Summary
Denne protokol beskriver de vigtige skridt, der er nødvendige for bioconjugation af en cystein indeholder protein til en maleimid, herunder reagens rensning, reaktionsbetingelser, biokonjugat rensning og biokonjugat karakterisering.
Introduction
Bioconjugation indebærer kovalent binding ene biomolekyle med hinanden eller med en syntetisk molekyle, såsom et farvestof, lægemiddel eller en polymer. Protein bioconjugation metoder nu flittigt brugt i mange kemi, biologi og nanoteknologi forskergrupper med ansøgninger fra fluorescerende farvestof mærkning 1,2, hvilket gør af protein (antistof) -prodrugs 3 (antistof medikamentkonjugater - ADC'er) syntese af protein dimerer 4,5 , igennem til selvsamlende protein-polymer-hybrider 6,7 anvendes i nanomedicin 8 og systemer kemi 9.
Specificitet af kemien, der anvendes til bioconjugation, mens ikke altid kritisk, er af største vigtighed for de fleste funktionelt protein biokonjugater, således at ikke forstyrre det aktive sted i målproteinet. Den ideelle bioconjugation reaktion skal opfylde flere kriterier, herunder: i) rettet mod sjældne eller unikke steder på proteinet af interesse,ii) være selektiv mod dette mål, iii) fortsætte under ikke-denaturerende betingelser for at undgå protein udfoldning og iv) være højtydende som målproteinet er sædvanligvis kun tilgængelige på sub-millimolær koncentration. Den maleimid - cystein Michael Ud kommer tæt på at opfylde alle disse kriterier, og har derfor længe hævdet en særlig status inden for biokonjugat kemi 10. Dette er fordi i) mange proteiner, der kun indeholder én cysteinrest på deres overflade kan gensplejses der, ii) på den korrekte pH reaktionen er stærkt selektiv dybt cystein, iii) det forløber glat i vandige puffere og iv) det er meget hurtigt med den anden ordens hastighedskonstanten af maleimider til cysteinholdige proteiner rapporteret at overstige 5.000 M -1 sek-1 i nogle tilfælde 11. Forudsat proteinet af interesse kan tolerere en lille (≈ 5-10%) mængden af organisk co-opløsningsmiddel 12, næsten enhver maleimid-funktionaliseret farvestof, polymer, overflade eller et andet protein kan bindes til proteiner. Desuden maleimider er mere specifikke for cysteiner på proteiner end iodacetamider, som er mere tilbøjelige til at reagere med andre nukleofiler ved forhøjet pH; og mere stabile end disulfid-baserede bøjninger, som skal holdes ved sur pH for at forhindre disulfidudskiftning 13.
Her rapporterer vi en generisk protokol for konjugering af maleimid-funktionaliserede molekyler til et protein, der indeholder en enkelt cysteinrest ved hjælp af reaktionen mellem en Ru (II) -baseret kromofor og redox-proteinet cytochrom c som et eksempel. Denne protokol er lige så anvendelig til de fleste andre proteiner indeholdende en tilgængelig overflade cysteinrest og den tilsvarende maleimid-funktionaliseret mål, det være sig et andet protein, et fluorescerende farvestof, en kromofor eller en syntetisk polymer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Den følgende protokol er beregnet til syntesen af et protein-farvestof biokonjugat som vist i figur 1 Det er en generel protokol for reaktionen af en maleimidgruppe med fri overflade cystein indeholdende proteiner, med noter indsat i givet fald at bistå med membranprotein. biokonjugater, protein-polymer biokonjugater og syntetisk protein dimer (protein-protein) biokonjugater. I dette særlige tilfælde er proteinet iso-1 cytochrom c har en overflade cysteinrest rådighed til at reagere, som tillader en yderst specifik mærkning for at forekomme. Hvis et protein af interesse har flere cysteinrester, den samme protokol gælder, omend med tab af specificitet og produktets homogenitet. Kemi målrettet overflade lysin rester, der bruger N -hydroxysuccinimidyl estere eller isothiocyanater, kan være en enklere fremgangsmåde, hvis specificitet ikke er påkrævet.
1. Oprensning af cytochrom C
Bemærk: Dette trin er ikke for alle proteiner. Det er imidlertid vigtigt at vide, at et protein opnået ud fra en kommerciel leverandør kan indeholde andre, uønskede protein-isoformer, som har behov for at blive fjernet ved yderligere oprensning 13.
- Opløs 2,4 g natriumdihydrogenphosphat (Mw = 120 g mol-1) i 1 L ultrarent vand til PRepare en pufferopløsning indeholdende 20 mM NaH 2 PO4. Justere pH med 1 M NaOH til pH 7.
Bemærk: De phosphatbuffere anvendes i denne protokol bør tilberedes frisk dagligt, og filtreret gennem et 0,2 um cellulose membranfilter før brug. - Opløs 29,22 g natriumchlorid (Mw = 58,44 g mol-1) i 500 ml af 20 mM NaH 2 PO4 buffer til at gøre en 20 mM NaH 2 PO 4 og 1 M NaCl puffer. Dette er elueringspufferen til oprensning i trin 1.6).
- Opløs 12,0 mg af lyofiliseret cytochrom c (cyt c) i 6 ml pH 7 20 mM fosfatbuffer.
- Separat opløses 14,7 mg dithiothreitol (DTT, Mw = 154,25 g / mol) i 95,3 pi ultrarent vand til fremstilling af en 1 M stamopløsning.
Bemærk: Den DTT stamopløsning bør tilberedes frisk, da dette reagens er modtagelige for oxidativ deaktivering i vandig opløsning. - Pipette 60 pi af 1 M DTT-opløsning i proteinet løsning til at reducere cyt c. Farven af opløsningen skifter fra mørkerød til lys rød ved blanding.
- Filtrer den reducerede proteinopløsning gennem et 0,22 um lav proteinbinding PVDF sprøjtefilter før injektion på enhver kromatografiske medier.
- Vedhæfte en 3,3 ml stærk kationbyttersøjle mellem injektionsloop og UV-Vis detektor af en Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) instrument.
- Ækvilibrering af søjlen med 3 søjlevolumener ultrarent vand, efterfulgt af 3 søjlevolumener af 20 mM pH 7 phosphatpuffer, under anvendelse af en strømningshastighed på 1 ml / min.
- Load 1 ml reduceret råolie cyt c ind i injektionsloop, og start en gradient metode 328-450 mM NaCl, over 5 kolonnevolumener. Overvåg 280 nm og 410 nm kanaler i UV-Vis detektor, og indsamle det største top.
- Forøge saltkoncentrationen til 1 M til 2 søjlevolumener til eluering iso-2 cytochrome c, og efter at søjlen er skyllet, re-ækvilibrering af søjlen med 2 søjlevolumener af 20 mM phosphatbuffer før injektion næste rå alikvot.
- Gentag trin 1,9-1,10 indtil alle råprotein er blevet oprenset.
- Samle iso-1 holdige fraktioner og koncentrere dem ved anvendelse af en 3,5 kDa molekylvægtsafskæring (MWCO) spin-filter og centrifugering ved 3.000 x g.
- Læg det koncentrerede protein i 3,5 kDa MWCO dialyse kassetter og dialyseres mod ultrarent vand natten over, med 2 hold vand.
- Bestemme koncentrationen af det rene, koncentrerede proteinopløsning ved at tage 10 pi, fortynde den til 100 pi med ultrarent vand, og under en absorbans-spektrum. Bruge en lav volumen, til 100 pl kvartscuvette opnå protein absorbansspektre. Typisk er den ufortyndede proteinkoncentrationen er af størrelsesordenen 50 - 100 uM.
- Brug den karakteristiske 410 nm toppen af cyt c for at kvantificere concentration ved hjælp af Lambert-Beers lov med en molær absorptionsevne værdi på 97,6 cm-1 mM -1:
A = ε × c × ι
hvor A er absorbansen, ε er den molære absorptionskoefficient, c er koncentrationen i mM, og ι er vejlængden af kuvetten i cm 13.
- Brug den karakteristiske 410 nm toppen af cyt c for at kvantificere concentration ved hjælp af Lambert-Beers lov med en molær absorptionsevne værdi på 97,6 cm-1 mM -1:
- På dette tidspunkt, opdele proteinet i 1 ml portioner og holde frosset ved -20 ° C, indtil de skal bruges. Cyt c kan fryses og optøs uden tab af struktur eller funktion, men gentagne cyklusser vil begynde at denaturere proteinet.
Bemærk: Proteiner tåle frysning i forskellige grader. For eksempel grønt fluorescerende proteiner 5,9 må ikke fryses, i stedet opbevares i køleskab.
2. Syntese af cytochrom c biokonjugater
- Opløs 0,9 mg ruthenium (II) bisterpyridine maleimIDE (Ru (II) (tpy) 2 -maleimide, 0,975 pmol, 6 ækvivalenter) i 600 pi acetonitril.
Bemærk: Hvis maleimid anvendes, er opløseligt i vand, fremstille en stamopløsning i vand i stedet for acetonitril. Det er vigtigt for maleimid at være opløselig i reaktionspuffer. Dimethylsulfoxid anvendes N, N-dimethylformamid og acetonitril alle almindeligt anvendte adjuvanser til at bistå med opløsningen af lav molekylvægt 12, ofte hydrofobe maleimid reaktanter. - Forbered en pufferopløsning indeholdende 100 mM phosphatpuffer og 100 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, Mw = 292,24 g / mol), som, når den fortyndes til 20 mM er ved pH 7. Tilsæt fast natriumhydroxid indtil EDTA opløses (flere gram typisk ) og justere pH til 7.
- Opløs 2,87 mg Tris (2-carboxyethyl) phosphin, hydrochlorid (TCEP 15, Mw = 286,65 g / mol) i 1 ml ultrarent vand til fremstilling af en 10 mM stamopløsning. Dette trin er important at sikre, at cystein på proteinet er fuldt reduceret før maleimid kobling 15.
Bemærk: Den TCEP stamopløsning bør tilberedes frisk for hver reaktion, da dette reagens er modtagelig for oxidativ deaktivering i vandig opløsning. - Kombiner 11,4 ml ultrarent vand med 3 ml 100 mM phosphat / EDTA stamopløsning i et 50 ml plastrør. Når fortyndes yderligere med protein og maleimid stamopløsninger bufferen koncentrationen vil være 20 mM.
Bemærk: Hvis proteinet bliver mærket er et transmembrant protein, sikre, at en passende detergent tilsættes til bufferen for at solubilisere proteinet. Hvis der ikke anvendes et vaskemiddel membranen protein kan langsomt udfældes, hvilket vil have en negativ indvirkning reaktion udbytter. Brug vaskemiddel i alle efterfølgende rensningstrin. - Tilføj 0,15 pmol (3 ml af en 50 pM opløsning, 1 ækvivalent) oprenset cyt c til phosphatet-EDTA-buffer.
- Tilføj 7,5 ul af TCEP lager solution (0,075 pmol, 0,5 ækvivalenter) til proteinopløsningen og forlade omrøring i 5 min for at reducere helst protein, der kan have dimeriseres grund cystein oxidation.
Bemærk: Du må ikke tilføje TCEP hvis proteinet af interesse ikke dimerisere let. Tjek dette ved at køre et protein gel under ikke-reducerende betingelser. - Tilsættes 600 pi af acetonitril opløsning af Ru (II) (tpy) 2 -maleimide til den reducerede, bufret opløsning af cyt c, og efterlade reaktionsblandingen omrøring i mørke ved stuetemperatur, i 24 timer.
- Koncentrer reaktionsblandingen under anvendelse 3,5 kDa MWCO spin-filtre, centrifugering ved 3000 x g, gentaget 2-3 gange med friske 20 mM phosphatbuffer, indtil filtratet er klart. Fjerne så meget uomsat maleimid fra reaktionsblandingen som muligt før den næste fase af oprensning.
Bemærk: På dette tidspunkt kan den rå bioconjugation blandingen opbevares i køleskab i mørke. Det er vigtigt at fjerne uomsat maleimid farvestof ved centrifuge dialyse før lagring, da maleimid kan langsomt og ikke-specifikt reagerer med lysinrester på overfladen af proteinet.
3. Oprensning af cytochrom C biokonjugater
- Opløs 2,4 g natriumdihydrogenphosphat og 29,22 g natriumchlorid i 1 liter ultrarent vand til fremstilling af en pufferopløsning indeholdende 20 mM NaH 2 PO4 og 0,5 M NaCl. Dette er løbebufferen for den immobiliserede metal-affinitetskromatografi (IMAC) oprensning.
- Opløs 17 g imidazol (Mw = 68,077 g mol-1) i 500 ml af 20 mM NaH 2 PO4 og 0,5 M NaCl-puffer. Dette er elueringspufferen for IMAC oprensning.
- PH indstilles begge buffere til pH 7 ved anvendelse af 1 M NaOH eller HCI og filtreres dem gennem 0,22 um regenereret cellulose membraner før anvendelse i FPLC.
- Som iMac kolonner købte sendes uden metalioner indlæst på collonne, forberede kolonnen for en Ni2 + -baseret oprensning ved vask af søjlen med 3 ml ultrarent vand, 3 ml 100 mM nikkel acetat-opløsning og 6 ml ultrarent vand. Hvis kolonnen ikke skal anvendes straks vaske gennem 3 ml 20% ethanol og opbevar søjlen i køleskabet for at forhindre bakterievækst.
- Vedhæft en Ni 2+ -loaded 1 ml IMAC kolonne til FPLC mellem injektionsloop og UV-Vis detektor.
- Ækvilibrering af søjlen med 3 søjlevolumener af 20 mM phosphat, 0,5 M NaCl puffer under anvendelse af en strømningshastighed på 0,5 ml / min.
- Belastning 100 pi rå reaktionsblanding (filtreret gennem et 0,22 um sprøjtefilter) på Ni2 + IMAC-søjle. Kolonnen udvaskes med 3 søjlevolumener løbende buffer til eluering ikke reageret cyt c, efterfulgt af en imidazol-gradient fra 0 til 125 mM over 3 søjlevolumener til eluering af ruthenium bisterpyridine-cytochrom c-biokonjugat (Ru (II) -CYT c) .
- Vask column med 250 mM imidazol-buffer i 5 søjlevolumener, derefter igen ækvilibrere kolonnen med 20 mM phosphat, 0,5 M NaCl, og gentag trin 3.7, indtil al rå biokonjugatet er blevet oprenset.
- Pool biokonjugatet fraktioner og koncentrere dem ved anvendelse af en 3,5 kDa MWCO spinfilter centrifugering ved 3000 x g.
- Læg det koncentrerede biokonjugat i 3,5 kDa MWCO dialyse kassetter og dialyseres mod ultrarent vand natten over, med 2 hold vand.
- Bestemme koncentrationen af det rene, koncentrerede biokonjugat opløsning ved UV-Vis, ved hjælp af den samme molære absorptionskoefficient værdi som iso-1 cytochrom c (97,6 mM-1cm-1) ved 410 nm. Typisk biokonjugatet koncentrationen er af størrelsesordenen 50 - 100 uM.
- Opdel biokonjugat i 25 pi alikvoter og holde frosset ved -20 ° C, indtil de skal bruges.
4. Karakterisering af cytochrom C biokonjugater
- Afskrækkemelse af biokonjugat masse ved MALDI-TOF MS
- Opløs 10 mg af kaffesyre i 1 ml af en acetonitril / vand / trifluoreddikesyre-opløsning (80: 20: 0,1, vol / vol / vol).
- Fortynd 5 pi koncentrerede proteinopløsning med 5 pi koffeinsyre opløsning.
- Spot 0,5 ul kaffesyre løsning på MALDI måltavle og lad opløsningen tørre.
- Spot 0.5 pi prøven / matrix løsning på toppen af denne kaffesyre stedet, lade stedet tørre. Spot yderligere 0,5 pi prøve-matrix på toppen af dette til "sandwich" prøven mellem lag af matrix, og lad det tørre.
- Erhverve massespektre i lineær tilstand ved hjælp af egnede instrumentindstillinger for proteiner 16.
- Undersøgelse af biokonjugater ved gelelektroforese
- Fremstilling af 10 pi af hvert protein prøve, der skal køres ved fortynding proteinprøver med forblandet lithiumdodecylsulfat (LDS, pH 8,4) buffer (4x) toa slutkoncentration på ca. 20 ug per brønd. For brønde, der kræver reducerende betingelser, tilsættes 1 ml af 500 mM dithiothreitol (DTT) reduktionsmiddel (10x).
- Heat prøver ved 70 ° C i 10 min.
- Der tilsættes 50 ml forblandet 1 M MES, 1 M Tris-base, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7,7) løbebuffer blanding (20x) fra en kommerciel kilde til 950 ml ultrarent vand til fremstilling gelen løbebuffer.
- Fjern plastik kam fra gelen og placere gelen i gelen kørende tank. Fylder tanken med gel kørende puffer, således at brøndene er dækket med puffer.
- Load prøver omhyggeligt på en præfabrikeret 12% Bis-Tris, 1 mm, 10 brønde under anvendelse af lange pipettespidser til at bistå i lastning. Indlæse prestained 10 protein molekylvægtmarkør (3-188 kDa) i et midterste brønd af gelen til lette analyser.
- Kør gelen ved 200 V konstant spænding i 35 min.
- Farv gelen med en kommerciel Coomassie blå opløsning i 2 timer, og vask med ultrapure vand i 48 timer.
- Bestemmelse af biokonjugat renhed ved UV-Vis-spektroskopi
- Forbered 120 pi 5 uM opløsninger af Ru (II) (tpy) 2 -maleimide, iso-1 cyt c, og Ru (II) -CYT c.
- Mål baseline-spektret af kvartskuvette indeholdende kun ultrarent vand, fra 250 nm til 650 nm.
- Mål spektret af hver komponent, hvilket sikrer cuvetten skylles og tørres mellem hver måling.
- Plot absorbansen af hver komponent som en funktion af bølgelængde, og sammenligne den lineære sum af udgangsmaterialerne med det endelige produkt at afgøre, om et 1: 1 forhold af Ru (II) (tpy) 2 -maleimide til cyt c har reageret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syntesen af biokonjugater bekræftes af tre primære fremgangsmåder: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisering Time of Flight massespektrometri (MALDI-TOF MS), polyacrylamidgelelektroforese, og ultraviolet synligt (UV-Vis-spektroskopi), som vist i figur 2, 3 og 4. En masseforøgelse svarende til massen af den vedføjede lille molekyle, og manglen på en uomsat protein viser den vellykkede kovalente binding af Ru (II) (tpy) 2 -maleimide til cyt c og efterfølgende oprensning af biokonjugatet. UV-Vis spektrum af biokonjugatet tillader udbyttet beregnes med absorbansen ved 410 nm, og ved sammenligning af spektret til et forudsagt 1: 1 tilsætning spektrum af udgangsmaterialerne sammensætningen af biokonjugat kan udledes. I eksemplet ovenfor, varierer udbyttet noget fra batch-til-batch, men det generelt mellem 15-27% efter FPLC rensningsmedietion 15.
Desuden fremkomsten af en ny top i kromatogrammet under oprensning bekræfter syntesen af en ny art. Dette er eksemplificeret i figur 5, hvor analyse af de forskellige UV-Vis spor kan indikere, hvorvidt en art indeholder Ru (II) (tpy) 2 -maleimide komponent.
Figur 2. MALDI-TOF massespektre proteiner. Massespektre af ren iso-1 cytochrom c (sort) og Ru (II) -CYT c (rød). Toppe kan observeres, som svarer til de beregnede masse af iso-1 cyt c (12.706 Da) og Ru (II) -CYT c (13.559 Da) med en kaffesyre addukt synlig ved 179 Da. Dette addukt ses i større mængder i den uomsatte cyt c spectra skyldes en reaktion mellem α, β-umættet carbonyl af kaffesyre og den frie thiol med proteinet under højenergi MALDI betingelser. Matrix addukter almindeligvis ses i MALDI-MS og kan være både kovalente og ikke-kovalente natur. Spectra er baseline korrigeret, støj filtreret, og normaliseret til sammenligning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. SDS-PAGE af proteiner. 12% Bis-Tris gel af reduceret og ikke-reduceret cyt c og Ru (II) -CYT c. Bane 3 indeholder en præ-farvet protein standard, med polypeptid masse kommenteret til højre for hvert bånd (kDa). Klik her for at se et større version af dette tal.
Figur 4. UV-Vis spektre af Proteins: Absorbansspektret af Ru (II) -CYT c (grøn) svarer nøje til den lineære tilsætning (stiplet blå) rent, uomsat cyt c (rød) og uomsat Ru (II) ( tpy) 2 -maleimide (sort). Dette viser, at biokonjugatet består af en 1:. 1 fastgørelse af maleimid til proteinet Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Kromatogram af Ni-IMAC oprensning af biokonjugater: IMAC spor af Ru (II) -CYT c oprensning. UV-Vis spor: 410 nm svarer til Soret bånd af cyt c, 280 nm svarer til både cyt c og Ru (II) (tpy) 2 -maleimide, og 475 nm svarer til den takst overførsel bånd af ruthenium (II) kompleks metal-til-ligand. Klik her for et større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oprensning af udgangsmaterialerne før en bioconjugation er af allerstørste betydning. Proteiner opnået fra kommercielle rekombinante kilder indeholder ofte andre isoformer af proteinet af interesse, som kan have forskellige overfladekemi og reaktivitet. For eksempel i den beskrevne bioconjugation, det kommercielt tilgængelige cyt c indeholder en blanding af både iso-1 og iso-2 cyt c 12,14,17. Iso-2 og iso-1 former for cytochrom c er stort set homologe, med de vigtigste forskel er tilstedeværelsen af en fri cysteinrest nær C-terminalen af iso-1 cytochrom c. I eksemplet her, er oprensning opnås med vandig stærk kationbytter-FPLC, men andre former af FPLC såsom anionbytning, affinitetskromatografi, hydrofob eller gelpermeationskromatografi kan være mere relevant. Proteinet er også reduceret i dette trin for at sikre, at cysteinresten på proteinet af interesse (her cytochrom c) er fully reduceret før bioconjugation med maleimid-bundne target. Desuden er det nyttigt at konstatere, om den maleimid-vedføjede lille molekyle, der skal anvendes med en cystein holdigt protein er ren, og at maleimid har ikke undergået en reaktion på lager, som maleimider er lette og temperaturfølsomme. Dette kan hurtigt og nemt kontrolleres ved 1H NMR, som vinyliske protoner i en intakt maleimid vises som en singlet ved 6-6,5 ppm, mens protoner i en åben maleimid vil skifte op ad banen; og også massespektrometri, med en åben maleimid ring svarende til en 18 Da masseforøgelse.
Buffer valg, pH, og medtagelse af hjælpestoffer såsom vaskemidler, organiske opløsningsmidler, og reduktionsmidler vil have en dybtgående effekt på bioconjugation udbytter 5,15. I tilfælde af en Michael-addition af en maleimid og en thiol, skal pH være over 6 endnu under 8 for en hurtig, specifik reaktion at forekomme. Under pH 6, specificitet er høj sommaleimidet vil ikke være i stand til at reagere med eventuelle aminer, men thiolen er protonerede og derfor er en dårlig nukleofil for Michael-addition fører til en langsom reaktion. Over pH 8, kan overfladen lysinrester blive deprotonerede og reagerer med tilgængelige maleimider, hvilket fører til en ikke-specifik covalent binding af den maleimid komponent til proteinet. Phosphat buffer anvendes i denne bioconjugation fordi det er en stærk buffer i dette pH-område og ikke reagerer med nogen af reagenserne. Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris) puffer, for eksempel, ville være et dårligt valg som amingruppen i denne buffer kan potentielt reagere med maleimid, hvilket ville føre til dårlige udbytter. Opløselighed af alle reagenser er også nøglen til høje udbytter. Tilsætningen af små mængder (<10% v / v) af organisk opløsningsmiddel kan hjælpe med opløsningen af ikke-polære komponenter, mens korrekte pH og saltkoncentration er afgørende for at holde proteiner i opløsning og foldet 12. For store membran Proteins med betydelige hydrofobe overflade rester, vil et overfladeaktivt middel være nødvendig for at forhindre proteinet fra udfælde 18.
Hvis proteinet i bioconjugation er tilbøjelig til oxidation og dimerisering, har tilsætning af et reduktionsmiddel, såsom TCEP vist sig at forbedre bioconjugation udbytter 15. In situ reduktion af proteinet til dets monomere, frit thiol form, tillader en større andel af aktive thiol sider for at tilgås af maleimid. Imidlertid Rækkefølgen af tilsætningen og støkiometrien er nøglen til en vellykket stigning i udbytte som TCEP vil også reagere med maleimid. Ved at tilføje maleimid efter TCEP vil TCEP blive forbrugt ved at reducere proteinet først. En halv ækvivalent af TCEP til protein anvendes af samme grund, så overskydende TCEP ikke er tilgængelig til at reagere negativt med den frie maleimid. Strukturelle disulfidbroer på det indre af proteinet sandsynligvis ikke blive påvirket af tilsætning af TCEPeller andre reduktionsmidler, såsom DTT, forudsat at proteinet ikke holdes i denaturerende betingelser såsom høj temperatur eller en høj koncentration af urinstof. For eksempel kan tilsætning af et stort overskud af DTT CYT C før FPLC oprensning ikke har en signifikant virkning på mængden af protein udvundet efter oprensning. Hvis der er mistanke reduktion af strukturelle cysteinbroer af TCEP, kan dette bekræftes ved at køre en proteingel under native, ikke-denaturerende betingelser.
Ru (II) bisterpyridine-mærket cytochrom c syntetiseret ved denne metode oprenses via Ni2 + immobiliseret metalaffinitetschromatografi 14. Der findes andre oprensningsmetoder, såsom gelpermeationskromatografi, anion / kationbytningskromatografi, og specifik affinitetskromatografi, såsom et antistof stationær fase. Generelt fremgangsmåden forbliver den samme som beskrevet ovenfor, med koncentration og dialyse trin following kromatografisk oprensning for at returnere biokonjugatet produktet til en egnet puffer til opbevaring.
Den primære metode til bestemmelse af, om en bioconjugation er vellykket er via MALDI-TOF MS. Det er den mest nøjagtige måde at fastslå den lille forskel i massen mellem nativt protein og protein kovalent mærket med et lille molekyle, en forskel ofte mindre end 1.000 Da. Den sværeste del af at køre en MALDI-TOF MS eksperiment er matrix valg og spotting teknik; dog koffeinsyre har vist sig at være en pålidelig, allround matrix til analyse af proteiner og biokonjugaterne anvendes i dette arbejde. Som et potentielt alternativ, sinapininsyre er en anden almindeligt anvendt MALDI-matrix til analyse af proteiner. Analyse af MALDI-TOF MS-data er forholdsvis ligetil. Figur 2 viser den typiske MALDI-TOF MS-spektrum af både ren iso-1 cyt c (Mw = 12.706 Da) og ren Ru (II) -CYT c (Mw = 13.559 Da), som begge nøje svare til den beregnede molekylemasse. Renheden kan også iagttages, at bemærke manglen på en iso-2 cytochrom c-peak (Mw = 12.532 Da) i den uomsatte spektrum og manglen på en iso-1 cytochrom c-top i biokonjugat spektrum. Den biokonjugat masse kan også estimeres ved hjælp af gelelektroforese. Figur 3, et 12% Bis-Tris protein gel, indeholder to beviser for bioconjugation. Først, fraværet af en dimer bånd under ikke-reducerende betingelser for Ru (II) -CYT c angiver, at der ikke længere er en fri cystein, og det andet den lille forskydning af biokonjugatet båndet opad oversætter til en stigning i molekylvægten. Protein geler er uvurderlige og kan endeligt fremlægge dokumentation for vellykket bioconjugation ikke kun til små vedhæftede molekyle, men også for syntesen af protein dimerer 5 eller protein-polymer biokonjugater 9.
for proteinerindeholdende chromoforer såsom grønt fluorescerende protein eller hæm-holdige cytochromer, UV-Vis-spektroskopi anvendes til at bestemme sammensætningen og udbyttet af biokonjugatet. 1: 1 lineær tilsætning af udgangsmaterialerne spektre tillader konstruktionen af et hypotetisk UV-Vis spektrum af biokonjugatet, som vist i figur 4 Ved at sammenligne den faktiske biokonjugatet frekvenser til denne 1:. 1 tilsætning spektrum, kan præparatet udledes . For eksempel, hvis to eller flere Ru (II) (tpy) 2 -maleimides havde ikke-specifikt bundet til proteinet, vil 480 nm båndet af biokonjugatet være højere end den forudsagte spektrum. Derudover kan koncentrationen af biokonjugatet tilnærmes ved hjælp af 410 nm molære absorptionskoefficient værdi på 97,6 cm-1 mM -1. Dette antages at være den samme for biokonjugatet fordi Ru (II) (tpy) 2 -maleimide har minimal absorbans i denne region.
Det skal bemærkes that bioconjugation via cystein-maleimid kemi har adskillige begrænsninger. For det første skal proteinet af interesse har en enkelt, tilgængelig cysteinrest, ellers protein engineering skal udføres for at indføre en. For det andet er det cystein-maleimid bindingen er modtagelig for udveksles med andre frie thioler, såsom albumin og glutathion i forbindelse med plasma applikationer 19. Denne udveksling er meget afhængig af opløsningsmidlet tilgængelighed og lokal ladning på overfladen af proteinet. Maleimid-thiol bindinger kan stadig være egnet til plasma applikationer, men langsigtede stabilitet bør kontrolleres ved hjælp af massespektrometri og gelelektroforese.
Trods dette, den meget specifikke, højtydende fastgørelse af hidtil ukendte molekyler, såsom fluorescerende farvestoffer, redoxcentre, polymerer og andre proteiner til proteiner via cystein-maleimid kemi er en kraftfuld teknik, der giver en række interessante makromolekylære konstruktioner at være enccessed. Have store mængder af kemisk veldefinerede protein biokonjugaterne er nøglen til fremtidige undersøgelser, der involverer proteinbinding, selv-samling, enzymkinetik og protein lokalisering. Som påvist ovenfor, udgangsmateriale oprensning, valg af reaktionsmedium, og tilsætningen af supplerende reagenser, som reduktionsmiddel eller overfladeaktive stoffer har alle en betydelig indvirkning på bioconjugation udbytter. Oprensning lettest opnås ved protein-kompatibel kromatografi og karakterisering opnås ved anvendelse af en kombination af MALDI-TOF MS, gelelektroforese, og UV-Vis-spektroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Elsevier: Oxford. (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
