Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering av Murine Embryonic Hemogenic endotelceller

Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/54150
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Departments of Medicine, Genetics and Biomedical Engineering, Yale Cardiovascular Research Center, Vascular Biology and Therapeutics Program, Yale Stem Cell Center, Yale University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Blodkreft stamceller og stamceller (HSPC) stammer fra spesialiserte (hemogenic) endotelceller under utvikling, men lite er kjent om prosessen der noen endotelceller spesifisere å bli bloddannende. Vi viser en flow-cytometri basert fremgangsmåte som tillater samtidig isolering av hemogenic endotelceller og HSPC fra muse-embryonale vev.

Abstract

Spesifikasjonen av hemogenic endotelceller fra embryonale vaskulærendotelet oppstår under korte utviklingsperioder innenfor forskjellige vev, og er nødvendig for fremveksten av definitive HSPC fra murine ekstra embryonale plommesekken, morkaken, navle fartøy, og de embryonale aorta-gonade-mesonephros ( AGM) region. Forbigående art og liten størrelse av denne cellepopulasjon treffer sin reproduserbar isolasjon for forsiktig kvantifisering og eksperimentelle applikasjoner teknisk vanskelig. Vi har etablert en fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) -basert protokoll for samtidig isolering av hemogenic endotelceller og HSPC under deres peak generasjonstid i plommesekken og AGM. Vi viser metoder for disseksjon av plommesekken og AGM vev fra mus embryoer, og vi presenterer optimalisert vev fordøyelsen og antistoffkonjugering forhold for maksimal celle overlevelse før identifisering og gjenfinning via FACS. Representant FACS analysis tomter er vist at identifisere hemogenic endotelceller og HSPC fenotyper, og beskriver en metylcellulose-baserte analysen for å vurdere deres blod forming potensial på en klonal nivå.

Introduction

En funksjonell sirkulasjonssystemet krever en parallell utvikling av blodkar og blodceller. På de tidligste stadiene av blod utvikling (primitive hematopoiesis), forblir opprinnelsen erytroblaster kraftig debattert en. I motsetning til ved senere stadier av blodcellenes utvikling (definitive hematopoiesis), har det blitt stadig klarere at multi-avstamning HSPC oppstå fra spesialiserte vaskulære endotelceller som kjøper bloddannende potensielle (hemogenic endotelceller) i plommesekken, morkaken og AGM 2-5, samt i vitelline og umbilicals fartøy, embryonale endocardium 6, og hodet blodkar 7. Spesifikasjonen av hemogenic endotelceller innenfor disse forskjellige vev oppstår på bestemte stadier av utvikling; for eksempel innenfor plommesekken på ~ E8.25 og innen generalforsamlingen på ~ E10 8-12. Likevel, selv under disse spesifikke utviklings vinduer, befolkningen i hemogenic endothelial celler representerer en liten fraksjon av alle endotelceller (1 - 3% av plommesekken og AGM endotelceller) 11,12. Prosessen med hemogenic endotelial celle "beskrivelse" er kritisk for murin, så vel som human, hematopoiesis. Hematopoetiske celler har vist seg å knopp fra endotelet i plommesekken fartøyer og aorta i menneskelige embryo 13, og flere laboratorier har vist at blodceller fra humane pluripotente stamceller kreves en endotelcelle mellomliggende 14-16. Dermed definerer fenotype av murine hemogenic endotelceller og forstå de molekylære hendelser som fører til deres utvikling i denne dyremodell skal lette arbeidet for in vitro teknologier for generering av hemogenic endotelceller fra menneskelige pluripotente stamceller. I sin tur, eventuell utvikling av en metode for storskala produksjon av differensierte blodcelletyper fra multilineær HSPC - selv deriVed fra menneskelige pluripotente stamceller via en fysiologisk relevant hemogenic endotelceller mellom - ville ha utrolig terapeutisk potensial for hematologisk, onkologisk og regenerativ medisin. Mot dette målet, har vi definert fenotype av hemogenic endotelceller, på en klonal nivå, innen murine plommesekken 11 og AGM 12, to store områder av definitive HSPC produksjon i løpet embryogenese. Som HSPC innenfor voksen benmarg 17, embryonale hemogenic endotelceller og HSPC oppviser Hoechst fargestoff efflux egenskaper, og derfor vises i den "side populasjonen» (SP) av celler på en FACS plott 5,11,12 (som vist i figur 3). I tillegg har vi også vist at hemogenic endotelceller uttrykke markører av både endotel- og stamceller (Flk1 og cKit, henholdsvis), men uttrykker ikke hematopoetiske linjen markøren CD45 5,11,12. Således kan hemogenic endotelceller være identsert og isolert ved FACS som Flk1 + / cKit + / CD45- SP-celler, og vi har vist at disse cellene gir opphav til HSPC inneholdt i Flk1- / cKit + / CD45 + SP brøkdel av plommesekken og AGM-celler 5,11,12. Hemogenic endotelceller og HSPC kan identifiseres og isoleres fra plommesekken eller AGM vev høstet fra enten fersk avlives embryoer, eller fra embryoer dyrket i opptil 48 timer i ex vivo embryo kultur (som vist i figur 1). Ex vivo kultur tillater selektiv forbehandling av individuelle embryoer med farmakologiske midler, og også gir mulighet for forbigående uttrykk for ønskede transgener (dvs. ved lentiviral transduksjon). FACS identifikasjon av hemogenic endotelceller og HSPC ved fremgangsmåten beskrevet heri kan anvendes som et kvantitativt mål på definitiv hematopoetiske utvikling i genetisk manipulerte musemodeller; cellene kan også hentes for påfølgende eksperimentelle programmer, inkludert blod-forming analyser, uttrykk analyse, og transplantasjon.

Animal Emner: Bruk og etiske hensyn

En voksende mengde litteratur har etablert viktige bidrag hemogenic endotelceller til HSPC formasjon under den definitive hematopoiesis stadium av embryonal utvikling. Likevel forblir de fysiologiske tilstander og signaler som fremmer spesifisering av en subpopulasjon av endotelceller mot en hemogenic skjebne dårlig forstått, og kan derfor ikke ennå bli etterlignet i en in vitro omgivelser. Faktisk teknikkene beskrevet i denne artikkelen er for øyeblikket i bruk av vår lab og andre grupper for å forbedre feltets forståelse av hematovascular utvikling, slik at en tilnærming for ex vivo hemogenic endotelceller spesifikasjon og HSPC produksjon kan en dag bli utviklet. Inntil imidlertid fortsatt feltet avhengig av primære vev fra villtype (og gentisk modifisert) museembryoer å skaffe spesifisert hemogenic endotelceller og HSPC for videre studier. Hemogenic endotelceller og HSPC kan bli pålitelig identifisert og isolert fra enten E8.5 (10 - 12 somitt par) plommesekken eller E10.5 (35 - 40 somitt par) AGM 11,12. På grunn av den relative mangelen på hemogenic endotelceller (vanligvis representerer 1-3% av totalt antall endotelceller 11,12 innenfor disse vev) kontinuitets vev fra flere (~ 8 - 10) kullsøsken i en enkelt prøve er sterkt anbefalt for å skaffe tilstrekkelig celler for senere eksperimentering. Verifisering av at hemogenic endotelceller og HSPC har blitt identifisert og isolert kan oppnås ved dyrkning av hentede celler under betingelser som induserer differensiering blodkreft. Under disse betingelser vil hemogenic endotelceller og HSPC oppviser multilineær hematopoetiske differensiering, noe som resulterer i fremkomsten av kolonier som inneholder erithroid stamfedre (BFU-E), granulocytter og makrostamfedre (CFU-GM), og granulocytter, erytrocytter, makrofag, megakaryocytt progenitor kolonier (CFU-GEMM).

Protocol

Etikk Uttalelse: Protokollen beskrevet nedenfor er gjennomgått av, og er i samsvar med retningslinjene i, Yale University Institutional Animal Care og bruk komité.

1. Hele Embryo Ex V ivo Kultur for plommesekken Studies (valgfritt)

  1. Avlive gravide demninger ved E7.0 - E7.5, og fjerne uterine horn under sterile betingelser, som beskrevet i mer detalj nedenfor (trinn 2.4 til 2.7).
  2. Separate hele embryoer (med plommesekken intakt 12) fra omkringliggende decidua, og suspendere i 50 ml hele rotteserum i 50 ml polystyren rør.
  3. Gass embryo flasker for 3 min med 5% CO2 umiddelbart som tidligere beskrevet 12,18. Gjenta dette trinnet på 24 timer hvis dyrking embryoer til 24 - 48 timer.
  4. Inkuber i rullende 37 ° C kultur i opptil 48 timer.
    Merk: Embryoet kan behandles ex vivo med farmakologiske midler (dvs. Notch inhibitor DAP.T 12), eller oppløselige proteiner (dvs. fibronektin 19) gjennom pre-inkubering av embryoer for opp til 2 timer i dyrkningsmedium inneholdende slike faktorer, eller ved tilsetning av disse faktorer i forhold til valsekulturmediet for hele lengden av den ex vivo-kulturen periode. Genuttrykk kan manipuleres i embryoer ved pre-inkubasjon av embryoer med optimalt titered lentivirus for 2 timer 12. Plommesekken vaskulær og blodkreft utvikling kan overvåkes i sanntid ved hjelp av transgene reporter mus og optiske avbildningsteknikker.

2. Disseksjon av plommesekken (YS) eller aorta-gonade-mesonephros (AGM) fra mus embryoer

  1. Steriliser laboratoriebenken ved sprøyting og å tørke alle overflater med 70% etanol for å redusere forurensning i etterfølgende cellekulturer. Plasser et absorberende underlags på lab benkeflaten.
  2. Sterilisere kirurgiske instrumenter med 70% etanol. Anbefalte kirurgiske instrumenter er to # 5 rett kraftps, og en 8,5 cm rette saks.
  3. Hvis du arbeider med embryoer fra ex vivo kultur, forsiktig fjerne hele embryoer fra 50 ml Falcon rør og fortsette umiddelbart til trinn 2.8. Ellers hopper du over dette trinnet og gå til trinn 2.4.
  4. Avlive gravid demningen ved passende embryonal alder (E8.5 om høsting YS; E10.5 hvis høsting AGM).
    Merk: Den beskrevne teknikken benytter en dual-metoden dødshjelp tilnærming - dødelig dose av et flyktig bedøvelse etterfulgt av mekanisk cervical forvridning - for å minimere dyr smerte og nød, og for å sikre minimal invasiv og human avslutning av dyr fag. Dette kombinert teknikk for liten gnager eutanasi er anbefalt av American Veterinary Medical Association når utført av en utdannet og dyktig etterforsker (AVMA Retningslinjer for Avliving av dyr: 2013 Edition).
    1. Anesthetize mus bruker en dødelig dose av isofluran (> 5% i O 2) i 3 - 5 min. (CAUTION: Isofluran er en giftig inhalant; bruke under et avtrekksskap med egnet åndedretts personlig verneutstyr.)
    2. Etter eksponering av mus til isofluran, sjekk minst tre tegn til bedøvelse nivå - tap av rettende refleks, tap av tå klype refleks, og reduksjon av respirasjonsfrekvens - for å sikre fagene har oppnådd en dyp bedøvelse plan før du fortsetter med mekanisk aktiv dødshjelp.
    3. Cervically forrykke dam raskt indusere døden.
  5. Plasser avlives dam liggende på underlags og liberalt spray nedre del av magen med 70% etanol.
  6. Gjør en loddrett snitt langs midtlinjen av den nedre bukvegg. Foreta ytterligere ~ 1 tomme horisontale snitt strekker høyre og venstre fra midtpunktet av den vertikale snitt, og dissekere bort bukveggen å fullt avsløre høyre og venstre livmor horn hver inneholder flere gryende embryoer.
  7. Bruk pinsett, hold en av de to livmor hornog bruke saks for å skille den fra mesometrium. Plasser dissekert livmor på is i steril Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) i en 60 mm cellekulturplate. Gjenta for andre livmorhorn.
  8. Under en standard lys dissekere mikroskop Bruk pinsett til å trekke bort muskulære laget av livmor sac å avdekke den underliggende gestational sac og decidua. Isoler YS (figur 2A) ved å forsiktig fjerne sac fra vedlagte embryo. Fjern YS vev fra embryo skikkelig på embryonale opprinnelse vitelline fartøy.
  9. For å isolere generalforsamlingen, fjern YS og transekt embryo under nivået av hjertet og forbein og kast thorax og hoderegionen. Deretter skjære over embryo like under nivået av bakbena og fjernes og kastes hale vev. Fjern bakbena og overflødig ventral vev fra den gjenværende delen, som inneholder generalforsamlingen (figur 2B).
  10. Pool YS eller AGM vev fra flere embryoer og butikkpå is i HBSS + (HBSS supplementert med 10% (v / v) føtalt bovint serum og 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 0,3 mg / ml L-glutamin) i en ren 1,5 ml rør.

3. Fordøyelse av Primær Tissue til en enkelt cellesuspensjon

  1. Sentrifugerør inneholdende høstet YS eller AGM vev i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C.
  2. Fjern supernatant og resuspender vev i 1 ml av enten 0,05% (for YS) eller 0,2% (for AGM) kollagenase type II fortynnet i HBSS +. Inkuber i 30 minutter i vannbad ved 37 ° C, invertering rør hver 5 min for å blande.
  3. Forsiktig mekanisk distansere vev ved å sende prøven 10 ganger gjennom en P1000 pipette. Hvis det å ha problemer med å aspirere delvis fordøyd vev, kan pipette hullet utvides ved å kutte av ~ 5 mm av spissen med en saks.
  4. Sentrifuger prøven i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender i 1 ml iskald HBSS +.
  5. Pass prøven gjennom en 70-# 956; m celle sil.
  6. Telle celler ved hjelp av en manuell eller automatisk hemocytometer.
  7. Sentrifuger prøven i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Resuspender prøven i DMEM + (4,5 g / l glukose Dulbeccos modifiserte Eagle-medium supplert med 10% (v / v) føtalt bovint serum og 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 0,3 mg / ml L-glutamin) pre- oppvarmet til 37 ° C, slik at cellene er ved en sluttkonsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml.

4. Behandling av Celler med Nucleic Acid Dye og merking med fluorescerende konjugerte antistoffer

  1. Alikvot minst 100 ul prøve (1 x 10 5 celler) i 1,5 ml friskt rør for antistoff inkubasjon.
  2. Ta med følgende prøven og nødvendige kontrollrørene: Ufarget; bare cKit-APC; bare CD45-FITC; bare CD31-PE; bare Flk1-PECy7; Hoechst 33342 bare; Hoechst 33342 bare + Verapamil; Eksempel (mottar alle farger, vil ikke motta Verapamil). Bruker et minimum på 1 x 10 Merk: Et større volum av celler kan bli tilsatt til prøverøret i samme konsentrasjon for å maksimere utbyttet av sortert Hemogenic EC og HSPC.
  3. Legg Verapamil fortynnet i 95% etanol (se diskusjon for begrunnelsen) til "Hoechst 33342 eneste + Verapamil" kontroll rør til en sluttkonsentrasjon på 50 uM. Inkuber alle rør i 5 minutter ved 37 ° C. (OBS: Verapamil er en potent kalsiumkanalblokkerende middel og er ekstremt giftig Håndteres med vernehansker.).
  4. Legg Hoechst 33342 til "Hoechst 33342 eneste" kontroll, for å Hoechst 33342 + Verapamil bare kontroll, og til den "Sample" rør til en sluttkonsentrasjon på 5 ug / ml. Inkuber alle rør i 1 time ved 37 ° C, beskyttet mot lys. Bland forsiktig ved å snu hver 15 min. (OBS: Hoechst 33342 er en giftig kjernefysisk fargestoff og bør håndteres med hansker).
  5. Sentrifuger alle SAMPles i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Fjern supernatant og resuspender cellepelleter ved en konsentrasjon på 1 x 10 5 celler / ml i kald HBSS +.
  6. Legg fluorescently konjugerte antistoffer til egnede antistoff-bare styre rør, og til den "Sample" rør til en sluttkonsentrasjon på 2 ug / ml. Inkuber på is i 30 min, beskyttet mot lys.
  7. Sentrifuger alle rør i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Fjern supernatant og resuspender cellepelleten i 500 ul iskald HBSS. Strain prøver gjennom mesh filter cap på 5 ml rund bunn polystyren FACS rør og lagre på is, beskyttet mot lys, for umiddelbar FACS.

5. Identifisering og Isolering av Hemogenic endotelceller og HSPC ved FACS

Merk: Denne protokollen ble optimalisert ved hjelp av en BD FACSAria 5-lasersystem utstyrt med en 100 mw 355 nm UV laser, en 200 mw 405 nm Violet laser, en 200 mw 488 nm blå laser, en 200 mw 532 nm Grønn laser, og en 150 mw 637 nm Redlaser. Celler ble sortert i steril PBS som skjermfluid og under aseptiske betingelser, og gjennom en 100 um dyse med strømningshastigheten satt til en prøvetrykk på 1, slik at et maksimum på 1500 - 2000 hendelser blir ervervet per sekund for å minimalisere stress i cellene.

  1. Under disse innstillingene som er beskrevet ovenfor, kan du bruke "unstained" og enkle fargekontroll rør for å optimalisere FACS celle sorter laser intensiteter og utføre multi-fargekontroll spektral kompensasjon i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk forover og sidespredning å opptre live celle og dublett diskriminering fra totalt hendelser (se produsentens instruksjoner for mer informasjon).
    Merk: Denne protokollen vanligvis resulterer i ~ 70-80% levedyktige celler. Hvis det oppstår problemer med lav celle levedyktighet, at vev blir først dissekert raskt i iskaldt media, og at alle trinn unntatt de som spesifiserer ellers utføres på is, med forsiktig pipettering for å minimere klipping og celledød(Se diskusjon for større detalj på å bevare celleviabilitet).
  2. Bruk en differensial lineær skala tomt på Hoechst Red vs. Hoechst blå fluorescens å identifisere side befolkningen (SP) hendelser (figur 3A). Bruk "Hoechst 33342 eneste + Verapamil" kontroll som en negativ kontroll for å verifisere at portene er riktig tiltrukket for prøven. SP vil vises som en skulder til venstre av de ikke-SP-celler, og vil bli redusert i Verapamil-behandlet kontrollgruppe. Den ikke-SP populasjonen vil bli brukt til å identifisere ikke-hemogenic EC (figur 3B).
  3. Opprett flere differensial fluorescens plott (log-skala akser) og trekke datter porter av SP å identifisere hemogenic endotelceller (figur 3C-E).
    Merk: Hemogenic endotelceller er profilert som Flk1 + / cKit + / CD45- SP celler (Figur 3D), og HSPC er Flk1- / cKit + / CD45 + SP celler (Figur 3E). Hemogenic endothelial calen kan analyseres parallelt med ikke-hemogenic endotelceller, som er identifisert i denne metoden som CD31 + / CD45- ikke-SP-celler (Figur 3B).
  4. Hente hemogenic endotelcelle eller HSPC fraksjon på metylcellulose inneholdende plater for hematopoietisk kultur (se nedenfor), eller i andre buffere for etterfølgende bearbeiding og analyse.

6. blodkreft Differensiering i Kultur

  1. Tilsett 0,5 ml (135 pl / cm 2) metylcellulose-baserte hematopoetiske kulturmedier til ønskede antall brønner på en 24-brønners vevskulturplate ved romtemperatur. Legg 0,5 ml sterilt vann i ubrukte brønner for å redusere fordampning. Fremstille frisk og holde ved romtemperatur inntil bruk.
  2. Sortering 1 - 10 celler for klonal analyse, eller opp til 1000 hemogenic endotelceller (Flk1 + / cKit + / CD45- SP-celler) eller HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP-celler) for bulk ekspansjon og differensiering direkte inn i hver brønn avplate som inneholder metylcellulose. Kolonidannelse påvises i ca. 10 - 20%.
  3. I et sterilt vev kultur hette, bruk en P1000 spissen med spissen trimmet for å utvide sin boring, å forsiktig resuspendere hver brønn av de seeded metylcellulose media 2 - 3 ganger, ta vare å unngå etablering av bobler. Dette sikrer suspensjon av de sorterte cellene inn i det halvfaste methylcellulose for optimal vekst.
  4. Inkuber platen ved 37 ° C med 5% CO2 i opptil 2 uker.
  5. Overvåke enkeltcellekulturer for dannelsen av differensierte blodkreft cellekolonier over tid (figur 4). Score brønner for mengden og typen av differensierte hematopoetiske kolonier på dag 1, 3, 7 og 14 ved fremgangsmåte (e) som er beskrevet nedenfor i trinn 6,7.
    1. Score plater på dag 1 for å bekrefte konfluens og fortsatte levedyktighet av de sorterte cellene.
    2. Etter dag tre, se etter tidlige dannelsen av heft hemogenic endothelial cellekolonier med "brosteinentone "morfologi (se Goldie et al. 11 og Marcelo et al. 12 for representasjon av dag 3 morfologi).
    3. Ved dager 5 - 7, sjekk for dannelsen av avrundede HSPC klynger i brønner som inneholder sortert hemogenic EC. HSPC bør observeres ved siden flatet hemogenic EC viser en "brostein" endotelceller morfologi.
      Merk: Hemogenic endotelceller som skal danne hematopoietiske kolonier (bestemt av hematopoietisk koloninummer), og bør vise multilineær differensiering kapasitet (bestemt ved observasjon av flere kolonityper fra en enkelt celle). Vi har tidligere sett at ~ 20% av hemogenic EC eller HSPC hentes ved FACS overleve for å danne differensierende og prolifererende blodkreft kolonier i metylcellulose 11.
  6. For å vurdere kolonidannelse av fase mikroskopi:
    1. Visualiser og telle koloniene ved lav forstørrelse under en fase lysmikroskop, og identifisere BFU-E CFU-GM, CFU-GEMM og kolonier av kolonienes morfologi, som beskrevet av Goldie et al., 11.
  7. For å vurdere kolonidannelse ved celle morfologi:
    1. Sug individuelle kolonier fra methylcellulose overflaten i en P1000 spiss med slutten trimmet til å utvide hullet. Dette muliggjør aspirasjon av det viskøse medium methylcellulose og sikrer vellykket innhenting av kolonien.
    2. Resuspender plukket kolonier i 200 ml HBSS og sentrifugering på en glassplate ved anvendelse av en cytosentrifuge ved 28 xg i 5 minutter.
    3. Fix lysbilder i 100% metanol i 5 min (OBS: Metanol er giftig og bør bare brukes i en kjemisk hette med passende ventilasjon og personlig verneutstyr).
    4. Senk lysbilder i 0,04% Giemsa beis for 20 min (OBS:. Giemsa beis inneholder metanol Bruk i en kjemisk hette med passende ventilasjon og personal verneutstyr).
    5. Vask objektglass i deionisert vann.
    6. Mount lysbilder med dekkglass og bilde i høy forstørrelse i henhold til en standard lysmikroskop, sammenligne celle morfologi til at klassisk observert i hematopoetiske celler fra voksne benmargen som er dyrket i metylcellulose media. For eksempler, se produsentens instruksjoner.
  8. For å vurdere kolonidannelse ved celle uttrykk for blodkreft avstamning markører ved FACS:
    1. Tilsett 2 ml HBSS til hver brønn i en 24-brønners plate inneholdende kolonier dyrket på 0,5 ml metylcellulose (dvs. fortynne kommersielt tilgjengelige lager metylcellulose 1: 4). Pipettere opp og ned for å blande, og overføring til friskt rør (e).
    2. Sentrifuger prøven ved 2000 xg i 5 min ved 4 ° C ved anvendelse av en standard bordmikrosentrifuge.
    3. Fjern supernatant og resuspender cellepelleten (e) i 1 ml HBSS +, pooling prøver hvis så ønskes.
    4. Centrifuge prøve ved 2000 xg i 5 min ved 4 ° C.
    5. Fjern supernatant og resuspender cellepelleten (e) i 400 ul HBSS +.
    6. Delmengde prøven i fire 1,5 ml rør som følger: Ufarget; bare B220-FITC; GR-en-FITC bare; Ter119-FITC bare.
    7. Legg fluorescensmerket antistoff til passende rør til en sluttkonsentrasjon på 2 ug / ml. Inkuber ved 37 ° C i 15 min.
    8. Sentrifuger prøven ved 2000 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatant og resuspender cellepelleten i iskald 0,5 ml HBSS.
    9. Analyser hver prøve ved FACS for uttrykk av hver blodkreft avstamning markør: B220 markerer B-celler 20; GR-1 merker myeloide celler 21; Ter119 markerer erytroidcellene 22.
      Merk: Ytterligere antistoffer rettet mot andre blodkreft avstamning markører kan bli innlemmet i denne tilnærmingen, hvis ønskelig.

Representative Results

Vellykket merking av hemogenic endotelceller og HSPC fra embryonale YS eller AGM vil gi FACS spredningsplott som ligner på de representative tomter som er presentert i Figur 3. Følgende standard levende celle og dublett diskriminering av fremover og side scatter (ikke vist), side befolkningen (SP) hendelser er visualisert i en lineær Hoechst Red vs. Hoechst Blå differensial tomt i fravær av Verapamil som en "skulder" venstre-skiftet fra de fleste (ikke-SP) hendelser (figur 3A). Når SP-porten er riktig tiltrukket, vil SP-celler representerer omtrent 1 - 3% av totale levedyktige celler YS og 3 - 5% av totale levedyktige AGM arrangementer. Verapamil behandling bør resultere i> 50% inhibering av SP hendelser uavhengig av vev kilde (figur 3A, topplater). Vi har tidligere fastslått at andre bestander som vises utenfor SP skulderen, men er også blokkert av verapamil er Ter119-positive erythroblasts, og er derfor ekskludert fra vår SP befolkning fem.

Sammenlignet med SP, blir ikke-SP-celler er identifisert som den tette klynge av celler som grenser til SP "skulder" (figur 3A). Denne populasjonen inneholder ikke-Hemogenic EC som kan skilles ved hjelp av en CD31-PE vs. CD45-FITC datter plott (figur 3B), som CD31 + / CD45- hendelser. Ikke-Hemogenic EC er typisk 2-5% av ikke-SP-celler fra AGM (figur 3B) eller plommesekken (ikke vist), og et høyt antall av disse cellene kan sorteres tilbake med relativ letthet.

For identifisering av HSPC og Hemogenic EC, er datter porter trukket fra SP fraksjon, identifisere CD45 + og CD45- celler, hvor CD45 + celler er typisk <20% av totalt antall hendelser i både AGM (figur 3C) eller YS (ikke vist). Hemogenic EC senere blir identifisert fra CD45- celler i en differensial cKit-APC vs. Flk1-PECy7 datter pmye som dobbelt-positive hendelser, og vanligvis representerer 1-3% av CD45- hendelser når isolert fra enten AGM (figur 3 D) eller YS (ikke vist). HSPC identifiseres fra CD45 + fraksjonen i en separat cKit-APC vs. Flk1-PECy7 datter plott som Flk1- / cKit + -celler, og også typisk utgjør ca 25 - 30% av den lille populasjon av CD45 + -celler når det oppnås fra enten YS (ikke vist) eller AGM (figur 3 E). Således, både Hemogenic EC og HSPC er usedvanlig sjelden (~ 0,01% av det totale cellehendelser), og det er typisk for denne protokollen for å returnere noen få hundre av hver celletype selv når vev fra flere embryoer blir slått sammen. Gates i datter tomter bør opprettes med referanse til negative kontrollgrupper. For å kunne skille mellom spesifikk og ikke-spesifikt antistoff flekker, skal portene være først tegnet henvisning til begge Ufarget kontroller (figur 3C), samt prøvene som er behandlet med fluorescens-konjugert isotype-matchet (IgG2a IgG2b eller kontrollantistoffer) (ikke vist). Denne sistnevnte kontroll har vist at ikke-spesifikk farging er minimal ved denne protokollen, derfor mens vi anbefale at isotype-matchet kontroll antistoffer (f.eks., IgG2a-PE eller IgG2b-FITC) skal i første omgang brukes til å optimalisere FACS sorter innstillinger og finne gate grenser vi finner også at ufargede kontroller er tilstrekkelig for å bekrefte gate grenser og eksperimentell kvalitet under rutine FACS sortering. Hvis portene er riktig trukket, bør minimal positiv scatter observeres i enkelt- eller dobbeltrom-positive portene ved opptak fra ufargede eller isotype-matchet kontroller.

Hemogenic endotelceller fra generalforsamlingen og HSPC gjennomgå blodkreft differensiering over 14 dager med kultur i metylcellulose (figur 4A). Den relative andel av kolonityper som vanligvis observeres i dissekulturer er avhengig av vev kilde. Hemogenic endotelceller isolert fra plommesekk vev på E8.5-E9.5 gi opphav til BFU-E, CFU-GM, og få CFU-GEMM 5, mens hemogenic endotelceller isolert fra E10.5 generalforsamlingen gir opphav til overveiende CFU -GEMM 12, selv om andre cellelinjer er fortsatt observeres, slik som vist i figur 4B (øverst til venstre panel). HSPC isolert fra E10.5 AGM også gi opphav til hovedsakelig CFU-GEMM ved kultur i metylcellulose (figur 4B, topp midtre panel), selv om disse cellene kan også differensieres til andre hematopoetiske kolonityper i tillegg. Non-hemogenic endotelceller (CD31 + / CD45- ikke-SP) har også vært belagt (figur 4B, panel øverst til høyre). Disse cellene viser ingen vekst i hematopoetisk kultur etter 14 dager.

Analyser av hematopoetiske kapasitet av individuelle overflatemarkør som uttrykker celletyper, inkludert celler med og uten ekspresjon av hematopoetiske ennd endothelial markører CD31, Flk1, c-Kit, VE-cad, CD41, og CD45 i SP brøkdel av generalforsamlingen ved E10.5 er utført og viser at multi-avstamning kolonidannende aktivitet i E10.5 generalforsamlingen er begrenset til CD31 +, VE-cadherin + c-Kit +, CD41 + og CD45 + SP celler 12. Interessant, ble kolonidannende aktivitet bemerket i både Flk-1 + og Flk-1- SP celler, men bare Flk1 + c-Kit + CD45- SP celler ga opphav til multi-avstamning kolonier via en endothelial enkeltlag mellom preget av både "brostein "endotelceller morfologi (figur 4B, nederst til venstre panel) og av Dil-AcLDL opptak 12. Videre er nødvendig for hematopoietisk aktivitet av AGM SP-celler 12 ekspresjon av c-kit.

Mens det har blitt vist at noen myeloide stamceller har lignende morfologiske karakteristikker når sammenlignet med hemogenic endotelceller, myeloide progenitorceller uttrykker CD45 og kan ikke generere multilineær kolonier 12,23 og gi opphav til avrundede cellegrupper uten en underliggende endotel-monolag (figur 4B, panel nederst til høyre). Derfor populasjonen vi definerer som hemogenic endotel (eller Flk-1 + / c-kit + / CD45-SP-celler) representerer endotelceller med bloddannende potensiale og robust hematoendothelial genekspresjon, inkludert Gata-1/2, Lmo2, SCL / tal-1, Runx-1, c-Kit, CD34, CD41, CD45 og 11 som er forskjellig fra hematopoietiske stamceller og forløperceller, så vel som deres ikke-hemogenic endotelcelle motstykker.

Figur 1
Figur 1. Samlet arbeidsflyt. Kort fortalt blir embryoer fjernet fra gravide demninger, og YS eller AGM vev er høstet. Embryoer kan eventuelt dyrkes for 2 4-48 timers ex vivo før vev innhøsting. Høstet YS eller AGM-vevet nedbrytes til en enkelt cellesuspensjon, alikvotert inn i kontroll- og prøverør, og inkubert i nærvær av Hoechst fargestoff og / eller fluorescensmerket-konjugerte antistoffer. Verapamil, en kalsiumkanal-inhibitor, er også brukt for å generere en negativ kontroll avgjørende for verifisering av korrekt gating av SP-fraksjonen. Hemogenic endotelceller er identifisert ved hjelp av FACS som Flk1 + / cKit + / CD45- SP-celler, mens HSPC er inneholdt i den Flk1- / cKit + / CD45 + SP fraksjon av celler; begge celletyper er sortert på methylcellulose for bekreftelse av hemogenic potensial. I tillegg kan ikke-hemogenic endotelceller bli diskriminert (og hentet frem, hvis det er ønskelig) som CD31 + / CD45- ikke-SP celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

igur 2 "src =" / files / ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg "/>
Figur 2. Disseksjon av YS og AGM vev. A) Den YS er dissekert fra E8.5 embryo, og plassert helt inn i sterile HBSS + for påfølgende fordøyelsen. B) Stammen av E10.5 embryoer blir isolert ved å lage horisontale kutt under begge forbena og bakbena knopper. Generalforsamlingen blir deretter skilt fra lem knopper og vev ved hjelp av pinsett ventrale. C) Bright-feltet bilder viser disseksjon av både YS og AGM fra en E10.5 embryo (skala = 1 mm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representative Tomter Demonstrere Gate Hierarki for diskrimineringav Hemogenic endotelcelle s (Flk1 + / cKit + / CD45- SP celler), HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP celler), og ikke-hemogenic endotelceller (CD31 + / CD45- ikke-SP) ved FACS fra E8.5 YS eller E10.5 AGM. etter levende celle og dublett diskriminering av celler fra enten YS (venstre panel) eller AGM (høyre panel) av fremover og sidespredning (ikke vist), A) siden befolkningen (SP) gate er trukket og verifisert ved en betydelig reduksjon av SP-fraksjonen i den Verapamil-behandlede negativ kontroll. Den ikke-SP befolkning er identifisert som den tette klynge av celler ved siden av SP. I hver av de presenterte plott 20.000 hendelser vises B) Ikke-hemogenic endoteliale celler er identifisert som CD31 + / CD45- celler i den ikke-SP-fraksjon, og representerer 2 -. 5% av ikke-SP-celler, også oppnådd fra AGM (vist ) eller YS (ikke vist). til DISKRminate Hemogenic EC eller HSPC, C) datter porter er trukket fra SP fraksjonen for å identifisere CD45 + og CD45- celler. D) For identifisering av hemogenic endotelceller fra enten AGM (vist) eller YS (ikke vist), er flere datter porter trukket fra CD45- brøkdel å skille cKit + (vs. cKit-) og Flk1 + (vs. Flk1-) celler. Hemogenic EC fra enten YS eller AGM er vanligvis ~ 1-3% av CD45- hendelser E) HSPC er identifisert fra CD45 + fraksjonen som cKit + og Flk1-, og vanligvis representerer 20 -. 30% av CD45 + celler enten sortert fra AGM (vist ) eller YS (ikke vist). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Visualization av blodkreft Differensiering følgende Culture of Hemogenic endotelceller og HSPC på Methylcellulose. A) Colonies form fra sorterte individuelle celler innen 7 dager etter plating på metylcellulose. Multi-avstamning blodkreft potensial kan bekreftes ved observasjon av flere blodkreft kolonityper, identifisert av vurdering av distinkte koloni morfologi 11. B) Fase mikroskopisk bildebehandling av sortert hemogenic EC og HSPC fra AGM (eller YS, ikke vist) viser multi-avstamning blodkreft kolonidannelse etter 7 dagers dyrking i metylcellulose kulturmediet. Ikke-hemogenic EC fra AGM (eller YS, ikke vist) som ikke viser vekst under disse betingelser. Ved høyere forstørrelse kan heftende celler med klassisk "brostein" endotelceller morfologi (hvit pil) ses som gir opphav til klynger av hematopoetiske celler i Cultures av hemogenic EF, ingen slike endotelceller er observert i kulturer av sortert HSPC (skala = 100 nm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Det gjenstår mange ubesvarte spørsmål innen hematovascular utvikling - et felt som er fortsatt i sin barndom på grunn av tekniske problemer ligger i å studere forbigående og små cellepopulasjoner som bare dukker opp i løpet av spesifikke utviklings vinduer. Teknikkene som er beskrevet ovenfor lindre mange av disse vanskelighetene ved å tillate isolering av til og med enkeltceller fra hemogenic endotelcelle og HSPC populasjoner i embryonale vev ved kritiske utviklingsmessige tidspunkter ved bruk av reagenser og utstyr som vanligvis er tilgjengelig i de fleste laboratorier. Vår protokollen tillater også for parallell isolering av ikke-hemogenic endotelcelle fraksjoner fra YS og AGM, som kan brukes for uavhengig analyse, eller som kontroller for den hemogenic endotelial cellefraksjon i etterfølgende analyser.

Et sentralt punkt i isolering av hemogenic endotelceller ved hjelp av denne flerfarget FACS-basert metode er hensiktsmessig spektral compensation og nøyaktig tegning av ensfargede porter. Som sådan, er det sterkt anbefalt at unstained og ensfargede kontroller skal inkluderes i alle eksperimentkjøringer, og at de - sammen med prøvene som er behandlet med isotype-matchet kontroll antistoff - brukes til å begynne med å etablere riktig spektral kompensasjon og tegning av porter. Imidlertid er ikke-spesifikk farging minimal ved denne protokollen, og dermed ufargede og ensfargede kontrollene er tilstrekkelig for rutinemessig kontroll av portene gang FACS sorter innstillingene har blitt optimalisert.

Feilaktig trukket SP portene er en spesiell bekymring med tilnærmingen som er beskrevet i denne rapporten. Tidligere studier har vist at multipotente stamceller oppviser preferensiell effluks av Hoechst rødt 17, som danner den fysiologiske basis for deres opptreden i SP ved FACS. Vi har vist at hemogenic endotelceller og HSPC er på lignende måte funnet i SP cellefraksjon 5,11. Stoffer som for eksempel kalsiumkanal ihibitor Verapamil blokkere denne Hoechst fargestoff utstrømming atferd i SP celler via blokkering av en rekke transmultiresistens transportører. I blodkreft stamceller og stamceller, dette skjer primært via ABCG2 / BCRP1 transporter 24. Vanligvis verapamil induserer> 50% blokkering av SP, men den samlede graden av Hoechst effluks og dens påfølgende blokkering av Verapamil sett har vist seg å bli påvirket av utviklings timing, antagelig på grunn av skiftende ekspresjon av multiple multilegemiddelresistente transportørtyper med differensial Hoechst efflux evne, og følsomhet for Verapamil 5. Således er det sterkt anbefalt at Verapamil-behandlede Hoechst-farget negativ kontroll være standardmessig inkludert for å sikre korrekt SP gating: hvis et SP-port er riktig tiltrukket, bør en bemerkelsesverdig reduksjon i antallet SP-celler påvises i prøver farget med Hoechst i tilstedeværelsen av Verapamil.

Vi har tidligere vist at sorteresSP celler fra E9.5 murine plommesekken har en ~ 80-90 ganger større evne til å generere HSPC i metylcellulose baserte blodkreft kultur sammenlignet med en matchet antall E9.5 ufraksjonert, ikke-Hoechst farget hele YS vev celler 5. Ytterligere karakterisering av SP har vist at i den murine plommesekken i løpet av tidlig hematopoietisk og vaskulær utvikling i E8.0, er det vesentlig ekspresjon av VE-cadherin og Flk-1, men lav ekspresjon av spindelen (c-Kit) og hematopoetiske markører (CD45). Dermed på dette utviklingsendepunktet, opprinnelige (ikke-hemogenic) EC, definert som Flk-1 + / CD31 + / CD45- non SP celler dominerer. Dette uttrykket profil turnus som endothelial markør uttrykk minker og CD45 og c-Kit uttrykk øker, samtidig med en økende evne til å generere HSPC in vitro mellom E9.5 og E11.5 5. Dette tyder på hematopoietisk aktivitet av YS vev befinner seg inne i SP, blir mest åpenbare mellom E9.5 og E11.5, og har funnet sted,ing gjennom en tidsbestemt tap av endotelceller egenskaper og gradvis oppkjøp av blodkreft kapasitet. Som sådan, ekspresjon av multiresistens transportører som gir opphav til SP-fenotypen er en viktig fenotypisk markør av hemogenic endotel 5; faktisk, trenger ikke-SP celler fra generalforsamlingen ikke viser bloddannende potensial 12. Således sikrer vellykket isolering av SP via Hoechst flekker både i YS og AGM at cellene vil bli sortert fra det hematopoetiske stamcellelinjen av en gitt vev, og påfølgende antistoff farging av celler i denne fraksjon vil tillate diskriminering av den hemogenic (Flk -1 + / c-Kit + / CD45-) versus HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) populasjoner 5,11,12. Videre har det tidligere blitt bemerket at CD41 + celler i SP av plommesekken og AGM vevet er i stand til multilineær kolonidannelse i metylcellulose basert kultur 11,12. Vi definerer hemogenic endotelceller som Flk1 + c-Kit + CD45- SP celles ved hjelp av CD45 som en utpekt markør for blodkreft avstamning snarere enn CD41 gitt våre opplever at uttrykk for Flk1 og CD45 er nesten gjensidig utelukkende 5,11. Dette tillater en ren isolering av celler i SP som har både endotelial (Flk-1) og stammen egenskaper (c-Kit) som er nødvendige for endotelial til hematopoetiske overgang, men som ennå ikke har gjennomgått denne forandring, som bestemt ved fravær av CD45 i disse celler. Det ville være nyttig å vurdere underfraksjonering av HSPC befolkning, definert som Flk-1 / c-kit + / CD45 + / SP-celler, inn Csf1r + (vev makrofag) og Csf1r- (HSC) fraksjonen som nylig rapportert av Gomez og kolleger 25, da dette ville gi større oppløsning av det sanne HSPC versus vev makrofag progenitorceller populasjoner, men dette bør ikke påvirke integriteten av hemogenic endotelial cellefraksjon hvis isolasjon vi har skissert siden Csf1r er en markør for makrofag progenitorceller 26.

HemogENIC- endotelceller er en sjelden undergruppe i både YS og AGM (bestående av 1-3% av endotelceller), og derfor en stor utfordring i sin studie er utilstrekkelig celle yield for senere søknader. Denne protokollen vanligvis resulterer i 70-80% av cellene gjenværende levedyktige ved tidspunktet for sortering, og en typisk hemogenic endotelcelle slag fra sammenslåtte vev oppnådd fra flere embryoer kan gi bare noen få hundre celler, selv under optimale betingelser med bare 10-20% av hentes celler innebygd i metylcellulose produsere kolonier. For å maksimere sortert celle nummer, er det sterkt anbefalt at etterforskerne ta skritt for å sikre vev og celle levedyktighet gjennom hvert trinn i prosedyren: vev bør raskt dissekert og samlet, og prøvene bør holdes på is når det er mulig. Prøvene bør fremstilles friskt umiddelbart før FACS sortering, og sortert i prøverør inneholdende høye seruminnhold, eller direkte inn i methylcellulose kultur som beskrived ovenfor. Hvis levedyktighet problemene vedvarer, samling rør kan også være pre-belagt med serum til å ytterligere styrke sortert celle overlevelse. Hvis hemogenic endotelcelle utbytte forblir lavt, kan voksen benmarg eller kommersielt tilgjengelige fluoroforen-konjugerte perler anvendes for spektral kompensering i stedet for den embryonale vev-avledede enkelt farge kontrollene som er beskrevet heri. Hvis sorterte cellene er ment for kultur, bør hemogenic endotelceller og HSPC skal sorteres direkte inn i vevskultur brønner. Hvis sorterte cellene er beregnet for DNA eller RNA relatert genekspresjon analyse, hemogenic og ikke-hemogenic endotelceller og HSPC kan sorteres direkte inn i oppsamlings rør som inneholdt prøvelyseringsbuffer for å redusere celletap.

Den skisserte teknikk tillater vellykket (og samtidig) isolering av hemogenic og ikke-hemogenic endotelceller, samt HSPC og modne blodcellefraksjoner fra de samme embryonale vev. Denne tilnærmingen gjør videre study av de molekylære fundamentet for de kritiske overganger som oppstår som endotelceller generere blod. Innsiktene fra denne utviklingsstudier kan deretter brukes til å optimalisere produksjonen av humane hemogenic endotelceller og HSPC avkom fra pluripotente, og potensielt autologe, stamceller for behandling av utbredte hematopoietiske forstyrrelser.

Disclosures

Dette arbeidet ble støttet byNIH tilskudd HL128064, HL096360, EB017103, og CT Innovations gi 15-RMB-YALE-04, til KKH, og NICHD / NIH T32HD007094.

Acknowledgments

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) Sigma D5942 TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling.
Absorbent bench underpad Covidien 7134
#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein  50033 TOXIC inhalant: Use in fume hood.
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine)  Invitrogen 10378016
Type II Collagenase Worthington LS004174
Falcon 70 μM nylon cell strainer Corning CLS431751
Anti-Mouse CD45-FITC eBioscience 11-0451-81
Anti-Mouse CD31 - PE eBioscience 12-0311-81
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 BD Pharmingen 561259
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) Sigma 14533 TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H2O, store aliquots at -20 °C until ready for use.
Verapamil Hydrochloride Sigma 1711202  TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling.   Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol.  Store at -20 °C until ready for use 
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
MethoCult GF M3434 Stem Cell Technologies 3434 Thaw and aliquot per manufacturer's instructions
Modified Giemsa Stain Sigma GS500 TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution.
Cytospin Centrifuge Thermo Scientific A78300003
Clipped Funnel Starter Kit Thermo Scientific 3120110 Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge
Anti-Mouse B-220 - FITC BD Pharmingen 553088
Anti-Mouse Gr-1-FITC eBioscience 11-5931-85
Anti-Mouse Ter-119-FITC eBioscience 11-5921-85
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Scientific 10437-077
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L) Life Technologies  11965-092
Hank's Buffered Salt Solution Life Technologies  14175-095
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate EMD Millipore PIFB24P05
IgG2A-PE BD Pharmingen 553930
IgG2B-FITC BD Pharmingen 556923

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschi, K. K. Hemogenic endothelium during development and beyond. Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).
  2. Boisset, J. C., et al. et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).
  5. Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development. Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).
  6. Nakano, H., et al. Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis. Nat Commun. 4, 1564 (2013).
  7. Li, Z., et al. Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).
  8. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  9. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  10. de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo. Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).
  11. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  12. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  13. Tavian, M., et al. Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood. 87 (1), 67-72 (1996).
  14. Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).
  15. Kelly, M. A., Hirschi, K. K. Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).
  16. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  17. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  18. Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), (2010).
  19. Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation. Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).
  20. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  21. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  22. Kina, T., et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage. British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).
  23. Jackson, K. A., et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).
  24. Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
  25. Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  26. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).

Tags

Developmental Biology hemogenic endotelet definitive hematopoiesis vaskulær utvikling museembryoer FACS blodkreft stamceller og stamceller
Isolering av Murine Embryonic Hemogenic endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, J. S., Gritz, E. C., Marcelo,… More

Fang, J. S., Gritz, E. C., Marcelo, K. L., Hirschi, K. K. Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (112), e54150, doi:10.3791/54150 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter