produzione HSPC un giorno. Fino al momento, tuttavia, il campo dipende di tessuti primari da wild-type (e genecamente modificati) embrioni di topo per ottenere specificati cellule endoteliali hemogenic e HSPC per ulteriori studi. Cellule endoteliali Hemogenic e HSPC possono essere identificate in modo attendibile isolati sia da E8.5 (10 - 12 paia somite) sacco vitellino o E10.5 (35 - 40 coppie di somite) AGM 11,12. A causa della relativa scarsità di cellule endoteliali hemogenic (in genere pari all'1 - 3% del totale delle cellule endoteliali 11,12 all'interno di questi tessuti) la messa in comune dei tessuti da multipla (~ 8 - 10) fratellini in un singolo campione è fortemente raccomandato al fine di ottenere cellule sufficienti per la successiva sperimentazione. Verifica che le cellule endoteliali hemogenic e HSPC sono stati identificati e isolati successo può essere realizzato da colture di cellule recuperate in condizioni che inducono la differenziazione ematopoietiche. In queste condizioni, le cellule endoteliali hemogenic e HSPC esporranno multi-lignaggio differenziazione ematopoietiche, con conseguente comparsa di colonie contenenti Eryprogenitori throid (BFU-E), granulociti e macrofagi progenitori (CFU-GM) e granulociti, eritrociti, macrofagi, le colonie dei megacariociti progenitrici (CFU-GEMM).

Protocol

Etica Dichiarazione: Il protocollo descritto di seguito è stato rivisto da, ed è in conformità con le linee guida del, Institutional Animal Care di Yale University e del Comitato Usa.

1. Tutta la Embrione Ex V Ivo cultura per il sacco vitellino Studies (opzionale)

  1. Euthanize dighe in gravidanza a E7.0 - E7.5, e rimuovere le corna uterine in condizioni sterili, come descritto più dettagliatamente in seguito (passi 2,4-2,7).
  2. Separare gli embrioni interi (con sacco vitellino intatto 12) da decidua circostante, e la sospensione in 50 ml di siero intero ratto in 50 ml provette di polistirene.
  3. Bottiglie embrione gas per 3 minuti con 5% di CO 2 immediatamente come precedentemente descritto 12,18. Ripetere questo passaggio a 24 ore se la coltura di embrioni per 24 - 48 ore.
  4. Incubare a rotolamento cultura 37 ° C per un massimo di 48 ore.
    Nota: Gli embrioni possono essere trattate ex vivo con agenti farmacologici (per esempio, inibitore Notch DAP.T 12) o solubili proteine ​​(cioè, fibronectina 19) mediante la pre-incubazione di embrioni per un massimo di 2 ore in terreno di coltura contenenti tali fattori, o mediante aggiunta di tali elementi al mezzo di coltura di laminazione per tutta la lunghezza della coltura ex vivo periodo. L'espressione genica può essere manipolata in embrioni di pre-incubazione di embrioni con lentivirus in modo ottimale titolato per 2 ore 12. Tuorlo vascolare sac e sviluppo ematopoietiche possono essere monitorati in tempo reale utilizzando topi reporter transgenici e le tecniche di imaging ottico.

2. La dissezione di tuorlo d'Sac (YS) o Aorta-gonade-mesonefro (AGM) da embrioni di topo

  1. Sterilizzare banco di laboratorio a spruzzo e pulire tutte le superfici con il 70% di etanolo per ridurre la contaminazione nelle successive colture cellulari. Inserire un underpad assorbente sulla superficie banco di laboratorio.
  2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici con il 70% di etanolo. strumenti chirurgici consigliati sono due # 5 vigore drittops, e uno forbici 8,5 cm rette.
  3. Se si lavora con embrioni da ex vivo cultura, rimuovere con attenzione gli embrioni interi da 50 ml tubi Falcon e procedere immediatamente al punto 2.8. In caso contrario, saltare questo passaggio e passare al punto 2.4.
  4. Euthanize diga incinta a appropriata all'età embrionali (E8.5 se YS di raccolta; E10.5 se la raccolta AGM).
    Nota: La tecnica descritta impiega un approccio di eutanasia dual-metodo - dose letale di un anestetico volatile seguita da dislocazione cervicale meccanico - per ridurre al minimo il dolore degli animali e angoscia, e per garantire la cessazione minimamente invasiva e umano dei soggetti animali. Questa tecnica combinata per piccoli roditori l'eutanasia è raccomandato dalla American Veterinary Medical Association se effettuata da un investigatore esperto e competente (Linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali: edizione 2013).
    1. Anestetizzare mouse utilizzando una dose letale di isoflurano (> 5% in O 2) per 3-5 min. (CautiON: Isoflurane è un inalante tossica; usare sotto una cappa con dispositivi di protezione adeguati respiratoria.)
    2. Dopo l'esposizione di topi a isoflurano, controllare almeno tre segni di livello anestetico - perdita del riflesso di raddrizzamento, perdita di punta pizzico reflex, e riduzione della frequenza respiratoria - per garantire i soggetti hanno raggiunto un piano anestetico profondo prima di procedere con l'eutanasia meccanico.
    3. Cervicale dislocate diga di indurre rapidamente la morte.
  5. Posizionare eutanasia supina diga sul underpad e liberamente spruzzare basso addome con il 70% di etanolo.
  6. Fare un'incisione verticale lungo la linea mediana della parete addominale inferiore. Apportare ulteriori ~ incisioni orizzontali 1 pollice che si estende a destra ea sinistra dal punto medio della incisione verticale, e sezionare via la parete addominale per esporre completamente a destra ea sinistra corna uterine ciascuno contenente più embrioni gestazione.
  7. Utilizzando pinze, tenere premuto uno dei due corna uterinee usare le forbici per separarlo dal mesometrio. Mettere utero sezionato su ghiaccio in soluzione salina bilanciata sterile di Hank (HBSS) in una piastra di coltura tissutale polistirolo 60mm. Ripetere l'operazione per altro corno uterino.
  8. Sotto un microscopio ottico dissezione di serie, usare il forcipe per tirare via strato muscolare dell'utero sac per rivelare il sacco gestazionale sottostante e decidua. Isolare YS (Figura 2A) rimuovendo delicatamente la sacca dall'embrione chiusa. Rimuovere il tessuto YS dall'embrione adeguata alla origine embrionale dei vasi vitellina.
  9. Per isolare il AGM, rimuovere il YS e transetto l'embrione di sotto del livello del cuore e arti anteriori e scartare la regione torace e testa. Successivamente, transetto l'embrione appena sotto il livello delle arti posteriori e rimuovere ed eliminare il tessuto coda. Rimuovere le zampe posteriori e tessuto ventrale eccesso dal restante sezione, che contiene l'AGM (Figura 2B).
  10. Pool YS o AGM tessuti da embrioni multipli e negoziosul ghiaccio in HBSS + (HBSS supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 0,3 mg / ml di L-glutammina) in una provetta pulita da 1,5 ml.

3. La digestione del tessuto primario in una cella singola sospensione

  1. provetta contenente YS raccolte o tessuti AGM per 5 min a 2000 xg a 4 ° C.
  2. Rimuovere il surnatante e tessuti risospendere in 1 ml o 0,05% (per YS) o 0,2% (per AGM) collagenasi di tipo II diluita in HBSS +. Incubare per 30 minuti in bagno d'acqua a 37 ° C, invertendo il tubo ogni 5 minuti per mescolare.
  3. Delicatamente dissociarsi meccanicamente il tessuto passando campione di 10 volte attraverso una pipetta P1000. Se avere difficoltà aspirazione dei tessuti parzialmente digerito, pipetta foro punta può essere ampliato tagliando ~ 5 mm punta con un paio di forbici.
  4. Campione Centrifugare per 5 minuti a 2.000 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 ml ghiacciata HBSS +.
  5. Passare campione attraverso un 70 &# 956; colino cella m.
  6. Contare le cellule utilizzando un emocitometro manuale o automatica.
  7. Campione Centrifugare per 5 minuti a 2.000 xg a 4 ° C. campione Risospendere in DMEM + (4,5 g / L di glucosio Dulbecco Modified Eagle Medium supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 0,3 mg / ml di L-glutammina) pre- riscaldato a 37 ° C tale che le cellule sono ad una concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule / ml.

4. trattamento delle cellule con Nucleic Acid Dye e di etichettatura con fluorescente coniugati anticorpi

  1. Aliquota di almeno 100 ml di campione (1 x 10 5 cellule) in nuove provette da 1,5 ml per l'incubazione degli anticorpi.
  2. Includere il seguente campione e provette di controllo necessarie: senza macchia; solo CKIT-APC; solo CD45-FITC; solo CD31-PE; solo Flk1-PECy7; Hoechst 33342 solo; Hoechst 33342 solo + Verapamil; Esempio (riceve tutti i colori, non riceverà Verapamil). Utilizzare un minimo di 1 x 10 Nota: Un volume maggiore di cellule può essere aggiunto alla provetta campione alla stessa concentrazione di massimizzare il rendimento del filtrate Hemogenic CE e HSPC.
  3. Aggiungere Verapamil diluito in etanolo al 95% (vedi la discussione per logica) al "Hoechst 33342 solo + Verapamil" tubo di controllo ad una concentrazione finale di 50 micron. Incubare tutte le provette per 5 minuti a 37 ° C. (ATTENZIONE: Verapamil è un potente agente bloccante dei canali del calcio ed è estremamente tossica Maneggiare con guanti.).
  4. Aggiungere Hoechst 33342 al "Hoechst 33342 solo" controllo, all'unica + Verapamil controllo Hoechst 33342, e al tubo "campione" per una concentrazione finale di 5 mg / ml. Incubare tutte le provette per 1 ora a 37 ° C, al riparo dalla luce. Mescolare delicatamente capovolgendo ogni 15 min. (ATTENZIONE: Hoechst 33342 è un colorante nucleare tossico e deve essere maneggiato con i guanti).
  5. Centrifuga tutto SAMPles per 5 minuti a 2.000 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare ad una concentrazione di 1 x 10 5 cellule / ml in HBSS freddo +.
  6. Aggiungere anticorpi coniugati fluorescenza ad opportuni tubi di controllo anticorpi sola, e al tubo "campione" per una concentrazione finale di 2 mg / ml. Incubare in ghiaccio per 30 minuti, al riparo dalla luce.
  7. Centrifugare tutte le provette per 5 min a 2000 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in 500 microlitri ghiacciata HBSS. campioni di filtrare attraverso maglie tappo del filtro di 5 ml a fondo tondo tubi in polistirolo FACS e memorizzare sul ghiaccio, al riparo dalla luce, per FACS immediati.

5. identificazione e l'isolamento delle cellule endoteliali e Hemogenic HSPC da FACS

Nota: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando un sistema BD FACSAria 5-laser dotato di 100 MW 355 nm laser UV, un 200 MW 405 nm laser viola, un 200 MW 488 nm laser blu, una da 200 MW a 532 nm laser verde, e un 150 mw 637 nm Rossolaser. Le cellule sono state filtrate in PBS sterile come fluido di trasporto e in condizioni asettiche, e attraverso un ugello 100 micron con portata impostata ad una pressione campione di 1 tale che un massimo di 1.500 - sono acquisiti 2.000 eventi al secondo per minimizzare lo stress cellulare.

  1. In queste impostazioni sopra descritte, utilizzare tubi di controllo del colore "non colorati" e singole per ottimizzare FACS cell sorter intensità laser ed eseguire il controllo di compensazione spettrali multi-colore in base alle istruzioni del produttore. Utilizzare in avanti e scatter lato per eseguire delle cellule dal vivo e doublet discriminazione da eventi totali (vedi le istruzioni del produttore per maggiori dettagli).
    Nota: Questo protocollo si traduce tipicamente in ~ 70 - 80% di cellule vitali. Se i problemi si incontrano con bassa vitalità cellulare, garantire che i tessuti sono inizialmente sezionati rapidamente in ghiaccio mezzi fredda, e che tutti i passaggi tranne quelle che specificano tuttavia vengono effettuate su ghiaccio, con blanda pipettaggio per minimizzare tranciatura e morte cellulare(Vedi la discussione per maggiori dettagli sulla conservazione vitalità cellulare).
  2. Utilizzare una trama differenziale lineare scala di Hoechst Red vs. Hoechst blu fluorescenza per identificare la popolazione lato (SP) eventi (Figura 3A). Utilizzare il controllo "Hoechst 33342 solo + Verapamil" come controllo negativo per verificare che le porte siano opportunamente elaborate per il campione. SP apparirà come una spalla sinistra delle cellule non-SP, e verrà ridotto nel controllo Verapamil-trattata. La popolazione non-SP sarà utilizzato per identificare non hemogenic CE (Figura 3B).
  3. Creare ulteriori trame differenziale di fluorescenza (assi di log-scala) e disegnare cancelli figlia della SP per identificare le cellule endoteliali hemogenic (Figura 3C-E).
    Nota: le cellule endoteliali Hemogenic sono profilate come cellule Flk1 + / CKIT + / CD45- SP (Figura 3D), e HSPC sono Flk1- / CKIT + / CD45 + cellule SP (Figura 3E). Hemogenic endoteliale cells possono essere analizzati in parallelo con le cellule endoteliali non hemogenic, che sono identificate in questo approccio le cellule non-SP CD31 + / CD45- (Figura 3B).
  4. Recupero delle cellule endoteliali hemogenic o frazione HSPC su metilcellulosa contenente le piastre per la cultura ematopoietiche (vedi sotto), o in altri buffer per la successiva elaborazione e analisi.

6. emopoietiche differenziazione nella cultura

  1. Aggiungere 0,5 ml (135 ml / cm 2) metilcellulosa basato ematopoietiche cultura media per numero desiderato di pozzetti di una piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti a temperatura ambiente. Aggiungere 0,5 ml di acqua sterile nella pozzetti non utilizzati per ridurre al minimo l'evaporazione. Preparare aperta e mantenerlo a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
  2. Ordina 1 - 10 cellule per l'analisi clonale, o fino a 1.000 cellule endoteliali hemogenic (Flk1 + / CKIT + / cellule CD45- SP) o HSPC (cellule Flk1- / CKIT + / CD45 + SP) per l'espansione della massa e la differenziazione direttamente in ciascun pozzetto dellapiatto contenente metilcellulosa. formazione di colonie viene rilevato in circa il 10 - 20%.
  3. In una cappa coltura di tessuti sterili, utilizzare una punta P1000 con la punta tagliata di ampliare il suo foro, per risospendere delicatamente ogni pozzetto dei media metilcellulosa teste di serie 2 - 3 volte, avendo cura di evitare la creazione di bolle. Questo assicura sospensione delle cellule ordinati in metilcellulosa semisolido per la crescita ottimale.
  4. Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 settimane.
  5. Monitorare colture cellulari singoli per la formazione di colonie di cellule ematopoietiche differenziate nel tempo (Figura 4). Punteggio pozzi per numero e tipo di colonie ematopoietiche differenziati nei giorni 1, 3, 7, e 14 con il metodo (s) indicato di seguito al punto 6.7.
    1. piastre punteggio giorno 1 per confermare confluenza e continua vitalità delle cellule ordinati.
    2. Di giorno 3, controllare la prima formazione di colonie di cellule endoteliali hemogenic aderenti con "ciottolitono "morfologia (vedi Goldie et al. 11 e Marcelo et al. 12 per la rappresentazione del giorno 3 morfologia).
    3. In giorni 5 - 7, verificare la presenza di formazione di cluster HSPC arrotondati in pozzetti contenenti ordinato hemogenic CE. HSPC occorre osservare adiacente al appiattito hemogenic CE visualizzazione di una morfologia delle cellule endoteliali "ciottoli".
      Nota: le cellule endoteliali Hemogenic dovrebbero formare colonie ematopoietiche (determinati dal numero di colonie ematopoietiche), e devono dimostrare la capacità di differenziazione multi-lignaggio (determinata dalla osservazione di diversi tipi di colonie da una singola cellula). Abbiamo già osservato che ~ 20% di hemogenic CE o HSPC recuperato da FACS sopravvivere per formare la differenziazione e la proliferazione di colonie ematopoietiche in metilcellulosa 11.
  6. Per valutare la formazione di colonie al microscopio fase:
    1. Visualizzare e contare le colonie a basso ingrandimento under un microscopio ottico di fase, e identificare BFU-E, CFU-GM e CFU-GEMM colonie dalla morfologia delle colonie, come descritto da Goldie et al. 11.
  7. Per valutare la formazione di colonie dalla morfologia delle cellule:
    1. Aspirare singole colonie dalla superficie metilcellulosa in una punta P1000 con l'estremità tagliata per allargare il foro. Questo facilita l'aspirazione del mezzo metilcellulosa viscoso e garantisce il prelievo successo della colonia.
    2. Risospendere raccolse colonie in 200 ml HBSS e girare su un vetrino utilizzando un citocentrifuga a 28 g per 5 min.
    3. Fissare i vetrini in metanolo 100% per 5 min (ATTENZIONE: Il metanolo è tossico e deve essere utilizzato solo in una cappa chimica con ventilazione appropriata e dispositivi di protezione individuale).
    4. Immergere i vetrini in 0,04% Giemsa per 20 min (ATTENZIONE:. Giemsa contiene metanolo Utilizzare in una cappa chimica con ventilazione e persona appropriataAl dispositivi di protezione).
    5. Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata.
    6. Montare i vetrini con vetrini, e l'immagine ad alto ingrandimento al microscopio ottico normale, paragonando la morfologia delle cellule a quello classicamente osservato in cellule ematopoietiche da midollo osseo adulto che sono coltivate in mezzi metilcellulosa. Per esempi, consultare le istruzioni del produttore.
  8. Per valutare la formazione di colonie da parte delle cellule espressione di marcatori lignaggio ematopoietiche da FACS:
    1. Aggiungere 2 ml di HBSS a ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti contenenti le colonie coltivate su 0,5 ml metilcellulosa (cioè, diluire disponibile in commercio magazzino metilcellulosa 1: 4). Pipetta su e giù per mescolare, e trasferimento in provetta (s).
    2. campione Centrifugare a 2.000 xg per 5 minuti a 4 ° C utilizzando un tavolo microcentrifuga standard.
    3. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare (s) in 1 ml HBSS +, mettendo in comune i campioni se lo si desidera.
    4. Centrifucampione ge a 2.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare (s) in 400 microlitri HBSS +.
    6. parte aliquota in quattro provette da 1,5 ml come segue: senza macchia; solo B220-FITC; GR-1-FITC solo; Ter119-FITC solo.
    7. Aggiungere anticorpo fluorescente coniugato nella provetta appropriata per una concentrazione finale di 2 mg / ml. Incubare a 37 ° C per 15 min.
    8. campione Centrifugare a 2.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in ghiacciata 0,5 ml HBSS.
    9. Analizzare ogni campione da FACS per l'espressione di ogni marcatore lignaggio ematopoietico: B220 segna cellule B 20; GR-1 segni di cellule mieloidi 21; Ter119 segna cellule eritroidi 22.
      Nota: ulteriori anticorpi mirati altri marcatori ematopoietiche lignaggio possono essere incorporati in questo approccio, se lo si desidera.

Representative Results

Etichettatura di successo delle cellule endoteliali hemogenic e HSPC da YS embrionali o AGM consentiranno di ottenere FACS grafici a dispersione simili alle trame rappresentativi presentati nella figura 3. A seguito di cellule vive di serie e la discriminazione doppietto da in avanti e scatter laterale (non mostrato), la popolazione lato (SP) eventi vengono visualizzati in una Hoechst Red vs. Hoechst blu trama differenziale lineare in assenza di Verapamil come "spalla" sinistro spostato dalla maggior parte degli eventi (non SP) (Figura 3A). Quando il cancello SP è redatto correttamente, le cellule SP rappresenteranno circa il 1-3% delle cellule totali vitali YS e 3-5% del totale eventi AGM vitali. Trattamento Verapamil dovrebbe comportare> 50% di inibizione di eventi SP prescindere dalla fonte tissutale (Figura 3A, pannelli superiori). Abbiamo già stabilito che altre popolazioni che appaiono al di fuori della spalla SP, ma sono anche bloccati da verapamil sono erythr Ter119-positivioblast, e sono quindi esclusi dalla nostra popolazione SP 5.

Rispetto alla SP, cellule non-SP sono identificati come denso gruppo di celle adiacenti sulla SP "spalla" (Figura 3A). Questa popolazione contiene non Hemogenic CE che può essere distinto con un CD31-PE contro CD45-FITC figlia plot (Figura 3B), come CD31 + / CD45- eventi. Non Hemogenic CE sono tipicamente 2 - 5% di cellule non-SP da AGM (Figura 3B) o sacco vitellino (non mostrato), e un numero elevato di queste cellule possono essere filtrate indietro con relativa facilità.

Per l'identificazione di HSPC e Hemogenic CE, porte figlia sono tratte dalla frazione SP, individuando le cellule CD45 + e CD45-, dove le cellule CD45 + sono in genere <20% degli eventi totali in entrambi AGM (Figura 3C) o YS (non mostrato). Hemogenic CE sono successivamente identificato dalle cellule CD45- in un differenziale di CKIT-APC vs Flk1-PECy7 figlia plot come eventi doppio positive, e tipicamente rappresentano 1 - 3% di eventi CD45- quando isolato da entrambi AGM (Figura 3 D) o YS (non mostrato). HSPC sono identificati dalla frazione CD45 + in un separato CKIT-APC vs Flk1-PECy7 trama figlia / CKIT cellule Flk1- +, e inoltre in genere rappresentano circa il 25 - 30% della piccola popolazione di cellule CD45 +, quando ottenuti da entrambi YS (non mostrato) oppure AGM (Figura 3 e). Così, sia Hemogenic CE e HSPC sono eccezionalmente rari (~ 0,01% degli eventi cellulari totali), ed è tipico per questo protocollo per tornare a poche centinaia di ogni tipo di cellula, anche quando il tessuto da più embrioni vengono mantenuti. Gates in trame figlia dovrebbero essere stabiliti con riferimento ai gruppi di controllo negativo. Al fine di distinguere tra specifica e non specifica colorazione anticorpale, porte fossero inizialmente disegnate in riferimento ad entrambi i controlli non colorati (Figura 3C), così come campioni che sono stati trattati con anticorpi di controllo fluorescenza coniugati isotipo-abbinato (IgG2a o IgG2b) (non mostrato). Quest'ultimo controllo ha dimostrato che la colorazione non specifica è minima da questo protocollo, quindi, mentre si consiglia di anticorpi di controllo isotipo-abbinato (ad es., IgG2a-PE o IgG2b-FITC) essere inizialmente utilizzato per ottimizzare le impostazioni di smistamento FACS e determinare i confini del cancello , troviamo anche che i controlli non colorati sono sufficienti per verificare i confini del cancello e la qualità sperimentale durante FACS di routine di smistamento. Se cancelli sono correttamente disegnate, minima dispersione positiva dovrebbe essere osservata in porte singolo o doppio positivo quando si registra da controlli non colorati o isotipo-abbinato.

Cellule endoteliali Hemogenic dal AGM e HSPC subiscono differenziazione ematopoietiche oltre 14 giorni di coltura in metilcellulosa (Figura 4A). La proporzione relativa dei tipi colonie tipicamente osservata in questiculture dipende da fonte tissutale. Cellule endoteliali Hemogenic isolate da tessuti sacco vitellino a E8.5-E9.5 portano ad un BFU-E, CFU-GM, e pochi CFU-GEMM 5, mentre le cellule endoteliali hemogenic isolate dal E10.5 AGM danno origine alle prevalentemente CFU -GEMM 12, anche se si osservano ancora altre linee, come mostrato nella Figura 4B (pannello superiore sinistro). HSPC isolato da E10.5 AGM anche dar luogo prevalentemente a CFU-GEMM sulla cultura in metilcellulosa (Figura 4B, alto pannello centrale), anche se queste cellule potranno anche differenziarsi in altri tipi ematopoietiche colonie pure. Cellule endoteliali non hemogenic (CD31 + / CD45- non-SP) sono stati placcati (Figura 4B, pannello in alto a destra). Queste cellule mostrano alcuna crescita in coltura ematopoietiche dopo 14 giorni.

I dosaggi di capacità ematopoietiche del marcatore di superficie individuale che esprimono i tipi di cellule, comprese le cellule con e senza espressione di un ematopoieticheND marcatori endoteliali CD31, Flk1, c-Kit, VE-cad, CD41, CD45 e all'interno della frazione SP del AGM in E10.5 sono stati eseguiti e dimostrare che l'attività multi-lignaggio formanti colonia nel E10.5 AGM è limitato a CD31 +, VE-caderina cellule CD41 + e CD45 + SP 12 +, c-Kit +,. È interessante notare che l'attività delle colonie formando stato osservato in entrambe le cellule FLK-1 + e FLK-1-SP, ma solo le cellule Flk1 + c-Kit + CD45- SP ha dato luogo a colonie multi-lignaggio attraverso un monostrato endoteliale intermedia caratterizzata da entrambi "ciottoli "endoteliali morfologia cellulare (Figura 4B, pannello in basso a sinistra) e Dil-AcLDL captazione 12. Inoltre, l'espressione del c-kit è necessario per l'attività delle cellule ematopoietiche AGM SP 12.

Mentre è stato dimostrato che alcuni progenitori mieloidi presentano caratteristiche morfologiche simili rispetto alle cellule endoteliali hemogenic, cellule progenitrici mieloidi esprimono CD45 e non possono generare colonie multi-lineage 12,23 e danno origine a gruppi di cellule arrotondate senza un monostrato endoteliale sottostante (Figura 4B, pannello in basso a destra). Pertanto, la popolazione definiamo endotelio come hemogenic (o, cellule Flk-1 + / c-kit + / CD45-SP) rappresentano le cellule endoteliali con sangue formando espressione potenziale e robusta gene hematoendothelial, tra GATA-1/2, LMO2, SCL / Tal-1, Runx-1, c-Kit, CD34, CD41, CD45 e 11 che sono distinti dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, così come le loro controparti delle cellule endoteliali non hemogenic.

Figura 1
Figura 1. Nel complesso flusso di lavoro. In breve, gli embrioni vengono rimossi da dighe in stato di gravidanza, e YS o tessuti AGM vengono raccolte. Gli embrioni possono facoltativamente essere coltivate per 2 4 - 48 ore ex vivo prima del raccolto dei tessuti. YS raccolte o tessuti AGM vengono digeriti a una sospensione di cellule singole, frazionato in provette di controllo e di campione, e incubate in presenza di Hoechst colorante e / o anticorpi fluorescente-coniugati. Verapamil, un inibitore dei canali del calcio, è anche usato per generare un controllo negativo essenziale per la verifica della precisione di suoni della frazione SP. cellule endoteliali Hemogenic sono identificati da FACS come Flk1 + / CKIT + / CD45- SP cellule, mentre HSPC sono contenuti all'interno della frazione Flk1- / CKIT + / CD45 + SP delle cellule; entrambi i tipi di cellule sono ordinati su metilcellulosa per la conferma del potenziale hemogenic. Inoltre, le cellule endoteliali non hemogenic possono essere discriminati (e recuperati, se lo si desidera) come cellule non-SP CD31 + / CD45-. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Dissezione di YS e AGM tessuti. A) La YS è sezionato da embrioni E8.5, e messo tutto in sterile HBSS + per la successiva digestione. B) Il tronco degli embrioni E10.5 è isolato facendo tagli orizzontali al di sotto sia dell'arto anteriore e arti posteriori gemme. L'Assemblea è quindi separato dalle gemme degli arti e pinze dei tessuti utilizzando ventrali. C) immagini in campo chiaro mostrano la dissezione dei due YS e AGM da un embrione E10.5 (scale = 1 mm). Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.

Figura 3
Figura 3. Parcelle rappresentativi Dimostrazione Porta Gerarchia per discriminazionedi Hemogenic cellule endoteliali s (Flk1 + / CKIT + / cellule CD45- SP), HSPC (Flk1- / CKIT + / cellule CD45 + SP), e le cellule endoteliali non hemogenic (CD31 + / CD45- non-SP) da FACS da E8.5 YS o E10.5 AGM. in seguito in diretta la discriminazione delle cellule e farsetto di cellule sia da YS (pannelli a sinistra) oppure AGM (pannelli di destra) di avanti e scatter laterale (non mostrato), A) la popolazione lato (SP) porta viene disegnato e verificato da una riduzione significativa della frazione SP nel controllo negativo Verapamil trattati. La popolazione non-SP è identificato come denso gruppo di celle adiacenti sulla SP. In ciascuna delle piazzole presentati sono visualizzati 20000 eventi B) non hemogenic cellule endoteliali vengono identificate come cellule CD31 + / CD45- all'interno della frazione non SP, e rappresentano 2 -. 5% di cellule non-SP sia ottenuta da AGM (mostrati ) o YS (non mostrato). per discriminate Hemogenic CE o HSPC, C) porte figlia sono tratte dalla frazione SP per identificare le cellule CD45 + e CD45-. D) Per l'identificazione delle cellule endoteliali hemogenic sia da AGM (in figura) o YS (non mostrato), ulteriori porte figlia sono disegnati dalla frazione CD45- di distinguere le cellule CKIT + (vs. cKit-) e Flk1 + (vs. Flk1-). Hemogenic CE sia da YS o AGM sono tipicamente ~ 1 - 3% degli eventi CD45- E) HSPC sono identificate dal CD45 + frazione come CKIT + e Flk1-, e in genere rappresentano il 20 -. 30% di CD45 + cellule se ordinata da AGM (mostrato ) o YS (non mostrato). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Visualizzazione di emopoietiche Differenziazione seguito Cultura di Hemogenic cellule endoteliali e HSPC su metilcellulosa. A) formano colonie da cellule singole ordinati entro 7 giorni di placcatura su metilcellulosa. Multi-lignaggio potenziale ematopoietiche può essere confermata con l'osservazione di diversi tipi di colonie ematopoietiche, identificato dalla valutazione delle morfologie distinta colonia 11. B) Fase di imaging microscopico di ordinato hemogenic CE e HSPC da AGM (o YS, non mostrato) il multi-lignaggio ematopoietiche formazione di colonie dopo 7 giorni di coltura in terreno di coltura metilcellulosa. Non hemogenic CE, dal AGM (o YS, non mostrato) non dimostrano la crescita in queste condizioni. A maggiore ingrandimento, cellule aderenti con morfologia delle cellule endoteliali "ciottoli" classica (freccia bianca) possono essere visti dando origine a gruppi di cellule ematopoietiche in culture di hemogenic CE; tali cellule endoteliali sono osservati in colture di ordinato HSPC (scala = 100 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Rimangono molte domande senza risposta nel campo dello sviluppo hematovascular - un campo che è ancora nella sua infanzia a causa delle difficoltà tecniche insite nello studio di popolazioni di cellule transitori e piccole che emergono solo durante specifici finestre di sviluppo. Le tecniche di cui sopra migliorano molte di queste difficoltà, consentendo per l'isolamento di singole cellule, anche dalla cellule endoteliali hemogenic e popolazioni HSPC nei tessuti embrionali in momenti critici dello sviluppo che utilizzano reagenti e attrezzature che sono in genere disponibili nella maggior parte dei laboratori. Il nostro protocollo consente inoltre di isolamento parallelo di frazioni cellulari endoteliali non hemogenic dal YS e AGM, che possono essere utilizzati per analisi indipendenti, o come controlli per la frazione di cellule endoteliali hemogenic in analisi successive.

Un punto chiave l'isolamento delle cellule endoteliali hemogenic utilizzando questo metodo FACS basata multicolore è opportuno co spettralempensation e il disegno preciso di cancelli monocolore. Come tale, è fortemente raccomandato che i controlli senza macchia e monocolore essere inclusi in tutte le prove sperimentali, e che - insieme con i campioni trattati con anticorpi di controllo isotipo-matched - essere utilizzato per stabilire inizialmente una corretta compensazione spettrale e il disegno di cancelli. Tuttavia, la colorazione non specifica è minima da questo protocollo, in tal modo i controlli non colorati e single-colore sono sufficienti per la verifica di routine di cancelli, una volta impostazioni sorter FACS sono state ottimizzate.

cancelli SP impreciso disegnati sono una preoccupazione particolare con l'approccio descritto nella presente relazione. Precedenti studi hanno dimostrato che le cellule staminali multipotenti esibiscono efflusso preferenziale di Hoechst rosso 17, formando la base fisiologica per il loro aspetto nel SP da FACS. Abbiamo dimostrato che le cellule endoteliali hemogenic e HSPC sono ugualmente trovato all'interno della frazione di cellule SP 5,11. Farmaci come il canale di calciohibitor Verapamil bloccare questo comportamento tintura efflusso Hoechst nelle cellule SP tramite il blocco di una serie di trasportatori di resistenza transmembrana multidrug. In cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, questo avviene principalmente per via ABCG2 / BCRP1 trasportatore 24. In genere induce verapamil> 50% blocco del SP, però, ha dimostrato di essere colpiti da tempi di sviluppo, presumibilmente a causa di cambiare espressione dei tipi di trasportatore multiresistente multipla con differenziale Hoechst il grado complessivo di Hoechst efflusso e la sua successiva blocco da parte Verapamil visto capacità di efflusso, e la sensibilità di Verapamil 5. Pertanto, si raccomanda vivamente di Verapamil-trattata Hoechst macchiato di controllo negativo essere Sono compresi per garantire una corretta gating SP: se una porta SP sia formalmente, una notevole riduzione del numero di cellule SP deve essere rilevato in campioni colorati con Hoechst in la presenza di Verapamil.

Abbiamo precedentemente dimostrato che risoltoCellule SP dal sacco E9.5 murino tuorlo hanno un ~ 80-90 volte maggiore capacità di generare HSPC nella cultura ematopoietiche metilcellulosa-based rispetto ad un numero corrispondente di E9.5 non frazionata, non Hoechst macchiato intere cellule del tessuto YS 5. Ulteriore caratterizzazione della SP ha dimostrato che nel sacco vitellino murino durante ematopoietico precoce e lo sviluppo vascolare E8.0, vi è apprezzabile espressione di VE-caderina e FLK-1, ma a bassa espressione di stelo (c-Kit) e marcatori ematopoietici (CD45). Così, a questo timepoint sviluppo, primordiale (non hemogenic), CE, definito come FLK-1 + / CD31 + cellule non SP / CD45- predominano. Questo profilo di espressione turni come espressione marcatore endoteliale diminuisce e CD45 e c-Kit espressione aumenta, in concomitanza con una crescente capacità di generare HSPC in vitro tra E9.5 e E11.5 5. Questo suggerisce l'attività ematopoietiche del tessuto YS è contenuto all'interno del SP, diventando più evidente tra E9.5 e E11.5, e si verificasseroing attraverso una perdita temporizzato delle caratteristiche endoteliali e graduale acquisizione della capacità ematopoietiche. Come tale, l'espressione dei trasportatori multidrug resistance che danno origine al fenotipo SP sono un importante marcatore fenotipico dell'endotelio hemogenic 5; infatti, le cellule non-SP dal AGM non presentano formano il sangue potenziale 12. Così, successo isolamento della SP tramite Hoechst colorazione sia nel YS e AGM assicura che le cellule saranno scelti dal vano di cellule staminali ematopoietiche di un determinato tessuto, e successiva colorazione anticorpale di cellule all'interno questa frazione consentirà discriminazione della hemogenic (Flk -1 + / c-Kit + / CD45-) rispetto HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) popolazioni 5,11,12. Inoltre, è stato precedentemente osservato che le cellule CD41 + nel SP del sacco vitellino e tessuti AGM sono in grado di formazione di colonie multi-lineage in cultura basata metilcellulosa 11,12. Definiamo cellule endoteliali hemogenic come cellule CD45- SP Flk1 + c-Kit +s utilizzando CD45 come marcatore designato di lignaggio ematopoietico piuttosto che CD41 data la nostra ricerca che l'espressione di CD45 Flk1 ed è praticamente escludono a vicenda 5,11. Questo permette un isolamento puro di cellule all'interno della SP c'hanno endoteliale (FLK-1) e stelo caratteristiche (c-Kit) necessari per endoteliale di transizione ematopoietiche, ma che non hanno ancora subito questo cambiamento, come determinato dalla mancanza di CD45 in questi cellule. Sarebbe utile considerare sub-frazionamento della popolazione HSPC, definito come cellule FLK-1- / c-Kit + / CD45 + / SP, in CSF1R + (macrofagi dei tessuti) e Csf1r- frazione (HSC), come recentemente riportato da Gomez e colleghi 25, in quanto ciò fornirebbe una maggiore risoluzione della vera HSPC contro popolazioni tessuto macrofagi progenitrici, ma questo non dovrebbe pregiudicare l'integrità della frazione delle cellule endoteliali hemogenic cui isolamento abbiamo delineato dal CSF1R è un marcatore di progenitori macrofagi 26.

Hemogcellule endoteliali ENIC sono una sottopopolazione rare sia YS e AGM (comprendente 1 - 3% di cellule endoteliali), e quindi una sfida importante nella loro studio è resa cella insufficiente per applicazioni successive. Questo protocollo di solito si traduce nel 70-80% delle cellule rimanenti vitali per il momento di smistamento, e una tipica hemogenic cellule endoteliali sorta di tessuti pool ottenuto da embrioni multipli può produrre solo poche centinaia di cellule anche in condizioni ottimali, con solo il 10-20% di cellule incorporati in colonie metilcellulosa produzione recuperato. Per massimizzare il numero di cellulare ordinata, è fortemente raccomandato che gli investigatori adottare misure per garantire il tessuto e la vitalità delle cellule in ogni fase della procedura: i tessuti dovrebbero essere rapidamente sezionati e messe in comune, ed i campioni devono essere tenuti in ghiaccio, quando possibile. I campioni devono essere preparati freschi immediatamente prima FACS ordinamento, e ordinati in tubi di raccolta contenenti alto contenuto di siero, o direttamente nella cultura metilcellulosa come descrittod sopra. Se persistono problemi di redditività, provette per il prelievo possono essere pre-rivestite con siero per migliorare ulteriormente la sopravvivenza delle cellule ordinato. Se hemogenic rendimento delle cellule endoteliali rimane bassa, adulto midollo osseo o perline fluoroforo coniugato disponibili in commercio possono essere utilizzati per la compensazione spettrale in luogo delle embrionali controlli singolo colore derivate dal tessuto descritti nel presente documento. Se le cellule ordinati sono destinati per la cultura, le cellule endoteliali hemogenic e HSPC devono essere ordinati direttamente nei pozzetti di coltura dei tessuti. Se le cellule ordinati sono destinati DNA o RNA Analisi dell'espressione genica correlati, cellule endoteliali hemogenic e non hemogenic e HSPC possono essere ordinati direttamente in tubi di raccolta contenenti tampone di lisi del campione per ridurre al minimo la perdita di cellule.

La tecnica descritta consente successo (e simultanea) isolamento delle cellule endoteliali hemogenic e non hemogenic, nonché HSPC e globuli matura frazioni degli stessi tessuti embrionali. Questo approccio consente inoltre Study delle basi molecolari delle transizioni critiche che si verificano come cellule endoteliali generano sangue. Conoscenze acquisite da questi studi evolutivi possono poi essere utilizzati per ottimizzare la generazione di cellule endoteliali umane e hemogenic HSPC progenie da pluripotenti, e potenzialmente autologo, le cellule staminali per il trattamento dei disturbi ematopoietici prevalenti.

Disclosures

Questo lavoro è stato sostenuto byNIH sovvenzioni HL128064, Innovazioni HL096360, EB017103, e CT concedere 15-RMB-YALE-04, a KKH, e NICHD / NIH T32HD007094.

Acknowledgments

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) Sigma D5942 TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling.
Absorbent bench underpad Covidien 7134
#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein  50033 TOXIC inhalant: Use in fume hood.
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine)  Invitrogen 10378016
Type II Collagenase Worthington LS004174
Falcon 70 μM nylon cell strainer Corning CLS431751
Anti-Mouse CD45-FITC eBioscience 11-0451-81
Anti-Mouse CD31 - PE eBioscience 12-0311-81
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 BD Pharmingen 561259
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) Sigma 14533 TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H2O, store aliquots at -20 °C until ready for use.
Verapamil Hydrochloride Sigma 1711202  TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling.   Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol.  Store at -20 °C until ready for use 
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
MethoCult GF M3434 Stem Cell Technologies 3434 Thaw and aliquot per manufacturer's instructions
Modified Giemsa Stain Sigma GS500 TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution.
Cytospin Centrifuge Thermo Scientific A78300003
Clipped Funnel Starter Kit Thermo Scientific 3120110 Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge
Anti-Mouse B-220 - FITC BD Pharmingen 553088
Anti-Mouse Gr-1-FITC eBioscience 11-5931-85
Anti-Mouse Ter-119-FITC eBioscience 11-5921-85
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Scientific 10437-077
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L) Life Technologies  11965-092
Hank's Buffered Salt Solution Life Technologies  14175-095
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate EMD Millipore PIFB24P05
IgG2A-PE BD Pharmingen 553930
IgG2B-FITC BD Pharmingen 556923

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References

  1. Hirschi, K. K. Hemogenic endothelium during development and beyond. Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).
  2. Boisset, J. C., et al. et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).
  5. Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development. Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).
  6. Nakano, H., et al. Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis. Nat Commun. 4, 1564 (2013).
  7. Li, Z., et al. Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).
  8. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  9. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  10. de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo. Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).
  11. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  12. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  13. Tavian, M., et al. Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood. 87 (1), 67-72 (1996).
  14. Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).
  15. Kelly, M. A., Hirschi, K. K. Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).
  16. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  17. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  18. Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), (2010).
  19. Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation. Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).
  20. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  21. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  22. Kina, T., et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage. British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).
  23. Jackson, K. A., et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).
  24. Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
  25. Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  26. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).

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Fang, J. S., Gritz, E. C., Marcelo, K. L., Hirschi, K. K. Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (112), e54150, doi:10.3791/54150 (2016).

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