Summary
该协议细节对于含有蛋白质马来酰亚胺，包括试剂纯化，反应条件，生物共轭纯化和生物共轭表征半胱氨酸的生物结合所需的重要步骤。
Introduction
生物缀涉及共价连接一种生物分子与另一个或同一个合成的分子，例如染料，药物或聚合物。蛋白质的生物耦合方法现在广泛应用于许多化学，生物和纳米技术研究小组使用，应用范围从荧光染料标记1,2，使蛋白质（抗体）-prodrugs 3（抗体偶联药物- ADC）的蛋白二聚体4,5的合成通过在纳米8和系统化学9中使用的自组装蛋白-聚合物杂种6,7。
用于生物结合化学的特异性，而并非总是关键的，是对大多数功能性蛋白质生物共轭物极为重要，以便不与目标蛋白的活性位点干扰。提供了理想生物缀反应需要满足若干标准，包括：感兴趣的蛋白质上ⅰ）靶向稀有或独特的位点，ⅱ）是有选择性的实现这一目标，ⅲ）非变性条件下进行，以避免蛋白质折叠和iv）是高产作为目标蛋白质通常只适用于子毫摩尔浓度。马来酰亚胺-半胱氨酸迈克尔加成接近满足所有这些标准，并具有该原因长权利生物共轭化学10的字段的特殊状态。这是因为，ⅰ）在其表面上仅含有一个半胱氨酸残基的许多蛋白质可以遗传工程那里，ⅱ）在正确的pH值的反应是朝着半胱氨酸高度选择性，ⅲ）它可顺利地进行在水性缓冲液和iv）它是非常快的与马来酰亚胺的二阶速率常数报告超过5000 M -1秒-1在某些情况下11含有半胱氨酸的蛋白质。提供感兴趣的蛋白质可以容忍有机的一个小的（≈5-10％）量的共溶剂12，几乎任何马来酰亚胺官能化的染料，婆lymer，表面或另一种蛋白可以链接到蛋白质。此外，马来酰亚胺是对蛋白质比碘乙酰胺，这是更容易在升高的pH值的其他亲核体进行反应的半胱氨酸更具体;比这需要在酸性pH值被保持，以防止二硫键交换13基于二硫键缀合更稳定。
此处我们报告马来酰亚胺官能化的分子的缀合的通用协议包含使用钌（Ⅱ）基的发色团和氧化还原蛋白细胞色素C作为例子之间的反应的单个半胱氨酸残基的蛋白质。这个协议同样适用于含有可接近表面的半胱氨酸残基和相应的马来酰亚胺官能化的靶大多数其他蛋白，无论是另一种蛋白，荧光染料，发色团或合成聚合物。
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Protocol
注意： 如图1下面协议设计用于蛋白质-染料生物共轭的合成，可用于与含有游离表面半胱氨酸蛋白马来酰亚胺的反应的一般协议，与笔记插入在适用与膜蛋白来协助。生物共轭物，蛋白质类聚合物生物缀合物，以及合成的蛋白二聚体（蛋白质 - 蛋白质）生物缀合物。在这种特殊情况下，所述蛋白质异1色素c具有可用下反应一个表面半胱氨酸残基，它允许发生高度特异性的标记。如果感兴趣的蛋白具有多个半胱氨酸残基，相同的协议适用于，尽管有特异性和产品均匀性的损失。化学定位表面赖氨酸残基，用N- -hydroxysuccinimidyl酯或异硫氰酸酯，可以是如果不需要的特异性的简单的方法。
1，细胞色素C的分离纯化
注意：此步骤是并不适用于所有的蛋白质。但是，重要的是要知道，从商业供应商获得的蛋白质可含有可能需要通过进一步纯化13去除其他不希望的蛋白同种型。
- 在1升的超纯水以溶解2.4克磷酸二氢钠（男女 = 120克摩尔-1）公关epare含有20mM的NaH 2 PO 4缓冲溶液。调节pH用1M NaOH至pH 7。
注意：在这个协议中使用的磷酸盐缓冲剂应新鲜每天制备，并通过在使用前用0.2μm的纤维素膜过滤器过滤。 - 溶解在500毫升20毫摩尔的NaH 2 PO 4缓冲29.22克氯化钠（M W =58.44克摩尔-1）做出的20mM的NaH 2 PO 4和1M NaCl的缓冲液中。这是为在步骤1.6）中纯化的洗脱缓冲液。
- 在6ml pH为7的20mM磷酸盐缓冲液中溶解12.0毫克冻干的细胞色素C（色素C）的。
- 分别在95.3微升超纯水溶解14.7毫克二硫苏糖醇（DTT中，M W = 154.25克/摩尔）以制备1M的原液。
注意：DTT原液应新鲜制备，如该试剂易受在水溶液中的氧化失活。 - 果仁ETTE 60微升的1M DTT溶液到该蛋白质溶液中，以减少色素C。溶液的颜色从暗红混合时变为淡红色。
- 注入到任何色谱介质之前过滤通过0.22μm低蛋白结合的PVDF针筒过滤器还原蛋白溶液。
- 附加注射环和一个快速蛋白质液相色谱（FPLC）仪器的UV-Vis检测之间的3.3毫升强阳离子交换柱。
- 用超纯水的3倍柱体积，随后的20mM pH7的磷酸盐缓冲液3倍柱体积平衡色谱柱，使用1毫升/分钟的流速。
- 负载1毫升降低原油色素C的进样环，并开始从328梯度方法- 450毫米氯化钠，超过5柱体积。监视UV-Vis检测的280纳米和410纳米的通道，并收集最大峰。
- 增加盐浓度至1M为2倍柱体积洗脱异2细胞色素权证 ，并且列被刷新后，用20mM磷酸缓冲液2倍柱体积注入下一个粗等分试样之前重新平衡色谱柱。
- 直到所有的粗蛋白已经被净化重复步骤1.9-1.10。
- 池的iso-1含有级分，并用3.5 kDa的分子量截留（MWCO）旋转过滤器，并在3000×g下离心集中起来。
- 加载的浓缩蛋白质进入3.5 kDa的截留分子量透析磁带和透析对超纯水过夜，水2的变化。
- 通过采取10微升，其用超纯水稀释至100μl，并采取的吸收光谱确定的纯度，浓缩蛋白溶液的浓度。使用低容量，100微升石英比色皿，以获得蛋白质的吸收光谱。通常情况下，未稀释的蛋白质浓度是50量级 - 100微米。
- 使用细胞色素C的特征为410nm的峰值量化concentratioN使用比尔-朗伯定律97.6 -1毫米-1的摩尔吸光值：
A =ε×C×ι
其中A是吸光度，ε是摩尔吸光系数，c为以mM的浓度，ι是试管的在厘米13的路径长度。
- 使用细胞色素C的特征为410nm的峰值量化concentratioN使用比尔-朗伯定律97.6 -1毫米-1的摩尔吸光值：
- 此时，划分蛋白质在1ml等份并于-20℃保持冷冻直到需要它们。色素C可以冷冻和没有结构或功能丧失解冻，但重复周期将开始使蛋白质变性。
注：蛋白质忍受冰冻程度不同。例如，绿色荧光蛋白5,9-不应被冻结，而不是保存在冰箱中。
2，细胞色素C生物共轭物的合成
- 溶解0.9毫克钌（Ⅱ）bisterpyridine maleimIDE（钌（Ⅱ）（TPY）2 -马来酰亚胺，0.975微摩尔，6当量）在600微升的乙腈中。
注意：如果使用的马来酰亚胺可溶于水，制备在水代替乙腈原液。为马来酰亚胺可溶于反应缓冲液是重要的。二甲亚砜，N，N-二甲基甲酰胺和乙腈中所有常用的辅助剂，以帮助在低分子量12，常疏水马来酰亚胺反应物的溶解。 - 制备含有100mM磷酸盐缓冲液和100mM乙二胺四乙酸（EDTA中，M W =292.24克/摩尔），其中，当稀释至20mM的pH为7.加入固体氢氧化钠直到EDTA溶解（几克典型地为缓冲溶液）并调节pH至7。
- 溶解2.87毫克三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP 15中，M W = 286.65克/摩尔）在1ml超纯水中，以制备10mM储备溶液。这一步是进口蚂蚁，以确保蛋白质上半胱氨酸完全成马来酰亚胺偶联15之前降低。
注意：TCEP原液应新鲜每个反应来制备，因为这种试剂是容易在水溶液中的氧化失活。 - 结合11.4毫升超纯水与50毫升的塑料管3毫升100mM磷酸/ EDTA储液。当与蛋白质和马来酰亚胺储备溶液进一步稀释缓冲液浓度为20毫摩尔。
注意：如果被标记的蛋白是跨膜蛋白，确保一个合适的洗涤剂加入到缓冲以溶解蛋白质。如果不使用洗涤剂的膜蛋白可以慢慢沉淀，这将不利地影响反应产率。使用该洗涤剂中的所有随后的纯化步骤。 - 添加0.15微摩尔（3毫升50微米的溶液，1当量）纯化色素C的对磷酸EDTA缓冲液。
- 加入7.5微升的TCEP股票SOLUT的离子（0.075微摩尔，0.5当量）的蛋白质溶液和休假搅拌5分钟，以减少可能由于半胱氨酸氧化二聚化的任何蛋白质。
注意：不要添加TCEP如果感兴趣的蛋白质不容易二聚化。通过非还原条件下运行的蛋白质凝胶检查。 - 添加600μl的钌（II）（TPY）2 -马来酰亚胺到细胞色素C的减少，缓冲溶液的乙腈溶液，并留下该反应混合物搅拌，在黑暗中，在室温，24小时。
- 集中使用3.5 kDa的MWCO自旋过滤器将反应混合物，离心以3,000 xg离心，用新鲜的20 mM磷酸盐缓冲液重复2-3次，直到滤液变清。纯化的下一阶段之前，除去从反应混合物中尽可能多的未反应的马来酰亚胺。
注意：在这一点上，将粗生物结合混合物可以储存在冰箱内，在黑暗中。它以消除CENTR未反应的马来酰亚胺染料是重要的ifuge储存前透析作为马来酰亚胺可以在蛋白质的表面上的赖氨酸残基慢慢和非特异性反应。
3.细胞色素C生物共轭物的分离纯化
- 溶解2.4克磷酸二氢钠和在1升超纯水29.22克氯化钠以制备含有20mM的NaH 2 PO 4和0.5M NaCl的缓冲液。这是用于固定化金属亲和层析（IMAC）纯化的运行缓冲液。
- 溶解在500毫升20毫摩尔的NaH 2 PO 4和0.5M NaCl的缓冲液为17克咪唑（M W =68.077克摩尔-1）。这是对IMAC纯化的洗脱缓冲液。
- 调整两个缓冲液的pH到使用1M的NaOH或HCl pH为7，并在FPLC使用前通过0.22μm的再生纤维素膜过滤。
- 由于购买的IMAC柱出厂时没有加载到山坳任何金属离子UMN，通过用3ml的超纯水，将3ml 100mM的乙酸镍溶液，和6ml的超纯水洗涤柱制备了镍离子为基础的纯化塔。如果该列没有被立即使用冲洗通过3毫升20％乙醇和列存储在冰箱，以防止细菌的生长。
- 附加的Ni 2+ -loaded1毫升IMAC柱的FPLC注入环和UV-Vis检测器之间。
- 用20mM磷酸的3倍柱体积，用0.5毫升/分钟的流速0.5M NaCl的缓冲液平衡该柱。
- 负载100微升对Ni 2+ IMAC柱粗反应混合物（通过0.22μm针筒过滤器过滤）的。用运行缓冲液以洗脱未反应的色素C的3倍柱体积，随后从0咪唑梯度的125mM以上3倍柱体积洗涤柱以洗脱钌bisterpyridine-色素c生物共轭（钌（Ⅱ）-cyt 三 ） 。
- 洗净的Column用5柱体积的250 mM咪唑缓冲液，然后用20 mM磷酸，0.5M NaCl和重复步骤3.7，直到所有的粗生物共轭已被纯化重新平衡色谱柱。
- 凝聚生物共轭级分，并用3.5 kDa的MWCO旋转过滤器，以3000×g的离心分离集中起来。
- 装载集中到生物共轭物3.5 kDa的截留分子量透析磁带和透析对超纯水过夜，水2的变化。
- 确定由UV-VIS纯，浓缩生物共轭溶液的浓度，使用相同的摩尔吸光值作为异1色素c（97.6毫-1厘米-1）在410纳米。通常情况下，生物共轭浓度为50量级 - 100微米。
- 划分成生物共轭物25微升等分，并在-20°C保持冷冻直到需要。
4.表征细胞色素C的生物共轭
- 阻止通过MALDI-TOF质谱生物共轭质量mination
- 溶解10毫克的咖啡酸的在1毫升乙腈/水/三氟乙酸溶液（80：20：0.1，V / V / V）。
- 稀释5μl的浓缩的蛋白质溶液与5微升的咖啡酸溶液。
- 点0.5微升在MALDI靶盘咖啡酸溶液，并使溶液干燥。
- 现货0.5微升这一咖啡酸点上方的采样/矩阵解决方案，允许当场晾干。发现在此之上，以“三明治”基质的层间的试样另一0.5微升样品基质的，并晾干。
- 使用合适的仪器设置的蛋白质16取得以线性模式质谱。
- 通过凝胶电泳生物缀合物的调查
- 制备10微升每个蛋白质样品以稀释蛋白质样品与预混合十二烷基硫酸锂（LDS，pH值8.4）缓冲液（4次）T为运行OA的每孔约20微克最终浓度。对于需要还原条件下水井，加入1微升500二硫苏糖醇（DTT）的还原剂（10X）的。
- 热样品在70℃下10分钟。
- 加50预混毫升的1M MES，1M Tris碱，2％SDS，20毫摩尔EDTA（pH值7.7）从商业来源至950毫升的超纯水的运行缓冲液混合物（20倍），以制备凝胶电泳缓冲液。
- 从凝胶中去除塑料梳子，并放置在凝胶运行槽中的凝胶。使孔覆盖有缓冲填充凝胶电泳缓冲液的罐。
- 装载样品仔细到预制12％双Tris，1毫米，使用长枪头10孔凝胶，以协助装载。加载预染10蛋白质分子量标记物（3-188 kDa的）到凝胶的一个中间孔以有助于分析。
- 运行在200伏的恒定电压的凝胶35分钟。
- 染色用2小时商业考马斯蓝溶液的凝胶，并用ultrap洗URE水中48小时。
- 生物共轭纯度通过UV-Vis光谱测定
- 制备120微升钌（Ⅱ）（TPY）2 -马来酰亚胺，异1细胞色素c和 钌（II）-cyt 的c为5μM的解决方案。
- 测量仅含有超纯水的石英比色皿的基线频谱，从250纳米到650纳米。
- 测量每个元件的光谱，确保了反应杯漂洗和每次测量之间干燥。
- 绘制每个部件的吸光度作为波长的函数，并且与最终产品相比较的原料的线性总和，以确定是否一个1：钌（II）（TPY）2 -马来酰亚胺来色素C的1比已反应。
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Representative Results
生物缀合物的合成通过三种主要方法证实：飞行质谱（MALDI-TOF MS），聚丙烯酰胺凝胶电泳的基质辅助激光解吸电离时间，和紫外可见（UV-VIS）光谱， 如图2所示，图3和4。对应于所附小分子的质量的质量增加，并且缺乏未反应蛋白质的演示钌（Ⅱ）的成功的共价键（万吨）2 -马来酰亚胺到细胞色素c和 生物共轭的随后的纯化。所述生物缀合物的UV-Vis光谱允许在410纳米，和由频谱比较预测1的吸光度计算出的产率：的起始原料的生物共轭的组合物可以推断的1加成光谱。在上面的例子中，产率有所从批次到批次通常15-27％之间的FPLC purifica后变化，但它化15。
另外，在纯化过程中的色谱图的新峰的出现证实了新物种的合成。这在图5中 ，其中不同的紫外-可见痕迹的分析可以指示一个物种是否包含钌（Ⅱ）（TPY）2 -马来酰亚胺组分例举。
图2.蛋白质的MALDI-TOF质谱 。纯ISO-1细胞色素C（黑色）和Ru（II）-cyt C（红色）质谱。峰可以观察到，对应于异1细胞色素C（12706道尔顿）和Ru（II）-cyt C（13,559道尔顿）的计算质量与咖啡酸的加合物在179达可见。这种加合物被认为是在较高量的未反应的细胞色素（C S）pectra由于咖啡酸的α，β不饱和羰基与蛋白的高能电离条件下的游离硫醇之间的反应。基质加合物常见于MALDI-MS，可以是共价和在自然界中的非共价的。光谱基线校正，噪音过滤，归作比较。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. SDS-PAGE的蛋白质。还原和非还原细胞色素c和 钌（II）-cyt 的c的12％的Bis-Tris凝胶。巷3包含预染的蛋白质标准，带注释为每个波段（kDa的）的右多肽质量。 请点击此处查看大versio这个数字的n个。
图4.紫外-可见蛋白质的光谱 ：钌的吸收光谱（Ⅱ）-cyt C（绿色）密切对应于纯，未反应的细胞色素C（红色）和未反应的Ru的线性加法（虚线蓝色）（Ⅱ）（万吨）2 -马来酰亚胺（黑色）。这表明，生物结合物由1：马来酰亚胺的蛋白1个附件，请点击此处查看该图的放大版本。
图5.色谱生物共轭物的镍IMAC纯化 ：钌（II）-cytç净化IMAC痕迹。紫外可见痕迹：410纳米相当于CY的索瑞带T C，280纳米相当于两个细胞色素c和 钌（II）（TPY）2 -马来酰亚胺，和475纳米相当于钌（II）复杂的金属到配体的电荷传输带。 请点击这里查看更大的版本这个数字。
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Discussion
一个生物结合前的原料纯化是非常重要的。从商业的重组来源得到的蛋白质常含有目的蛋白质，其可具有不同的表面化学和反应的其它同种型。例如，在所描述的生物结合，市售细胞色素C包含两个异1和异2色素C 12,14,17的混合物。异2和异1形式的细胞色素c在很大程度上是同源的，与主要的区别是异1细胞色素C的C-末端附近的一个游离半胱氨酸残基的存在，在这里的例子中，纯化用含水强达到阳离子交换FPLC，但是，其他形式的FPLC的诸如阴离子交换，亲和，疏水性或大小排阻层析可能更适用。该蛋白质也降低在该步骤，以确保感兴趣蛋白质上半胱氨酸残基（此处色素c）是复与马来酰亚胺联目标生物结合之前LLY降低。此外，它是有用的，以确定是否与含有蛋白质的半胱氨酸是纯净的马来酰亚胺未发生在存储一个反应中使用的马来酰亚胺所附的小分子，如马来酰亚胺是光线和温度敏感。这可以通过1 H NMR来快速且容易地检查，作为一个完整的马来酰亚胺的乙烯基质子将在6-6.5 ppm的显示为一个单峰，而开放式的马来酰亚胺将转向高场的质子;而且质谱，以开放的马来酰亚胺环对应一个18大质量增加。
缓冲的选择，pH值，并且包含佐剂，如清洁剂，有机溶剂，和还原剂会对生物缀收率5,15具有深远的影响。在迈克尔加成马来酰亚胺和硫醇的情况下，pH值必须高于6还低于8为发生快速的，特异反应。 pH低于6，特异性高马来酰亚胺将无法与任何胺反应，但硫醇是质子化并因此为迈克尔加成导致缓慢反应较差的亲核试剂。高于pH 8，表面赖氨酸残基可以成为去质子化，并与现有的马来酰亚胺反应，导致马来酰亚胺组分的非特异性共价连接到蛋白质。磷酸盐缓冲液在该生物结合使用，因为它是在该pH范围内的强缓冲剂，并且不与任何试剂相互作用。三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）缓冲液，例如，将是差的选择，因为在该缓冲液胺基可能与马来酰亚胺，这将导致产率差的反应。所有试剂的溶解度也很关键，以高收益。加入少量（<10％体积/体积）的有机溶剂可帮助在非极性组分的溶解，而正确的pH值和盐浓度是用于保持蛋白质在溶液中基本和折叠12。对于大型膜protei纳秒与显著疏水表面残基，表面活性剂将是必要的，以防止蛋白质从沉淀18。
如果在生物结合的蛋白质是容易氧化和二聚化，还原剂的添加诸如TCEP已经显示出改善生物缀收率15。 中原位还原的蛋白质的至其单体，游离硫醇形式允许活性硫醇位点的更大比例的由马来酰亚胺进行访问。然而，除了和化学计量秩序的关键在于产量的增加成功的TCEP还将与马来酰亚胺反应。通过添加TCEP后马来酰亚胺，所述的TCEP将通过首先减少该蛋白质被消耗掉。 TCEP的蛋白质半当量被用于同样的原因，从而使过量的TCEP不可用于与自由马来酰亚胺不利反应。在蛋白质的内部结构的二硫键可能不会通过加入TCEP的影响或诸如DTT其它还原剂，只要该蛋白没有在变性条件举行诸如高温或尿素的高浓度。例如，加入大量过量的DTT以色素C FPLC纯化之前不会对纯化后回收的蛋白质的量的显著效果。如果由TCEP还原结构半胱氨酸桥的怀疑，这可以通过天然，非变性的条件下运行的蛋白质凝胶的确认。
在这种方法合成的钌（II）bisterpyridine标记的细胞色素C 通过镍离子固定化金属亲和层析纯化14。其它纯化方法存在，例如大小排阻层析，阴离子/阳离子交换层析，和特定的亲和层析如抗体固定相。在一般情况下，该方法是一样的，如上所述，随浓度和透析步骤跟随着克层析纯化到生物共轭产物返回到合适的缓冲液进行存储。
确定是否生物结合是成功的主要方法是通过 MALDI-TOF MS。它是确定在质量天然蛋白质和蛋白质与小分子，差经常低于1000大共价标记之间的差小的最精确的方法。运行MALDI-TOF MS实验中最困难的部分是矩阵的选择和定位技术;然而咖啡酸已被发现是在该工作中使用的蛋白质和生物缀合物的分析一个可靠，通用矩阵。作为一个潜在的选择，芥子酸为蛋白质的分析另一种常用的MALDI基质。 MALDI-TOF MS数据的分析相对简单。 图2显示了这两个纯ISO-1细胞色素C的典型MALDI-TOF MS谱（M W = 12706 DA）和纯钌（II）-cytÇ（MW = 13,559道尔顿），这两者的密切对应于计算出的分子量。纯度也可以观察到，并指出在未反应的光谱缺少异2色素c峰（M W = 12532道尔顿）和缺乏在生物共轭光谱异1色素c峰。的生物共轭质量也可以使用凝胶电泳估计。 图3，12％的Bis-Tris蛋白凝胶，提供的证据两片用于生物缀。第一，在非还原条件下不存在的二聚体频带的钌（II）的-cyt c表示有不再是游离半胱氨酸，第二，生物共轭带的轻微移位向上转换为增加分子量。蛋白凝胶是非常宝贵的，并且可以明确地提供成功生物结合不仅为小分子的附件，也为蛋白二聚体5或蛋白质聚合物生物缀合物9的合成的证明。
对于蛋白质含发色团如绿色荧光蛋白或含血红素的细胞色素，UV-Vis光谱被用来确定生物共轭的组合物和产率。 1：原料的光谱的1线性加成允许生物结合物的一个假想UV-Vis光谱的结构， 如图4通过比较实际的生物共轭光谱此1：1加成频谱，该组合物可以推断。例如，如果两个或两个以上的Ru（II）（TPY）2 -maleimides已非特异性附着到蛋白质，生物共轭的480nm的频带会比预测的频谱更高。此外，生物共轭的浓度可以通过使用97.6 -1毫-1 410nm处摩尔吸光值来近似。这被认为是对生物共轭相同，因为钌（Ⅱ）（TPY）2 -马来酰亚胺具有在该区域最小吸光度。
应当指出的塔通过半胱氨酸-马来酰亚胺化学牛逼生物结合有几个限制。首先，感兴趣的蛋白必须具有必须执行一个单一的，可访问的半胱氨酸残基，或其他蛋白质工程引进之一。其次，半胱氨酸-马来酰亚胺键是容易与其它游离硫醇，如在血浆中的应用程序19的上下文中白蛋白和谷胱甘肽交换。这种交流是高度依赖于溶剂可及性和局部电荷的蛋白质的表面上。马来酰亚胺 - 硫醇键可能仍然适合于等离子体的应用，但是长期稳定性应用质谱和凝胶电泳来检查。
尽管如此，新分子诸如经由半胱氨酸-马来酰亚胺化学荧光染料，氧化还原中心，聚合物，和其它蛋白质以蛋白质的高度特异性的，高产附件是一个功能强大的技术，它允许各种有趣的大分子结构是一个ccessed。具有大量化学明确定义的蛋白质生物缀合物的关键是，涉及蛋白结合，自组装，酶动力学和蛋白质定位未来的研究。如上所证实，原料纯化，反应介质的选择，而在加入补充的试剂的例如减少或表面活性剂都对生物缀产量一个显著影响。纯化是最容易通过蛋白质兼容层析实现的，和表征使用MALDI-TOF MS，凝胶电泳的组合来实现，和UV-Vis光谱。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Elsevier: Oxford. (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
