Summary
células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) se derivan de las células endoteliales especializadas (hemogenic) durante el desarrollo, sin embargo, se sabe poco sobre el proceso por el cual algunas células endoteliales especifican a convertirse en la formación de la sangre. Demostramos un método basado en citometría de flujo permite el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC de tejidos embrionarios murinos.
Abstract
La especificación de las células endoteliales hemogenic de endotelio vascular embrionario se produce durante períodos de desarrollo breves dentro de los tejidos distintos, y es necesario para la aparición de HSPC definitiva de la murino sac adicional embrionario yema, placenta, vasos umbilicales, y los embriones aorta-gónada-mesonefros ( AGM) región. La naturaleza transitoria y el pequeño tamaño de esta población celular emite su aislamiento reproducible para la cuantificación cuidadosa y aplicaciones experimentales técnicamente difícil. Hemos establecido una célula activada por fluorescencia (FACS) basado en el protocolo para el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC durante sus horas punta generación en el saco vitelino y AGM. Demostramos métodos para la disección del saco vitelino y tejidos AGM de embriones de ratón, y se presentan condiciones de digestión del tejido y la conjugación de anticuerpos optimizados para la supervivencia celular máxima antes de la identificación y recuperación mediante FACS. Representante FACS anaparcelas de lisis se muestran que identifican las células endoteliales hemogenic y fenotipos HSPC, y describen un ensayo basado en metilcelulosa para la evaluación de su potencial de formación de la sangre en un nivel clonal.
Introduction
Un sistema circulatorio funcional requiere el desarrollo paralelo de los vasos sanguíneos y las células sanguíneas. En las primeras etapas del desarrollo de la sangre (hematopoyesis primitiva), el origen de eritroblastos permanece debatido vigorosamente 1. Por el contrario, en las etapas posteriores del desarrollo de células sanguíneas (hematopoyesis definitiva), se ha vuelto cada vez más claro que HSPC multi-linaje surgen de células especializadas del endotelio vascular que adquieren (células endoteliales hemogenic) potenciales que forman la sangre dentro del saco vitelino, la placenta y AGM 2-5, así como en la vitelina y vasos umbilicales, el endocardio embrionario 6, y la vasculatura cabeza 7. La especificación de las células endoteliales hemogenic dentro de estos tejidos se produce en distintas etapas de desarrollo específicas; por ejemplo, en el saco vitelino a ~ E8.25 y dentro de la AGM en ~ E10 8-12. No obstante, incluso durante estas ventanas específicas de desarrollo, la población de endo hemogeniccélulas telial representa una pequeña fracción de todas las células endoteliales (1-3% de saco vitelino y células endoteliales AGM) 11,12. El proceso de "especificación" hemogenic de células endoteliales es crítica para murino, así como humana, la hematopoyesis. Las células hematopoyéticas se ha demostrado que la yema del endotelio de los vasos del saco vitelino y la aorta en los embriones humanos 13, y varios laboratorios han demostrado que la producción de glóbulos de células madre pluripotentes humanos requiere una célula endotelial intermedia 14-16. Por lo tanto, la definición del fenotipo de las células endoteliales hemogenic murinos y la comprensión de los eventos moleculares que conducen a su desarrollo en este modelo animal debe facilitar la búsqueda de tecnologías para la generación in vitro de las células endoteliales hemogenic partir de células madre pluripotentes humanas. A su vez, el eventual desarrollo de un enfoque para la generación a gran escala de los tipos de células sanguíneas diferenciadas de HSPC multi-linaje - sí deriVed a partir de células madre pluripotentes humanas a través de una célula endotelial hemogenic fisiológicamente relevante intermedia - podría tener un potencial terapéutico increíble para hematológica, oncológica y la medicina regenerativa. Para lograr este objetivo, hemos definido el fenotipo de las células endoteliales hemogenic, a nivel clonal, dentro de la yema de murino saco 11 y 12 de AGM, dos sitios principales de la producción HSPC definitiva durante la embriogénesis. Al igual que HSPC dentro de la médula ósea de adultos 17, las células endoteliales hemogenic embrionarias y HSPC exhiben propiedades Hoechst tinte de flujo de salida y, por tanto aparecer dentro de la "población lado" (SP) de las células en una parcela FACS 5,11,12 (como se muestra en la Figura 3). Además, también hemos demostrado que las células endoteliales hemogenic expresan marcadores de células endoteliales y tanto (Flk1 y CKIT, respectivamente) se derivan, pero no expresan el marcador de linaje hematopoyético, CD45 5,11,12. Así, las células endoteliales pueden ser hemogenic identified y aislados por FACS como células Flk1 + / cKit + / CD45- SP, y que han demostrado que estas células dan lugar a HSPC contenida dentro de la / cKit + / CD45 + SP fracción Flk1- de saco vitelino y células AGM 5,11,12. Células endoteliales Hemogenic y HSPC pueden ser identificados y aislados del saco vitelino o tejidos AGM cosechadas a partir de cualquiera de los embriones recién sacrificados, o de embriones cultivados durante hasta 48 horas en ex vivo cultivo de embriones (como se representa en la Figura 1). Cultivo ex vivo permite selectiva pre-tratamiento de embriones individuales con agentes farmacológicos, y también permite la expresión transitoria de los transgenes deseados (es decir, por la transducción lentiviral). identificación FACS de las células endoteliales y hemogenic HSPC por el método descrito en el presente documento se puede usar como una medida cuantitativa de desarrollo hematopoyético definitiva en modelos de ratones manipulados genéticamente; las células también pueden ser recuperados para aplicaciones experimentales posteriores, incluyendo sangre-foensayos, confirmando el análisis de expresión, y el trasplante.
Los sujetos animales: los usos y las consideraciones éticas
Un creciente cuerpo de literatura ha establecido la importante contribución de las células endoteliales hemogenic a la formación de HSPC durante la etapa de la hematopoyesis definitiva del desarrollo embrionario. Sin embargo, las condiciones fisiológicas y las señales que promueven la especificación de una subpoblación de células endoteliales hacia un destino hemogenic siguen siendo poco conocidos, y por lo tanto todavía no se pueden imitar en un entorno in vitro. De hecho, las técnicas descritas en este documento están actualmente en uso por nuestro laboratorio y otros grupos para mejorar la comprensión del campo del desarrollo hematovascular, de tal manera que se podría desarrollar un enfoque para la especificación de células ex vivo hemogenic endotelial y la producción HSPC un día. Hasta el momento, sin embargo, el campo sigue dependiendo de los tejidos primarios de tipo salvaje (y genticamente modificados) embriones de ratón para obtener especifican las células endoteliales y hemogenic HSPC en estudio. Células endoteliales y Hemogenic HSPC se pueden identificar de forma fiable y aislados de cualquiera E8.5 (10 - 12 pares de somitas) saco vitelino o E10.5 (35 - 40 pares de somitas) AGM 11,12. Debido a la escasez relativa de las células endoteliales hemogenic (por lo general representa el 1 - 3% del total de las células endoteliales dentro de estos tejidos 11,12) la puesta en común de los tejidos desde múltiples (~ 8 - 10) de camada en una sola muestra es muy recomendable con el fin de obtener células suficientes para la experimentación posterior. Verificación de que las células endoteliales hemogenic y HSPC se han identificado y aislado con éxito se puede realizar por cultivo de células recuperados en condiciones que inducen la diferenciación hematopoyética. En estas condiciones, las células endoteliales hemogenic y HSPC exhibirán multi-linaje diferenciación hematopoyética, lo que resulta en la aparición de colonias que contienen eryThroid progenitores (BFU-E), de granulocitos y macrófagos progenitores (CFU-GM), y granulocitos, eritrocitos, macrófagos, colonias de megacariocitos progenitoras (CFU-GEMM).
Protocol
Declaración de Ética: El protocolo se describe a continuación ha sido revisado por, y está en cumplimiento con las pautas de, Institucional Cuidado de Animales de la Universidad de Yale y el empleo.
1. Total de embriones Ex V ivo Cultura para la yema de Estudios Sac (Opcional)
- La eutanasia a presas embarazadas en E7.0 - E7.5, y eliminar cuernos uterinos en condiciones estériles, como se describe en mayor detalle a continuación (pasos 2.4 a 2.7).
- Embriones separados enteros (con saco vitelino intacta 12) de decidua rodea, y suspender en 50 ml de suero de rata entera en tubos de 50 ml de poliestireno.
- Botellas de embrión de Gas de 3 min con 5% de CO 2 inmediatamente como se describió previamente 12,18. Repita este paso a las 24 horas, si el cultivo de embriones por 24 - 48 h.
- Incubar en el despliegue de la cultura 37 ° C durante un máximo de 48 horas.
Nota: Los embriones pueden ser tratadas ex vivo con agentes farmacológicos (es decir, DAP inhibidor de Notch.T 12) o solubles de proteínas (es decir, fibronectina 19) a través de pre-incubación de embriones para un máximo de 2 horas en medio de cultivo que contienen dichos factores, o a través de adición de estos factores al medio de cultivo de laminación para toda la longitud de la cultura ex vivo período. La expresión génica puede ser manipulado en embriones de pre-incubación de embriones con lentivirus se titularon de manera óptima para 2 hr 12. Saco vitelino vascular y el desarrollo hematopoyético se pueden monitorizar en tiempo real utilizando reportero ratones transgénicos y las técnicas de imagen óptica.
2. Disección del saco vitelino (YS) o la aorta-gónada-mesonefros (AGM) a partir de embriones de ratón
- Esterilizar banco de laboratorio por pulverización y limpiando todas las superficies con 70% de etanol para reducir la contaminación en cultivos de células posteriores. Coloque una almohadilla inferior absorbente en la superficie de mesa de laboratorio.
- Esterilizar instrumentos quirúrgicos con 70% de etanol. instrumentos quirúrgicos recomendados son dos # 5 vigor rectaps, y una tijera de 8,5 cm rectas.
- Si se trabaja con embriones de cultivo ex vivo, retirar con cuidado los embriones enteros de 50 ml tubos Falcon y proceder inmediatamente al paso 2.8. De lo contrario, omita este paso y vaya al paso 2.4.
- La eutanasia presa embarazada a la edad embrionaria adecuada (E8.5 si YS cosecha; E10.5 si la cosecha AGM).
Nota: La técnica descrita emplea un método de eutanasia método doble - dosis letal de un anestésico volátil seguido por dislocación cervical mecánica - para minimizar el dolor y el sufrimiento de los animales, y para asegurar la terminación mínimamente invasiva y humana de sujetos animales. Esta técnica combinada para la eutanasia pequeño roedor es recomendado por la American Veterinary Medical Association cuando es realizada por un investigador entrenado y competente (AVMA Directrices para la eutanasia de los animales: 2013 Edition).- Anestesie ratón utilizando una dosis letal de isoflurano (> 5% en O 2) durante 3 - 5 min. (ITUACON: El isoflurano es un inhalante tóxico; utilizar bajo una campana de extracción química con el equipo de protección personal respiratoria adecuada.)
- Tras la exposición de los ratones al isoflurano, marcar al menos tres señales de nivel de anestesia - pérdida del reflejo de enderezamiento, la pérdida del reflejo del dedo del pie de presión y de reducción de la frecuencia respiratoria - para asegurar los sujetos han alcanzado un plano anestésico profundo antes de proceder con la eutanasia mecánica.
- Cervical dislocar la presa para inducir la muerte rápidamente.
- Colocar en posición supina presa sacrificados en underpad y liberalmente rociado inferior del abdomen con un 70% de etanol.
- Hacer una incisión vertical a lo largo de la línea media de la pared abdominal inferior. Hacen incisiones horizontales adicionales ~ 1 pulgada que se extiende a la derecha y la izquierda del punto medio de la incisión vertical, y diseccionar la pared abdominal para exponer completamente cuernos uterinos derecho e izquierdo cada uno conteniendo varios embriones en gestación.
- Con unas pinzas, mantenga presionado uno de los dos cuernos uterinosy utilizar tijeras para separarla de la mesometrio. Coloque útero diseccionado en hielo en solución salina equilibrada de Hank estéril (HBSS) en una placa de cultivo tisular de poliestireno de 60 mm. Repita para el otro cuerno uterino.
- Bajo un microscopio de disección estándar de la luz, el uso de fórceps para tirar lejos capa muscular del saco uterino para revelar el saco gestacional subyacente y la decidua. Aislar YS (Figura 2A) retirando suavemente el saco del embrión cerrado. YS extraer tejido del embrión propiamente dicho en el origen embrionario de los vasos vitelinos.
- Para aislar la AGM, retire el YS y seccionar el embrión por debajo del nivel del corazón y las extremidades anteriores y desechar la región del tórax y la cabeza. A continuación, seccionar el embrión justo por debajo del nivel de las extremidades posteriores y retirar y eliminar el tejido de la cola. Retire las extremidades posteriores y el tejido ventral exceso de la sección restante, que contiene el AGM (Figura 2B).
- YS piscina o AGM tejidos de embriones múltiples y almacénen hielo en HBSS + (HBSS suplementado con 10% (v) de suero v / bovino fetal y 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,3 mg / ml de L-glutamina) en un tubo limpio de 1,5 ml.
3. La digestión del tejido primario en una suspensión de células individuales
- tubo de centrífuga que contiene YS cosechados o tejidos AGM durante 5 minutos a 2000 xga 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el tejido en 1 ml de cualquiera de 0,05% (para YS) o 0,2% (para AGM) de colagenasa tipo II diluido en HBSS +. Incubar durante 30 minutos en baño de agua a 37 ° C, invirtiendo el tubo cada 5 minutos para mezclar.
- Suavemente se disocian mecánicamente el tejido haciendo pasar la muestra 10 veces a través de una pipeta P1000. Si tiene dificultades para aspirar el tejido parcialmente digerido, pipeta de orificio de punta se puede ensanchar cortando ~ 5 mm de la punta con un par de tijeras.
- Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 2000 xga 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de hielo frío HBSS +.
- Pasar a través de una muestra de 70 y# 956; m filtro de células.
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro manual o automatizado.
- Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 2000 xga 4 ° C. muestra Resuspender en DMEM + (4,5 g / L de glucosa de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10% (v) de suero v / bovino fetal y 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,3 mg / ml de L-glutamina) pre- se calentó a 37 ° C de tal manera que las células se encuentran en una concentración final de 1 x 10 6 células / ml.
4. El tratamiento de las células con Nucleic Acid Dye y etiquetado con fluorescencia con anticuerpos conjugados
- Alícuota de al menos 100 l de muestra (1 x 10 5 células) en tubos de 1,5 ml frescos para la incubación de anticuerpos.
- Incluir la siguiente muestra y los tubos de control necesarias: no teñida; solamente cKit-APC; solamente CD45-FITC; solamente CD31-PE; Sólo Flk1-PECy7; Hoechst 33342 solamente; Hoechst 33342 solamente + verapamilo; Muestra (recibe todos los colores, no recibirán verapamilo). Use un mínimo de 1 x 10
- Agregar verapamilo diluido en etanol al 95% (véase la discusión para justificación) a la "Hoechst 33342 solamente + verapamilo" tubo de control a una concentración final de 50 mM. Incubar todos los tubos durante 5 minutos a 37 ° C. (PRECAUCIÓN: El verapamilo es un agente bloqueador del canal del calcio potente y es extremadamente tóxico Manipular con guantes.).
- Añadir Hoechst 33342 a la "Hoechst 33342 solamente" control, para el único control Hoechst 33342 + verapamil, y al tubo de "muestra" a una concentración final de 5 mg / ml. Incubar todos los tubos durante 1 hora a 37 ° C, protegido de la luz. Mezclar suavemente por inversión cada 15 minutos. (PRECAUCIÓN: Hoechst 33342 es un colorante nuclear tóxico y debe ser manejado con guantes).
- Centrifugar todos samples durante 5 minutos a 2000 xga 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender sedimentos de células a una concentración de 1 x 10 5 células / ml en HBSS frío +.
- Añadir anticuerpos conjugados con fluorescencia a los tubos de control de anticuerpos sólo es apropiado, y al tubo de "muestra" a una concentración final de 2 mg / ml. Incubar en hielo durante 30 min, protegido de la luz.
- Centrifugar todos los tubos durante 5 min a 2000 xg a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender sedimento celular en HBSS 500 l de hielo frío. muestras de tensión a través del acoplamiento del casquillo del filtro de 5 ml de fondo redondo de tubo de poliestireno FACS y almacenar en hielo, protegido de la luz, por FACS inmediatos.
5. Identificación y Aislamiento de células endoteliales y Hemogenic HSPC por FACS
Nota: Este protocolo se ha optimizado el uso de un sistema de BD FACSAria 5-láser equipado con un 100 mw láser UV 355 nm, un 200 mw 405 nm láser violeta, un 200 mw 488 nm láser azul, un 200 mw 532 láser verde nm, y una 150 mw 637 nm rojoláser. Las células se clasifican en PBS estéril como fluido de revestimiento y en condiciones asépticas, y a través de una boquilla de 100 micras con el caudal ajustado a una presión de muestra de 1 de tal manera que un máximo de 1.500 - 2.000 eventos se adquieren por segundo para minimizar el estrés de la célula.
- En estas configuraciones descritas anteriormente, el uso de tubos de control de color "sin teñir" e individuales para optimizar FACS intensidades láser clasificador de células y realizar control de compensación espectral multi-color de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice dispersión frontal y lateral para realizar células en vivo y doblete de discriminación por parte de los eventos totales (ver las instrucciones del fabricante para más detalles).
Nota: Este protocolo da lugar típicamente ~ 70 - 80% de células viables. Si se encuentran problemas con baja viabilidad celular, asegurar que los tejidos se disecan inicialmente rápidamente en hielo medios frío, y que todos los pasos, excepto las que especifican de otra manera se llevan a cabo en hielo, con pipeteo suave para minimizar cizallamiento y muerte celular(Véase la discusión para un mayor detalle en la preservación de la viabilidad celular). - Utilice una parcela diferencial lineal escala de Hoechst Rojo contra azul fluorescente Hoechst para identificar la población lateral (SP) eventos (Figura 3A). Utilice el control de "Hoechst 33342 solamente + verapamilo" como un control negativo para verificar que las puertas están correctamente dibujan para la muestra. SP aparecerá como un hombro a la izquierda de las células no-SP, y será disminuido en el control tratado con verapamil. La población no SP se utiliza para identificar no hemogenic CE (Figura 3B).
- Crear parcelas de fluorescencia diferenciales adicionales (ejes log-escala) y dibujar las puertas de la hija de la SP para identificar las células endoteliales hemogenic (Figura 3C-E).
Nota: Las células endoteliales Hemogenic se perfilan como las células Flk1 + / cKit + / CD45- SP (Figura 3D), y HSPC son Flk1- / cKit + / SP células (Figura 3E) CD45 +. C Hemogenic endotelialells se pueden analizar en paralelo con las células endoteliales no hemogenic, que se identifican en este enfoque como células no-SP CD31 + / CD45- (Figura 3B). - Recuperar celular endotelial hemogenic o fracción HSPC en metilcelulosa que contiene placas para cultivo hematopoyéticas (véase más adelante), o en otros tampones para el procesamiento y análisis posterior.
6. hematopoyéticas Diferenciación en Cultura
- Añadir 0,5 ml (135 l / cm 2) hematopoyético cultura de los medios basados en metilcelulosa al número deseado de pocillos de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos a temperatura ambiente. Añadir 0,5 ml de agua estéril en los pocillos no utilizados para minimizar la evaporación. Preparar y mantenerla a temperatura ambiente hasta su uso.
- Ordenar 1 - 10 células para el análisis clonal, o hasta 1.000 células endoteliales hemogenic (Flk1 + / cKit + / células CD45- SP) o (células Flk1- / cKit + / CD45 + SP) HSPC de expansión mayor y la diferenciación directamente en cada pocillo de laplaca que contiene metilcelulosa. La formación de colonias se detecta en aproximadamente el 10-20%.
- En una campana de cultivo de tejido estéril, utilizar una punta P1000 con la punta recortada para ampliar su diámetro interior, para volver a suspender suavemente cada pocillo de los medios de metilcelulosa cabezas de serie 2 - 3 veces, teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas. Esto asegura la suspensión de las células clasificadas en el metilcelulosa semisólida para un crecimiento óptimo.
- Incubar la placa a 37 ° C con 5% de CO 2 durante un máximo de 2 semanas.
- Monitor de cultivos de células individuales para la formación de colonias de células hematopoyéticas diferenciadas en el tiempo (Figura 4). Puntuación pozos de número y tipo de colonias hematopoyéticas diferenciadas en los días 1, 3, 7, y 14 por el método (s) se describe a continuación en el paso 6.7.
- placas de puntuación en el día 1 para confirmar la confluencia y viabilidad de las células clasificadas.
- El día 3, la verificación de la formación temprana de las colonias de células endoteliales adherentes hemogenic con "adoquinestono de "morfología (ver Goldie et al. 11 y Marcelo et al. 12 para la representación de los días 3 morfología).
- Por días 5 - 7, comprobar si hay formación de clusters HSPC redondeadas en los pozos que contienen ordenados CE hemogenic. HSPC debe observarse adyacente al aplanado hemogenic CE presentan una morfología celular endotelial "adoquines".
Nota: las células endoteliales Hemogenic deben formar colonias hematopoyéticas (determinado por el número de colonias hematopoyéticas), y deben demostrar capacidad de diferenciación multi-linaje (determinado mediante la observación de varios tipos de colonias de una sola célula). Hemos observado anteriormente que ~ 20% de CE hemogenic o HSPC recuperado por FACS sobrevivir para formar la diferenciación y la proliferación de colonias hematopoyéticas en metilcelulosa 11.
- Para evaluar la formación de colonias por microscopía de fase:
- Visualizar y contar las colonias a baja magnificación under un microscopio de luz de fase, e identificar BFU-E, CFU-GM y CFU-GEMM colonias de morfología de las colonias, como se describe por Goldie et al. 11.
- Para evaluar la formación de colonias por la morfología celular:
- Aspirar colonias individuales de la superficie metilcelulosa en una punta P1000 con el extremo recortado para ensanchar orificio. Esto facilita la aspiración del medio de metilcelulosa viscoso y asegura la recuperación con éxito de la colonia.
- Resuspender recogió colonias en 200 ml de HBSS y el giro sobre un portaobjetos de vidrio usando una citocentrífuga a 28 xg durante 5 min.
- Fijar los portaobjetos en metanol al 100% durante 5 minutos (PRECAUCIÓN: El metanol es tóxico y sólo se debe utilizar en una campana química con la ventilación adecuada y equipo de protección personal).
- Sumergir los portaobjetos en un 0,04% la tinción de Giemsa durante 20 minutos (PRECAUCIÓN:. Tinción de Giemsa contiene metanol puede utilizar en una campana química con la ventilación y la persona apropiadaAl equipo de protección).
- Enjuague los portaobjetos en agua desionizada.
- Monte desliza con cubreobjetos, y la imagen en la alta ampliación bajo un microscopio de luz estándar, la comparación de la morfología celular a la observada clásicamente en las células hematopoyéticas de la médula ósea de adultos que se cultivan en medio de metilcelulosa. Para ver ejemplos, consulte las instrucciones del fabricante.
- Para evaluar la formación de colonias por la expresión de células de los marcadores de linaje hematopoyético por FACS:
- Añadir 2 ml de HBSS a cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía las colonias se cultivaron en 0,5 ml de metilcelulosa (es decir, diluir comercialmente disponibles stock metilcelulosa 1: 4). Pipetear arriba y abajo para mezclar y transferir al tubo (s) fresco.
- la muestra se centrifuga a 2.000 g durante 5 min a 4 ° C utilizando una microcentrífuga de sobremesa estándar.
- Eliminar el sobrenadante y pellet (s) de células se resuspende en 1 ml de HBSS +, puesta en común de muestras, si así se desea.
- Centrifumuestra ge a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Retire sobrenadante y el sedimento (s) celular se resuspende en 400 l de HBSS +.
- alícuota en cuatro tubos de 1,5 ml como sigue: no teñida; solamente B220-FITC; GR-1-FITC solamente; Ter119-FITC solamente.
- Añadir anticuerpo fluorescente conjugado al tubo apropiado a una concentración final de 2 mg / ml. Incubar a 37 ° C durante 15 min.
- Centrifugar la muestra a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender sedimento celular en helado 0,5 ml de HBSS.
- Analizar cada muestra mediante FACS para la expresión de cada marcador de linaje hematopoyético: B220 marca las células B 20; GR-1 marcas de células mieloides 21; Ter119 marca células eritroides 22.
Nota: anticuerpos adicionales dirigidos otros marcadores de linaje hematopoyético se pueden incorporar en este enfoque, si así se desea.
Representative Results
Etiquetado con éxito de las células endoteliales hemogenic y HSPC de YS embrionarias o AGM producirán gráficos de dispersión de FACS similares a las parcelas representativos presentados en la Figura 3. Siguiendo vivo de células estándar y la discriminación doblete por dispersión frontal y lateral (no se muestra), la población lateral (SP) eventos se visualizan en un Hoechst Red vs. Hoechst trama lineal diferencial azul en ausencia de verapamilo como un "hombro"-desplazar a la izquierda de la mayoría de los eventos (no-SP) (Figura 3A). Cuando la puerta SP está bien dibujado, células SP representarán aproximadamente de 1 - 3% del total de células viables YS y el 3 - 5% del total de eventos AGM viables. Tratamiento con verapamilo debe dar como resultado la inhibición en> 50% de los eventos SP independientemente de la fuente de tejido (Figura 3A, paneles superiores). Hemos determinado que otras poblaciones que aparecen fuera del hombro SP sino que también son bloqueados por el verapamilo son erythr Ter119-positivoPor lo tanto, provincias, y están excluidos de nuestra población SP 5.
Comparado con el SP, SP células no se identifican como la densa grupo de células adyacentes a la SP "hombro" (Figura 3A). Esta población no contiene Hemogenic CE que puede distinguirse mediante un CD31-PE vs. CD45-FITC parcela hija (Figura 3B), como CD31 + / CD45- eventos. No Hemogenic CE son típicamente 2-5% de las células no-SP de AGM (Figura 3B) o saco vitelino (no mostrado), y un gran número de estas células se pueden clasificar de nuevo con relativa facilidad.
Para la identificación de HSPC y Hemogenic CE, puertas hija se han extraído de la fracción SP, la identificación de las células CD45 + y CD45-, donde las células CD45 + son típicamente <20% del total de eventos, tanto en AGM (Figura 3C) o YS (no mostrados). Hemogenic CE se identifican posteriormente a partir de células CD45- en un diferencial cKit-APC vs. Flk1-PECy7 hija pmucho como eventos de doble positivo, y típicamente representan 1-3% de los eventos CD45- cuando aislado de cualquiera de AGM (Figura 3 D) o YS (no mostrado). HSPC se identificó a partir de la fracción CD45 + en una separada cKit-APC vs. parcela hija Flk1-PECy7 como células Flk1- / cKit +, y en general también representan aproximadamente el 25 - 30% de la pequeña población de células CD45 + cuando se obtienen de cualquiera YS (no se muestra) o AGM (Figura 3 E). Así, tanto Hemogenic CE y HSPC son excepcionalmente raros (~ 0,01% de los eventos celulares totales), y es típico para este protocolo para volver unos pocos cientos de cada tipo de célula, incluso cuando el tejido de múltiples embriones se agruparon. Puertas en parcelas hija deben establecerse con referencia a los grupos de control negativo. Con el fin de distinguir entre la tinción de anticuerpos específicos y no específicos, las puertas deben extraerse inicialmente en referencia a ambos controles sin teñir (Figura 3C), así como las muestras que han sido tratados con anticuerpos de control con fluorescencia conjugados isotipo (IgG2A o IgG2B) (no mostrado). Este segundo de los controles ha demostrado que la tinción no específica es mínima por este protocolo, por lo tanto, mientras que se recomienda que los anticuerpos de control de isotipo (por ejemplo., IgG2a-PE o IgG2B-FITC) se utilizarán inicialmente para optimizar los ajustes de clasificación para FACS y determinar los límites de compuerta , también encontramos que los controles no teñidas son suficientes para verificar los límites de la puerta y la calidad experimental durante la rutina de clasificación FACS. Si las puertas están bien dibujados, de dispersión positiva mínima debe ser observado en las puertas de acción simple o doble positivas durante la grabación de los controles no teñidas o isotipo.
Hemogenic células endoteliales de la AGM y HSPC experimentan diferenciación hematopoyética más de 14 días de cultivo en metilcelulosa (Figura 4A). La proporción relativa de tipos de colonias observa típicamente en estosculturas depende de fuente de tejido. Hemogenic células endoteliales aisladas de tejidos del saco vitelino en dan lugar E8.5-E9.5 BFU-E, CFU-GM, y pocos CFU-GEMM 5, mientras que las células endoteliales hemogenic aislados del E10.5 AGM dan lugar a predominantemente CFU -GEMM 12, aunque todavía se observan otros linajes, como se muestra en la Figura 4B (panel superior izquierdo). HSPC aislado de E10.5 AGM también dar lugar predominantemente a CFU-GEMM sobre la cultura en metilcelulosa (Figura 4B, panel superior medio), aunque estas células también diferenciarse en otros tipos de colonias hematopoyéticas también. Las células endoteliales no hemogenic (CD31 + / CD45- no SP) también se han plateado (Figura 4B, panel superior derecho). Estas células demuestran no crecimiento en cultivo hematopoyética después de 14 días.
Los ensayos de la capacidad hematopoyética de tipos de células que expresan el marcador de superficie individuales, incluyendo las células con y sin expresión de un hematopoyéticond marcadores endoteliales CD31, Flk1, c-Kit, VE-cad, CD41, y CD45 dentro de la fracción SP del AGM en E10.5 se han realizado y demuestran que la actividad de formación de colonias multi-linaje en el E10.5 AGM está restringido de CD31 +, + VE-cadherina, c-kit +, células CD41 + y CD45 + SP 12. Curiosamente, la actividad de formación de colonias se observó tanto en las células + y Flk-1- SP Flk-1, pero sólo las células Flk1 + c-Kit + CD45- SP dio lugar a colonias de múltiples linajes a través de una monocapa endotelial intermedio caracterizado por tanto "de adoquines "morfología de las células endoteliales (Figura 4B, panel inferior izquierdo) y por la captación de Dil-AcLDL 12. Además, la expresión de c-Kit es necesario para la actividad hematopoyética de las células AGM SP 12.
Si bien se ha demostrado que algunos progenitores mieloides tienen características morfológicas similares en comparación con las células endoteliales hemogenic, las células progenitoras mieloides expresan CD45 y no pueden generar colonias multi-linaje
Figura 1. En general Flujo de trabajo. En pocas palabras, los embriones son retirados de las presas embarazadas, y YS o tejidos AGM se cosechan. Los embriones pueden estar opcionalmente cultivaron durante 2 4 - 48 h ex vivo antes de la cosecha de tejidos. YS cosechadas o tejidos de AGM son digeridos a una suspensión de células individuales, se dividió en alícuotas en tubos de control y de muestra, y se incubaron en presencia de Hoechst tinte y / o anticuerpos con fluorescencia conjugados. Verapamilo, un inhibidor de los canales de calcio, también se utiliza para generar un control negativo esencial para la verificación de gating precisa de la fracción SP. células endoteliales Hemogenic se identifican por FACS como Flk1 + / cKit + / CD45- SP células, mientras que HSPC están contenidos dentro de la fracción Flk1- / cKit + / CD45 + SP de las células; Ambos tipos de células se clasifican en metilcelulosa para la confirmación del potencial hemogenic. Además, las células endoteliales no hemogenic pueden ser discriminados (y recuperados, si así se desea) como células no-SP CD31 + / CD45-. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. Disección de YS y AGM tejidos. A) El YS se disecciona lejos de embriones E8.5, y se coloca todo en HBSS estéril + para su posterior digestión. B) El tronco de embriones E10.5 se aísla mediante cortes horizontales por debajo tanto de las yemas de las extremidades anteriores y los miembros posteriores. La AGM es luego separado de las yemas de las extremidades y tejidos utilizando pinzas ventrales. C) Las imágenes de campo claro muestran la disección de ambos YS y AGM de un embrión E10.5 (escala = 1 mm). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Las parcelas representativos que demuestran Puerta Jerarquía de la Discriminaciónde Hemogenic células endoteliales s (Flk1 + / CKIT + / células CD45 SP), HSPC (Flk1- / CKIT + / células CD45 + SP), y las células endoteliales no hemogenic (CD31 + / CD45- no SP) por FACS de E8.5 YS o E10.5 AGM. Después de célula y doblete discriminación en vivo de las células de cualquiera de YS (paneles de la izquierda) o AGM (paneles de la derecha) por dispersión frontal y lateral (no se muestra), A) la población lateral (SP) de puerta se dibuja y verificado por una disminución significativa de la fracción de SP en el control negativo tratado con verapamil. La población no SP se identifica como el grupo denso de células adyacentes a la SP. En cada una de las parcelas presentados se muestran 20.000 eventos B) las células endoteliales no hemogenic se identifican como células CD31 + / CD45- dentro de la fracción no-SP, y representan 2 -. 5% de las células no-SP si obtuvo de AGM (mostrados ) o YS (no mostrado). para dISCRIminate Hemogenic CE o HSPC, C) puertas hija se han extraído de la fracción SP para identificar las células CD45 + y CD45-. D) Para la identificación de las células endoteliales hemogenic de cualquiera de AGM (imagen) o YS (no se muestra), puertas hija adicionales se dibujan de la fracción CD45- para distinguir las células cKit + (vs. cKit-) y Flk1 + (vs. Flk1-). Hemogenic CE de cualquiera YS o AGM son típicamente aproximadamente 1 - 3% de los eventos CD45 E) HSPC se identifican a partir del CD45 + fracción como cKit + y Flk1-, y por lo general representan el 20 -. 30% de las células CD45 + si se separa de los AGM (muestra ) o YS (no se muestra). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Visualización de la diferenciación hematopoyética después del cultivo de las células endoteliales y Hemogenic HSPC en metilcelulosa. A) forma colonias a partir de células individuales clasificadas dentro de los 7 días de placas en metilcelulosa. Potencial hematopoyético Multi-linaje puede ser confirmado por la observación de múltiples tipos de colonias hematopoyéticas, identificado por la evaluación de distintas morfologías de colonias 11. B) Fase de imagen microscópica de ordenados CE hemogenic y HSPC de AGM (o YS, que no se muestra) mostrar hematopoyético multi-linaje la formación de colonias después de 7 días de cultivo en medio de cultivo de metilcelulosa. No hemogenic CE de AGM (o YS, no se muestra) no demuestran el crecimiento en estas condiciones. A mayor aumento, las células adherentes con "adoquines" morfología celular endotelial clásico (flecha blanca) se pueden ver dando lugar a racimos de células hematopoyéticas en culturas de hemogenic CE; no se observan tales células endoteliales en cultivos de HSPC ordenada (escala = 100 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Quedan muchas preguntas sin respuesta en el campo del desarrollo hematovascular - un campo que todavía está en su infancia debido a las dificultades técnicas inherentes al estudio de las poblaciones de células pequeñas y transitorias que surgen sólo durante las ventanas específicas de desarrollo. Las técnicas descritas anteriormente mejoran muchas de estas dificultades al permitir que para el aislamiento de células individuales incluso de la célula endotelial hemogenic y poblaciones HSPC en tejidos de embriones en los puntos de tiempo de desarrollo críticos utilizando reactivos y equipos que están normalmente disponibles en la mayoría de los laboratorios. El protocolo también permite el aislamiento paralelo de no hemogenic fracciones de células endoteliales de la YS y AGM, que se pueden utilizar para análisis independientes, o como controles para la fracción de células endoteliales hemogenic en los análisis posteriores.
Un punto clave en el aislamiento de las células endoteliales hemogenic utilizando este método basado en FACS multicolor es co espectral apropiadompensation y dibujo exacto de las puertas de un solo color. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que los controles sin manchas y de un solo color de incluirse en todas las corridas experimentales, y que - junto con las muestras tratadas con anticuerpos de control de isotipo - se utiliza para establecer inicialmente una indemnización adecuada espectral y el dibujo de las puertas. Sin embargo, la tinción no específica es mínima por este protocolo, por lo tanto los controles no teñidas y de un solo color son suficientes para la verificación de rutina de puertas una vez que la configuración de clasificador FACS se han optimizado.
SP puertas erróneamente extraídas son una preocupación particular con el enfoque descrito en este informe. Estudios anteriores han demostrado que las células madre multipotentes exhiben flujo de salida preferente de Hoechst rojo 17, que forma la base fisiológica para su aparición en el SP por FACS. Hemos demostrado que las células endoteliales hemogenic y HSPC se encuentran de manera similar dentro de la fracción de células SP 5,11. Las drogas tales como el canal de calcio eninhibidor verapamilo bloquear este comportamiento colorante Hoechst eflujo en células SP a través de la obstrucción de una variedad de transportadores de resistencia a múltiples fármacos transmembrana. En las células madre y progenitoras hematopoyéticas, esto ocurre principalmente a través del transportador ABCG2 / BCRP1 24. Típicamente induce verapamil> 50% el bloqueo de la SP, sin embargo, el grado general de Hoechst de flujo de salida y su posterior bloqueo por Verapamilo visto ha demostrado ser afectado por el tiempo de desarrollo, presumiblemente debido a los cambios en la expresión de tipos de transportadores resistentes múltiples a múltiples fármacos con diferencial Hoechst la capacidad de flujo de salida, y la sensibilidad a verapamilo 5. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que el verapamilo tratada-Hoechst manchados de control negativo se incluirán de forma estándar para asegurar la compuerta SP adecuada: si una puerta de SP está bien dibujado, una notable reducción en el número de células SP debe ser detectada en muestras teñidas con Hoechst en la presencia de verapamilo.
Hemos demostrado previamente que solucionaronCélulas SP desde el saco de yema de E9.5 murino tienen un ~ 80 a 90 veces mayor capacidad de generar HSPC en la cultura hematopoyético basado en metilcelulosa en comparación con un número coincidente de E9.5 no fraccionada, no Hoechst manchado células de tejido YS conjunto 5. Además de la caracterización de la SP ha demostrado que en el saco vitelino murino durante hematopoyético temprano y el desarrollo vascular en E8.0, hay expresión apreciable de VE-cadherina y Flk-1, pero baja expresión de vástago (c-Kit) y los marcadores hematopoyéticos (CD45). Por lo tanto, en este punto de tiempo de desarrollo, primordial (no hemogenic) CE, definida como Flk-1 + / CD31 + células no SP / CD45- predominan. Este perfil de expresión de los cambios como la expresión del marcador CD45 endotelial y disminuye y c-Kit expresión aumenta, concomitante con una creciente capacidad para generar HSPC in vitro entre E9.5 y E11.5 5. Esto sugiere la actividad hematopoyética de tejido YS está contenida dentro de la SP, convirtiéndose en más aparente entre E9.5 y E11.5, y occurring a través de una pérdida temporizada de características endoteliales y la adquisición gradual de la capacidad hematopoyética. Como tal, la expresión de los transportadores de resistencia a múltiples fármacos que dan lugar al fenotipo SP son un importante marcador fenotípico de endotelio hemogenic 5; De hecho, las células no-SP de la Asamblea General Anual, que no presentan potencial de formación de sangre 12. Por lo tanto, el aislamiento con éxito de la SP a través de la tinción de Hoechst, tanto en el YS y AGM asegura que las células se ordenarán desde el compartimiento de células madre hematopoyéticas de un determinado tejido, y la tinción posterior de anticuerpos de las células dentro de esta fracción permitirá la discriminación de la hemogenic (Flk -1 + / c-kit + / CD45-) frente HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) 5,11,12 poblaciones. Además, ha sido observado previamente que las células CD41 + en el SP de saco vitelino y tejidos de AGM son capaces de la formación de colonias multi-linaje en cultivo a base de metilcelulosa 11,12. Definimos las células endoteliales hemogenic como Flk1 + c-Kit + células CD45 SPs mediante el uso de CD45 como marcador de linaje hematopoyético designado en lugar de CD41 dada nuestra conclusión de que la expresión de CD45 y Flk1 es prácticamente excluyen mutuamente 5,11. Esto permite un aislamiento pura de células dentro de la SP que tienen tanto endotelial (Flk-1) y el vástago características (c-kit) necesarios para endotelial a transición hematopoyéticas pero que todavía no han sido sometidos a este cambio, tal como se determina por la ausencia de CD45 en estos Células. Sería útil considerar sub-fraccionamiento de la población HSPC, que se define como células Flk-1 / c-kit + / CD45 + / SP, en Csf1r + (macrófagos del tejido) y la fracción Csf1r- (HSC) como informó recientemente por Gómez y sus colegas 25, ya que esto proporcionaría una mayor resolución de la verdadera HSPC frente a poblaciones de macrófagos del tejido progenitoras, pero esto no debe afectar a la integridad de la fracción de células endoteliales hemogenic cuyo aislamiento hemos esbozado desde Csf1r es un marcador de células progenitoras de macrófagos 26.
Hemogcélulas endoteliales ENIC son una subpoblación rara en tanto YS y AGM (que comprende 1-3% de las células endoteliales), y por lo tanto un reto importante en su estudio es el rendimiento de células insuficiente para las aplicaciones subsiguientes. Este protocolo general resulta en un 70-80% de las células viables restantes en el momento de la clasificación, y un típico hemogenic endotelial tipo de células a partir de tejidos agrupados obtenida de múltiples embriones puede producir sólo unos pocos cientos de células, incluso en condiciones óptimas con sólo el 10-20% de células embebidas en colonias productoras de metilcelulosa recuperado. Para maximizar el número de células ordenada, se recomienda encarecidamente que los investigadores tomen medidas para garantizar la viabilidad celular del tejido y en todas las etapas del procedimiento: tejidos deben ser disecadas y se agruparon rápidamente, y las muestras deben mantenerse en hielo siempre que sea posible. Las muestras deben prepararse de nuevo inmediatamente antes de la separación FACS, y se clasifican en tubos de recogida con contenido de suero alto, o directamente en la cultura como metilcelulosa describird arriba. Si persisten los problemas de viabilidad, tubos de recogida también pueden ser pre-recubiertos con suero para mejorar aún más la supervivencia celular ordenada. Si el rendimiento de las células endoteliales hemogenic sigue siendo baja, médula ósea de adultos o perlas fluoróforo conjugado comercialmente disponibles se pueden usar para la compensación espectral en lugar de los controles de un solo color derivadas de tejido embrionarias descritos en este documento. Si células clasificadas son para cultivo, las células endoteliales y hemogenic HSPC deben clasificarse directamente en pocillos de cultivo de tejidos. Si las células según se pretende para el ADN o análisis de la expresión de genes de ARN-relacionados, las células endoteliales hemogenic y no hemogenic y HSPC se pueden ordenar directamente en tubos de recogida que contienen tampón de lisis de la muestra para minimizar la pérdida de células.
La técnica descrita permite con éxito (y simultánea) aislamiento de células endoteliales hemogenic y no hemogenic, así como fracciones de HSPC y de células sanguíneas maduras a partir de los mismos tejidos embrionarios. Este enfoque permite además espárragoy de las bases moleculares de las transiciones críticas que se producen como células endoteliales generan sangre. Los conocimientos obtenidos a partir de estos estudios de desarrollo se pueden utilizar para optimizar la generación de células endoteliales hemogenic humanos y la progenie de HSPC pluripotentes, y potencialmente autólogo, las células para el tratamiento de trastornos hematopoyéticos prevalentes tallo.
Disclosures
Este trabajo fue apoyado byNIH subvenciones HL128064, Innovaciones HL096360, EB017103, y CT otorgan 15-RMB-Yale-04, a KKH, y NICHD / NIH T32HD007094.
Acknowledgments
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
| Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
| 100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
| Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
| Falcon 70 μM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
| Anti-Mouse CD31 - PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
| Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
| Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H2O, store aliquots at -20 °C until ready for use. |
| Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol. Store at -20 °C until ready for use |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
| Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
| Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
| Anti-Mouse B-220 - FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
| Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
| Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
| IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
| IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |
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