Summary
このプロトコルは、試薬の精製、反応条件、バイオコンジュゲートの精製およびバイオコンジュゲートの特徴付けを含む、マレイミドにタンパク質を含有するシステインのバイオコンジュゲーションのために必要な重要な手順を詳しく説明します。
Introduction
バイオコンジュゲーションは、共有結合相互に、またはそのような染料、薬物またはポリマーなどの合成分子と1の生体分子を結合することを含みます。タンパク質バイオコンジュゲーション法の広範囲な蛍光色素標識1,2に至るまでのアプリケーションで多くの化学、生物学、ナノテクノロジーの研究グループで使用されている、タンパク質の作成 （抗体）3（抗体薬物複合体- ADCを）-prodrugsタンパク質二量体4,5の合成、ナノメディシン8およびシステム化学9で使用される自己集合タンパク質-ポリマーハイブリッド6,7に至ります。
標的タンパク質の活性部位を妨害しないように、バイオコンジュゲーションのために使用される化学反応の特異性は、必ずしも重要ではないが、ほとんどの機能性タンパク質のバイオコンジュゲートのために最も重要です。 、目的のタンパク質上のI）を標的と希少または固有のサイト：理想的な生物結合反応は、以下を含む、いくつかの基準を満たす必要がありますⅱ）ⅲ）タンパク質のアンフォールディングを回避するために、非変性条件下で進行、この目標に向かって選択的かつ標的タンパク質は通常、サブミリモル濃度でのみ使用できますようⅳ）高収量になります。マレイミド-システインマイケル付加は、これらすべての基準を満たすに近づくと、その理由のために長いバイオコンジュゲート化学10の分野で特別な地位を主張しています。私は、その表面上に一つのシステイン残基は、遺伝子が操作することができる含む）多くのタンパク質は、ii）の反応は、システインに向かって高度に選択的であり、正確なpHで、III）は、水性緩衝液中で円滑に進行し、iv）は、それが非常に高速であるためであります5,000 M -1秒を超える-1 11いくつかのケースで報告されたシステイン含有タンパク質に対するマレイミドの二次速度定数を有します。提供目的のタンパク質は、有機共溶媒12の小（≈五から十パーセント）の量、ほぼすべてのマレイミド官能染料、経口に耐えることができますlymerは、表面又は別のタンパク質は、タンパク質に結合させることができます。また、マレイミドは、上昇したpHで他の求核試薬と反応させることになりやすいですヨードアセトアミド、よりタンパク質上のシステインのために、より特異的です。およびジスルフィド交換13を防止するために、酸性pHで維持する必要がジスルフィドベースの活用よりも安定。
ここでは、（II）、Ruの間の反応を使用して、単一のシステイン残基を含有するタンパク質とマレイミド官能化分子の結合のための一般的なプロトコルを報告例として、発色団と酸化還元タンパク質シトクロムcをベース。このプロトコルは、アクセス可能な表面のシステイン残基と対応するマレイミド官能化標的を含むほとんどの他のタンパク質にも同様に適用可能であり、それは別のタンパク質、蛍光色素、発色団または合成ポリマーです。
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Protocol
注： 図1に示すように、以下のプロトコルは、タンパク質-色素バイオコンジュゲートの合成のために設計されているノートが挿入されて膜タンパク質を支援するために、該当する場合それは、自由表面システイン含有タンパク質とのマレイミドの反応のための一般的なプロトコルです。バイオコンジュゲートは、タンパク質 - ポリマーバイオコンジュゲート、および合成タンパク質の二量体（タンパク質 - タンパク質）バイオコンジュゲート。この特定の場合において、タンパク質アイソ1シトクロムcは、高度に特異的な標識化が発生することを可能にする反応に利用できる一面のシステイン残基を有します。目的のタンパク質が複数のシステイン残基を有する場合は、同じプロトコルは、特異性と製品の均一性の損失にもかかわらず、適用されます。特異性は要求されない場合、表面リジン残基を標的とする化学的性質は、N -hydroxysuccinimidylエステルまたはイソチオシアネートを使用して、単純なアプローチであり得ます。
シトクロムcの1精製
注：このステップはすべてのタンパク質には適用されません。しかし、商業的供給業者から得られたタンパク質は、さらに精製13によって除去する必要があるかもしれない他の、望ましくないタンパク質アイソフォームを含むことができることを知っておくことが重要です。
- PRに超純水1Lにリン酸二水素ナトリウム（= 120 gでモル-1 W M）を2.4g溶解20mMのNaH 2 PO 4を含む緩衝液をepare。 pH7に1 M NaOHでpHを調整します。
注意：このプロトコルで使用されるリン酸緩衝液は、毎日新たに調製し、使用前に、0.2μmのセルロース膜フィルターを通して濾過されるべきです。 - 20 mMののNaH 2 PO 4および1 M NaCl緩衝液を作るために、塩化ナトリウムの29.22グラム（ ワット M = 58.44グラムのモル-1）を20mMのNaH 2 PO 4緩衝液の500ミリリットルで溶解します。これは）、ステップ1.6において精製のための溶出緩衝液です。
- pHが7〜20 mMリン酸緩衝液の6ミリリットルで凍結乾燥したシトクロムc（のcyt c）は 12.0ミリグラムを溶解させます。
- 別々に1 Mのストック溶液を調製し、超純水を95.3μlのジチオスレイトール14.7ミリグラム（DTT、M W = 154.25グラム/モル）を溶解します。
注：この試薬は、水溶液中の酸化失活の影響を受けやすいようにDTTストック溶液を、新たに調製しなければなりません。 - ピップタンパク質溶液に1 M DTT溶液60μlのETTEは、チトクロームcを低減することができます。溶液の色は混合時に光赤に暗赤色に変わります。
- 任意のクロマトグラフィー媒体に注入する前に、0.22μmの低タンパク質結合PVDFシリンジフィルターに通して減少したタンパク質溶液をフィルタリングします。
- 注入ループと高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）装置の紫外可視検出器との間に3.3ミリリットルの強い陽イオン交換カラムを取り付けます。
- 1ml /分の流速を用いて、20mMのpH7のリン酸緩衝液の3カラム体積、続いて超純水の3カラム容量でカラムを平衡化。
- 注入ループへの負荷減少粗チトクロームcの1ミリリットルを、そして328から勾配法開始- 5カラム容量を超える450のNaClを、。紫外可視検出器の280 nmおよび410 nmのチャネルを監視し、最大ピークを収集します。
- ISO-2チトクロムを溶出するために2カラム体積のために1 Mに塩濃度を増加させますE cおよびカラムをフラッシュした後、次の粗アリコートを注入する前に、リン酸緩衝液を20mMの2カラム容量でカラムを再平衡化。
- すべての粗タンパク質が精製されている繰り返して、1.9から1.10を繰り返します。
- プールイソ-1画分を含有し、それらは3.5 kDaの分子量カットオフ（MWCO）スピンフィルターを使用し、3000×gで遠心分離集中。
- 3.5 kDaのMWCO透析カセットに濃縮タンパク質をロードし、水の2の変更で、超純水に対して一晩透析します。
- 、10μLを取って超純水で100μlにそれを希釈し、吸光度スペクトルを取ることにより、純粋な濃縮タンパク質溶液の濃度を決定します。少量を使用し、100μlの石英キュベットは、タンパク質吸収スペクトルを得ました。 100μM - 一般的に、希釈していないタンパク質濃度は50程度です。
- concentratioを定量化するためのcyt cの特性410 nmのピークを使用しますnは97.6センチメートル-1 mMの-1のモル吸光係数の値とランベルト・ベールの法則を使用して：
A =ε×C×ι
Aは吸光度であり、εはモル吸光係数は、cはミリモルでの濃度であり、ιは、CM 13におけるキュベットの経路長です。
- concentratioを定量化するためのcyt cの特性410 nmのピークを使用しますnは97.6センチメートル-1 mMの-1のモル吸光係数の値とランベルト・ベールの法則を使用して：
- この時点で、1mLのアリコートにタンパク質を分割し、それらが必要とされるまで-20℃で凍結しておきます。 CYT cは凍結し、解凍した構造または機能を失うことなく、しかし、繰り返しサイクルは、タンパク質を変性し始めることができます。
注：タンパク質は、異なる程度に凍結耐えます。例えば、緑色蛍光タンパク質5,9の代わりに冷蔵庫に保存し、凍結されるべきではありません。
シトクロムcバイオコンジュゲートの2合成
- ルテニウムの0.9 mgのディゾルブ（II）bisterpyridine maleimIDEルテニウム（Ru（II）（TPY）2 -マレイミド、0.975マイクロモル、6当量）のアセトニトリル600μlのインチ
注：使用マレイミドは水溶性である場合、水の代わりに、アセトニトリル中のストック溶液を調製します。マレイミドは、反応緩衝液中で可溶性であることが重要です。ジメチルスルホキシド、N、N-ジメチルホルムアミド、アセトニトリルは、低分子量12、多くの場合、疎水性のマレイミド反応物の溶解を助けるためにすべての一般的に使用されるアジュバントです。 - 20mMに希釈したときにEDTAが溶解するまで、典型的には（数グラムを固体水酸化ナトリウムを加えてpH 7で100 mMリン酸緩衝液および100mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA、M W = 292.24グラム/モル）を含む緩衝液を調製）と、pHを7に調整します。
- 10mMのストック溶液を調製し、超純水1ml中のトリスの2.87 mgの（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP 15、M W = 286.65グラム/モル）を溶解させます。このステップは、インポートされアリは、タンパク質上のシステインが完全に15を連結するマレイミドの前に低減されることを保証します。
注：この試薬は、水溶液中の酸化失活の影響を受けやすいようTCEP原液は、それぞれの反応のために新たに調製しなければなりません。 - 50ミリリットルプラスチックチューブで100 mMリン酸/ EDTAストック溶液3mlで超純水11.4ミリリットルを兼ね備えています。タンパク質およびマレイミド原液でさらに希釈すると緩衝液濃度を20mMになります。
注：標識されたタンパク質は膜貫通タンパク質である場合、適切な界面活性剤は、タンパク質を可溶化するために緩衝液に添加されていることを確認します。洗剤を使用しない場合は、膜タンパク質が徐々にマイナスの反応収率に影響を与えるであろう、沈殿ができます。すべての後続の精製工程で洗剤を使用してください。 - リン酸EDTA緩衝液に精製されたチトクロームcの0.15マイクロモル（50μM溶液3ml、1当量）を追加します。
- TCEPストックsolutの7.5μLを追加タンパク質溶液にイオン（0.075マイクロモル、0.5当量）とは、システイン酸化による二量化している可能性のあるタンパク質を減らすために5分間攪拌したままにしておきます。
注意：目的のタンパク質が容易に二量体化していない場合TCEPを追加しないでください。非還元条件下でタンパク質ゲルを実行することによってこれを確認してください。 - 24時間、室温で、暗所でのRu（II）（TPY）のcyt cの減少、緩衝溶液に2 -マレイミドのアセトニトリル溶液600μlを添加し、反応混合物の攪拌を残します。
- ろ液が透明に実行されるまで、新鮮な20mMのリン酸緩衝液で2〜3回繰り返し、3,000×gで遠心分離し、3.5 kDaのMWCOスピンフィルターを用いて反応混合物を濃縮します。精製の次の段階の前に、可能な限り、反応混合物からできるだけ多くの未反応のマレイミドを削除します。
注：この時点で、粗製のバイオコンジュゲーション混合物を、暗所で、冷蔵庫で保存することができます。 CENTRにより未反応のマレイミド色素を除去することが重要です保存前の透析ifugeマレイミドのようにゆっくりと非特異的にタンパク質の表面上のリジン残基と反応することができます。
シトクロムcバイオコンジュゲートの3精製
- 20mMのNaH 2 PO 4、0.5 M NaClを含む緩衝液を調製し、超純水1Lにリン酸二水素ナトリウム2.4gの塩化ナトリウムの29.22グラム溶解します。これは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）精製のためのランニングバッファーです。
- イミダゾールの17グラム（ ワット M = 68.077グラムのモル-1）を20mMのNaH 2 PO 4および0.5MのNaCl緩衝液の500ミリリットルで溶解します。これは、IMAC精製の溶出緩衝液です。
- 1 M NaOHまたはHClを用いてpH7に両方のバッファのpHを調整し、FPLCで使用する前に0.22μmの再生セルロース膜を介してそれらをフィルタリングします。
- 購入したIMACカラムは、COL上にロードされた任意の金属イオンなしで出荷されているようにUMN、Niのためにカラムを準備2+ベースの超純水を3ml、100mMの酢酸ニッケル溶液3mlでカラムを洗浄することによって精製し、超純水6mLを。カラムをすぐに使用しない場合の20％エタノール3mlのを通して洗浄し、細菌の増殖を防ぐために冷蔵庫に列を格納します。
- Ni 2+を取り付け注入ループとUV-Visの検出器との間FPLCに1ミリリットルIMACカラムを-loaded。
- 20mMのリン酸の3カラム体積、0.5ml /分の流速を用いて0.5 M NaCl緩衝液でカラムを平衡化します。
- 負荷のNi 2+ IMACカラム（0.22μmのシリンジフィルターで濾過）粗反応混合物100μlの。 （C -cytのRu（II））ルテニウムbisterpyridineシトクロムCのバイオコンジュゲートを溶出するために、3カラム容量にわたって0からmMの125にイミダゾール勾配が続く未反応のチトクロームcを溶出するためにランニングバッファーの3カラム容量でカラムを洗浄。
- Cを洗いますすべての粗バイオコンジュゲートを精製されるまでolumn 5カラム容量のための250 mMのイミダゾール緩衝液で、その後、20 mMのリン酸、0.5 M NaClおよび繰り返しステップ3.7でカラムを再平衡化。
- バイオコンジュゲートの画分をプールし、3,000×gで遠心分離し、3.5 kDaのMWCOスピンフィルターを使用してそれらを集中。
- 3.5 kDaのMWCO透析カセットに濃縮されたバイオコンジュゲートをロードし、水の2の変更で、超純水に対して一晩透析します。
- 純粋の濃度を決定し、410 nmでISO-1シトクロムc（97.6 mMの-1 cm -1 で ）同じモル吸光値を使用して、UV-Visのことでバイオコンジュゲート液を濃縮しました。 100μM - 一般的に、バイオコンジュゲートの濃度が50程度です。
- 25μlのアリコートにバイオコンジュゲートを分割し、それらが必要とされるまで-20℃で凍結しておきます。
シトクロムcバイオコンジュゲートの4キャラクタリゼーション
- 抑止しますMALDI-TOF MSによるバイオコンジュゲートの質量のmination
- アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸溶液1mlにカフェー酸10mgを溶解し（80：20：0.1、v / v / v）です。
- コーヒー酸溶液5μlの濃縮タンパク質溶液5μlを希釈します。
- MALDIターゲットプレート上のコーヒー酸溶液0.5μLを発見し、解決策を乾燥させます。
- スポット0.5は、このカフェー酸スポットの上にサンプル/マトリックス溶液μL、スポットが乾燥することができます。マトリックスの層の間のサンプル「サンドイッチ」にこの上にサンプルマトリックスの別の0.5μLをスポットし、乾燥させます。
- タンパク質16に適した機器の設定を使用してリニアモードで質量スペクトルを取得します。
- ゲル電気泳動によるバイオコンジュゲートの調査
- 予混合ドデシル硫酸リチウム（LDS、pHは8.4）緩衝液（4×）トンでタンパク質試料を希釈することによって実行されるように、各タンパク質試料を10μlの準備OAウェルあたり約20μgのの最終濃度。条件を減らす必要が井戸の場合、エージェント（10倍）を低減500mMのジチオスレイトール（DTT）の1μlを添加します。
- 10分間70℃で熱サンプル。
- ゲルランニングバッファーを準備するために予混合の50mlの1M MES、1Mトリス塩基、2％SDS、20mMのEDTA（pHは7.7）の超純水950ミリリットルに商業的供給源から緩衝液混合物（20倍）を実行を追加します。
- ゲルからプラスチック製の櫛を削除し、ゲルランニングタンク内のゲルを置きます。ウェルを緩衝液で覆われているように、ゲルランニング緩衝液でタンクを埋めます。
- 慎重にプレキャスト12％ビス - トリス、1ミリメートル、ロードを支援するために、長いピペットチップを用いて10ウェルのゲル上にロードしたサンプル。分析を助けるために、ゲルの中央のウェルに予備染色10タンパク質分子量マーカー（3から188キロダルトン）をロードします。
- 35分間200 Vの定電圧でゲルを実行します。
- 2時間商用クマシーブルー溶液でゲルを染色し、ultrapで洗浄48時間URE水。
- 紫外可視分光法によるバイオコンジュゲートの純度の決意
- Ruを5μMソリューション（II）（TPY）2 -マレイミド、イソ-1のcyt c、およびルテニウム（II）-cyt C120μlのを準備します。
- 250 nmのから650 nmまで、唯一の超純水を含む石英キュベットのベースラインスペクトルを測定します。
- キュベットは、各測定間ですすぎ、乾燥されることを保証、各成分のスペクトルを測定します。
- 波長の関数としての各成分の吸光度をプロットし、そして1かどうかを決定するために、最終製品に、出発物質の線形和を比較：ルテニウム（II）（TPY）CYTのC 2 -マレイミドの1比率が反応しました。
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Representative Results
図2に示すように 、飛行質量分析（MALDI-TOF MS）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および紫外-可視（UV-Vis）で分光法のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間：バイオコンジュゲートの合成は、3つの主要な方法によって確認されます3,4。添付の小分子の質量に対応する質量の増加、および未反応のタンパク質の欠如は、Ru（II）の成功した共有結合（TPY）のcyt cおよびバイオコンジュゲートのその後の精製に2 -マレイミドを示しています。バイオコンジュゲートの組成を推測することができる出発物質の1加算スペクトル：バイオコンジュゲートのUV可視スペクトルは、収率は410 nmであり、予測された1のスペクトルを比較して吸光度を用いて計算されることを可能にします。上記の例では、収率がFPLCのpurifica後に15から27パーセントの間で一般的にそれをバッチ間から多少変化するが、る15。
また、精製中のクロマトグラムにおける新しいピークの出現は、新種の合成を確認します。これは、異なるUV-Visのトレースの分析は、種は、Ru（II）（TPY）2 -マレイミド成分が含まれているか否かを示すことができ、図5に例示されています。
図2.タンパク質のMALDI-TOFマススペクトル 。純粋なISO-1シトクロムc（黒）とRu（II）-cyt C（赤）の質量スペクトル。ピークは179ダで見えるカフェ酸付加物とISO-1のcyt C（12706ダ）とRu（II）-cyt C（13559ダ）の計算された大衆に対応する観察することができます。この付加物は、未反応のcyt C sの中で、より高い金額で見られます高いエネルギーMALDI条件下でのコーヒー酸のα、β不飽和カルボニルとタンパク質の遊離チオールとの反応pectra。マトリックス付加物は、一般的にMALDI-MSに見られる、自然に共有結合および非共有結合の両方であり得ます。スペクトルは、ベースライン補正し、ノイズフィルタリング、および比較のために正規化されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
還元および非還元のcyt C及びRu（II）-cyt Cのタンパク質の、図3のSDS-PAGE。12％のBis-Trisゲル。レーン3は、各バンドの右側に注釈付きポリペプチドの質量（キロダルトン）で、前染色タンパク質標準が含まれているより大きな版？を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のn個。
図4. UV-Visのタンパク質のスペクトル ：ルテニウムの吸光度スペクトル（II）-cyt C（緑）は、純粋な、未反応のcyt C（赤）および未反応のRu（II）の線形加算（青点線）（に密接に対応しますTPY）2 -マレイミド（黒）。これは、バイオコンジュゲートは、1から構成されていることを示しています。タンパク質へのマレイミドの1アタッチメントこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
バイオコンジュゲート中のNi-IMAC精製の 図5.クロマトグラム ：ルテニウム（II）-cyt C精製のIMACトレース。 UV-Visのはトレース：410 nmのは、CYのソーレー帯に対応しますCYT cとのRu（II）ルテニウム（II）錯体の金属-配位子電荷転送帯域に対応するナノメートル（TPY）2 -マレイミド、および475の両方に対応するナノメートルトンのC、280。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。
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Discussion
バイオコンジュゲーションの前に出発物質の精製は、最も重要です。商業的な組換え供給源から得られたタンパク質は、しばしば、異なる表面化学と反応性を有することができ、目的のタンパク質の他のアイソフォームを含みます。例えば、記載生体結合に、市販のcyt cが両方イソ-1およびイソ-2のcyt Cの 12,14,17の混合物が含まれています。シトクロムcのISO-2およびISO-1形態は、主な違いは、ISO-1シトクロムcのC末端の近くに遊離システイン残基の存在であると、大部分が相同である。この例では、精製は、水性強力で達成されます陽イオン交換FPLCは、しかし、そのような陰イオン交換、アフィニティー、疎水性、またはサイズ排除クロマトグラフィー、FPLCの他の形態は、より適用可能です。タンパク質はまた、目的のタンパク質（ここではシトクロムc）上のシステイン残基はFUであることを確認するために、このステップで減少されますLLYマレイミド連結された標的とバイオコンジュゲーションの前に減少しました。また、タンパク質を含有するシステインで使用するマレイミド添付の小分子は、純粋およびマレイミドは、光や温度に敏感であるため、マレイミドは、貯蔵中の反応を受けていないことであるかどうかを確認することが有用です。オープンマレイミドのプロトンは高磁場シフトする一方で無傷のマレイミドのビニルプロトンは、6〜6.5 ppmにシングレットとして表示されますので、これは迅速かつ簡単に、1 H NMRによって確認することができます。 18ダ質量増加に対応するオープンマレイミド環とし、また、質量分析、。
バッファの選択、pH、およびそのような界面活性剤、有機溶剤などのアジュバントを含むこと、及び還元剤は、生物結合利回り5,15に大きな影響を持つことになります。マレイミドおよびチオールのマイケル付加の場合には、pHが発生するための高速、特定の反応のために6まだ8以下の上でなければなりません。 pHが6未満では、特異性が同じ高さマレイミドは、任意のアミンと反応することはできませんが、チオールがプロトン化され、したがって、遅い反応につながるマイケル付加の貧求核です。 pHが8を超えると、表面リジン残基が脱プロトン化になることができ、利用可能なマレイミドと反応させ、タンパク質へのマレイミド成分の非特異的な共有結合をもたらします。それは、このpH範囲で強い緩衝液であり、試薬のいずれかと相互作用しないため、リン酸緩衝液は、このバイオコンジュゲーションに使用されます。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液は、例えば、潜在的に低い収率につながるマレイミドと反応する可能性があり、このバッファ中のアミン基のようなお粗末な選択であろう。すべての試薬の溶解性も高い収率の鍵となります。少量の添加（<10％v / v）の適切なpHおよび塩濃度は、溶液中のタンパク質を維持するために不可欠であり、12を折り畳まれ、一方、非極性成分の溶解を助けることができる有機溶剤。大きな膜proteiのためNS有意な疎水性表面残基と、界面活性剤18を沈殿からタンパク質を防ぐために必要であろう。
バイオコンジュゲーション中のタンパク質は、酸化と二量化する傾向がある場合、例えば、TCEPなどの還元剤の添加は、バイオコンジュゲーション収率15を改善することが示されています。そのモノマー、遊離チオール形態へのタンパク質のin situでの減少は、活性チオール部位の大部分は、マレイミドによってアクセスされることを可能にします。 TCEPはまた、マレイミドと反応するようしかし、添加と化学量論の順序は、収率の成功の増加の鍵となります。 TCEP後のマレイミドを添加することにより、TCEPは、第一のタンパク質を減少させることによって消費されます。過剰なTCEPは無料マレイミドと不利に反応するのに利用できないように、タンパク質へのTCEPの半分相当、同じ理由のために使用されています。タンパク質の内部に構造的ジスルフィド架橋は、TCEPの添加によって影響を受けにくいですあるいは、DTTのような他の還元剤は、タンパク質は、例えば高温または尿素の高濃度で変性条件に保持されていないことを条件とします。例えば、前のFPLC精製にCを CYTするDTTの大過剰の添加は、精製後に回収されたタンパク質の量に有意な影響を及ぼしません。 TCEPによる構造システイン架橋の減少が疑われる場合、これは、天然、非変性条件下でのタンパク質ゲルを実行することによって確認することができます。
この方法で合成したRu（II）bisterpyridine標識シトクロムcを Ni 2+固定化金属アフィニティークロマトグラフィー14 を介して精製されます。他の精製方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン/陽イオン交換クロマトグラフィー、およびそのような抗体の固定相として特異的アフィニティークロマトグラフィーとして、存在します。一般に、この方法は、濃縮および透析工程followinと、上述と同様のままであります保管に適したバッファーにバイオコンジュゲートの製品を返すようにグラムのクロマトグラフィー精製。
バイオコンジュゲーションが成功したかどうかを決定する主な方法は、MALDI-TOF MS を介してです。これは、共有結合、小分子、差がしばしば1,000Da未満で標識された天然タンパク質とタンパク質との間の質量の小さな違いを把握するための最も正確な方法です。 MALDI-TOF MS実験を実行しているの最も難しい部分は、行列の選択とスポッティング手法です。しかし、コーヒー酸は、この研究で使用されるタンパク質とバイオコンジュゲートの分析のための信頼できる、汎用マトリックスであることが見出されています。潜在的な代替として、シナピン酸は、タンパク質の分析のための別の一般的に使用されるMALDIマトリックスです。 MALDI-TOF MSデータの分析が比較的簡単である。2は、両方の純粋なISO-1のcyt cの典型的なMALDI-TOF MSスペクトルを示し 、純粋なルテニウム（II）-cyt C（M（M = 12706ダワット ）ワット= 13559ダ）、密接に計算された分子量に対応し、どちらも。純度はまた、未反応のスペクトルにおけるISO-2シ トクロムcピークの欠如（W M = 12532ダ）とバイオコンジュゲートのスペクトルにおけるISO-1シトクロムcのピークの欠如を指摘し、観察することができます。バイオコンジュゲートの質量はまた、ゲル電気泳動を用いて推定することができる。 図3は 、12％のビス-トリスタンパク質ゲルは、バイオコンジュゲーションのための2つの証拠を提供します。まず、ルテニウム（II）は、非還元条件下で二量体のバンドの欠如は-cyt Cもはや遊離システインがあることを示していない、第二、バイオコンジュゲートのバンドのわずかなずれが上向きの分子量の増加につながります。タンパク質ゲルは非常に貴重であり、決定的な小分子の添付ファイルのためだけでなく、タンパク質二量体5またはタンパク質-ポリマーバイオコンジュゲート9の合成のためだけでなく、成功したバイオコンジュゲーションの証拠を提供することができます。
タンパク質について例えば、緑色蛍光タンパク質またはヘム含有シトクロムなどの発色団を含む、UV-可視分光法をバイオコンジュゲートの組成および収率を決定するために使用されます。 1： 図4に示すように、出発物質のスペクトルの1線形添加は、バイオコンジュゲートの仮想のUV-可視スペクトルの構築を可能にするこの1に、実際のバイオコンジュゲートのスペクトルを比較すると：1加算スペクトル、組成物は、推測することができます。例えば、二つ以上のRu（II）（TPY）2 -maleimidesが非特異的にタンパク質に結合した場合、バイオコンジュゲートの480 nm帯は、予測されたスペクトルよりも高くなるであろう。さらに、バイオコンジュゲートの濃度は97.6 -1 mMの-1の410nmでのモル吸光係数の値を用いて近似することができます。これは、ルテニウム（II）（TPY）2 -マレイミドがこの領域で最小の吸光度を有するため、バイオコンジュゲートのために同じであると仮定されます。
これは、股関節に留意すべきですシステイン-マレイミド化学を介してトンのバイオコンジュゲーションは、いくつかの制限があります。まず、目的のタンパク質は、1を導入するために実行されなければならない単一の、アクセス可能なシステイン残基、または他のタンパク質工学を持っている必要があります。第二に、システイン-マレイミド結合は、プラズマアプリケーション19の文脈中のアルブミンやグルタチオンなどの他の遊離チオール、と交換する余地があります。このような交換は、タンパク質の表面上の溶媒アクセシビリティと局所的な電荷に大きく依存しています。マレイミド - チオール結合は、依然として、プラズマアプリケーションに適し得るが、長期安定性は、質量分析、ゲル電気泳動を用いて確認されるべきです。
これにもかかわらず、このようなシステイン-マレイミド化学を介して、タンパク質に蛍光色素、酸化還元中心、ポリマー、および他のタンパク質などの新規分子の高度に特異的な、高収率の添付ファイルがあることが興味深い高分子の構築物の範囲を可能にする強力な手法でありますccessed。化学的に明確に定義されたタンパク質のバイオコンジュゲートを大量に持つことは、タンパク質結合、自己組織化、酵素反応速度およびタンパク質の局在化を伴う将来の研究の鍵となります。材料の精製、反応媒体の選択、およびそのような還元剤などの補助試薬の添加を開始して、上記の実証または界面活性剤などのすべてのバイオコンジュゲーション収率に大きな影響を与えます。精製は、最も簡単に、タンパク質と互換性クロマトグラフィーによって達成され、および特性は、MALDI-TOF MS、ゲル電気泳動の組み合わせを用いて達成され、かつ紫外可視分光法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
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