Summary
Dit protocol geeft de belangrijkste stappen voor de bioconjugatie van een cysteïne bevattend eiwit een maleïmide, zoals zuivering reagens, reactieomstandigheden, bioconjugaat zuivering en karakterisering bioconjugaat.
Introduction
Bioconjugatie omvat het covalent koppelen van een biomolecuul met elkaar of met een synthetisch molecuul zoals een kleurstof, geneesmiddel of een polymeer. Eiwit bioconjugatie methoden worden nu op grote schaal gebruikt in tal van chemie, biologie en nanotechnologie onderzoeksgroepen met toepassingen, variërend van fluorescerende kleurstof etikettering 1,2, het maken van eiwit (antilichaam) -prodrugs 3 (antilichaam geneesmiddel conjugaten - ADC) synthese van eiwitten dimeren 4,5 , tot en met zelfassemblerende eiwit-polymeer hybriden 6,7 gebruikt in nanomedicine 8 en systemen chemie 9.
Specificiteit van de chemie voor bioconjugatie, hoewel niet altijd kritisch is van groot belang voor de meeste functioneel eiwit bioconjugaten, zodat het niet interfereert met de actieve plaats van het doeleiwit. De ideale bioconjugatie reactie moet verschillende criteria, waaronder: i) gericht zeldzame of unieke plaatsen op het eiwit van interesse,ii) selectief in de richting van deze doelstelling, iii) gaat u onder niet-denaturerende omstandigheden om eiwitten te voorkomen ontvouwen en iv) zijn hoge opbrengst als het doelwit eiwit is meestal alleen verkrijgbaar bij sub-millimolair concentratie. De maleimide - cysteine Michael-additie benadert voldoen aan al deze criteria, en is daarom lang een bijzondere status op het gebied van bioconjugaatchemie 10 geclaimd. Dit komt omdat i) verschillende proteïnen die slechts één cysteïneresidu op hun oppervlak genetisch daar kunnen worden gemanipuleerd, ii) en het juiste pH de reactie zeer selectief is ten aanzien cysteïne, iii) geleidelijk plaats in waterige buffers en iv) het is zeer snel de tweede orde snelheidsconstante van maleïmiden naar cysteine bevattende eiwitten gerapporteerd 5000 M -1 sec -1 overschrijdt in sommige gevallen 11. Mits het eiwit van belang kan een klein (≈ 5-10%) hoeveelheid organische tolereren hulpoplosmiddel 12, bijna elke maleïmide gefunctionaliseerde kleurstof, poLymer, oppervlak of een ander eiwit te koppelen aan proteïnen. Bovendien, maleïmiden zijn specifiek voor cysteïnen op eiwitten dan iodoacetamides, die meer vatbaar voor reactie met andere nucleofielen bij verhoogde pH zijn; en stabieler dan disulfide-gebaseerde vervoegingen die moeten bij zure pH worden gehouden disulfide uitwisseling 13 te voorkomen.
Hier beschrijven we een algemeen protocol voor de conjugatie van maleïmide gefunctionaliseerde moleculen een eiwit dat een cysteïnerest via de reactie tussen een Ru (II) gebaseerde chromofoor en redoxeiwit cytochroom c als voorbeeld. Dit protocol geldt evenzeer voor de meeste andere eiwitten die een toegankelijk oppervlak cysteïnerest en de overeenkomstige maleïmide gefunctionaliseerde doel, hetzij een ander eiwit, een fluorescerende kleurstof, een chromofoor of een synthetisch polymeer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Noot: Het volgende protocol is ontwikkeld voor de synthese van een eiwit-kleurstof bioconjugaat zoals weergegeven in figuur 1 is een algemeen protocol voor de reactie van een maleïmide met oppervlak cysteine-bevattende eiwitten, met aantekeningen ingevoegde eventueel te helpen met membraaneiwit. bioconjugaten, eiwit-polymeer bioconjugaten en synthetische dimeer eiwit (proteïne-proteïne) bioconjugaten. In dit specifieke geval het eiwit iso-1 cytochroom c één oppervlak cysteïneresidu beschikbaar om te reageren waardoor een zeer specifieke labeling plaatsvindt. Indien een eiwit van belang heeft meerdere cysteïneresten, hetzelfde protocol geldt, zij het met het verlies van specificiteit en producthomogeniteit. Chemie gericht oppervlak lysineresiduen, met gebruikmaking van N-hydroxysuccinimidyl-esters of isothiocyanaten, kan een eenvoudiger benadering als specificiteit niet vereist.
1. Zuivering van Cytochroom c
Opmerking: Deze stap is niet voor alle eiwitten. Het is echter belangrijk te weten dat een eiwit verkregen van een commerciële leverancier andere, ongewenste eiwit isovormen die moet worden verwijderd door verdere zuivering 13 kan bevatten.
- Los op 2,4 g natriumdiwaterstoffosfaat (Mw = 120 g mol -1) in 1 liter ultrazuiver water prepare een bufferoplossing met 20 mM NaH 2PO 4. Stel de pH met 1 M NaOH tot pH 7.
Opmerking: De fosfaatbuffers die in dit protocol moet vers worden bereid op een dagelijkse basis, en gefiltreerd door een 0,2 urn membraanfilter cellulose voorafgaande aan gebruik. - Oplossen 29,22 g natriumchloride (Mw = 58,44 g mol -1) in 500 ml 20 mM NaH 2PO 4 buffer om een 20 mM NaH 2PO 4 en 1 M NaCl buffer maken. Dit is de elutiebuffer voor de zuivering in stap 1,6).
- Los op 12,0 mg van gelyofiliseerde cytochroom c (cyt c) in 6 ml pH 7 fosfaatbuffer 20 mM.
- Afzonderlijk ontbinden 14,7 mg dithiothreitol (DTT, Mw = 154,25 g / mol) in 95,3 ul van ultrapuur water om een 1 M voorraadoplossing te bereiden.
Opmerking: De DTT voorraad moet vers worden bereid, zoals dit reagens gevoelig voor oxidatieve deactivering in waterige oplossing. - Pipette 60 ul van de 1 M DTT oplossing in de eiwitoplossing om de cyt c verminderen. De kleur van de oplossing verandert van donkerrood tot lichtrood na mengen.
- Filter de gereduceerde proteïne oplossing door een 0,22 pm lage eiwitbinding PVDF spuitfilter alvorens te injecteren op elk chromatografische media.
- Bevestig een 3,3 ml sterke kationuitwisselingskolom tussen injectieblok en UV-Vis detector een Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) instrument.
- Equilibreren van de kolom met 3 kolomvolumes ultrazuiver water, gevolgd door 3 kolomvolumes 20 mM pH 7 fosfaatbuffer, met een stroomsnelheid van 1 ml / min.
- Load 1 ml van gereduceerde ruwe cyt c in de injectieblok, en start een gradient methode 328-450 mM NaCl, over 5 kolomvolumes. Bewaken van de 280 nm en 410 nm kanalen van de UV-Vis-detector, en het verzamelen van de grootste piek.
- Verhoging van de zoutconcentratie tot 1 M 2 kolomvolumes elueerde iso-2 cytochroomo o en na de kolom wordt gespoeld, opnieuw equilibreren van de kolom met 2 kolomvolumes 20 mM fosfaatbuffer voor het injecteren van de volgende ruwe monster.
- Herhaal de stappen totdat alle 1,9-1,10 ruw eiwit is gezuiverd.
- Pool de iso-1 bevattende fracties en concentreren ze met behulp van een 3,5 kDa molecuulgewicht Cutoff (MWCO) spin-filter en centrifugeren bij 3000 x g.
- Laad de geconcentreerde eiwit in 3,5 kDa MWCO dialyse cassettes en dialyze tegen ultrapuur water 's nachts, met 2 veranderingen van water.
- Bepaal de concentratie van de zuivere, geconcentreerde proteïneoplossing door middel van 10 pl, verdunnen tot 100 gl met ultrazuiver water, en met een absorptiespectrum. Gebruik een lage volume 100 ul kwartscuvette eiwit absorptiespectra verkrijgen. Kenmerkend is de onverdunde eiwitconcentratie in de orde van 50 - 100 pM.
- Gebruik de karakteristieke 410 nm piek van cyt c om de concentratio kwantificerenn het gebruik van de Beer-Lambert wet met een maal absorbeerbaarheid waarde van 97,6 cm -1 mM -1:
A = ε × c × ι
waarbij A de absorptie, ε is de molaire absorptie, c de concentratie in mM en ι is de weglengte van de cuvet in cm 13.
- Gebruik de karakteristieke 410 nm piek van cyt c om de concentratio kwantificerenn het gebruik van de Beer-Lambert wet met een maal absorbeerbaarheid waarde van 97,6 cm -1 mM -1:
- Op dit punt, verdeel het eiwit in 1 ml porties en bewaar ingevroren bij -20 ° C totdat ze nodig zijn. Cyt c kan worden ingevroren en ontdooid zonder verlies van structuur of functie, maar herhaalcycli zal beginnen om het eiwit te denatureren.
Opmerking: Eiwitten tolereren bevriezen in verschillende mate. Bijvoorbeeld groen fluorescerend eiwit 5,9 mag niet worden ingevroren, maar in de koelkast bewaard.
2. Synthese van cytochroom c Bioconjugaten
- Los op 0,9 mg van ruthenium (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (tpy) 2 maleïmide, 0,975 umol, 6 equivalenten) in 600 ui acetonitril.
Opmerking: Als de maleimide gebruikt is oplosbaar in water, voor te bereiden een stock-oplossing in water in plaats van acetonitril. Het is belangrijk dat de maleïmide oplosbare in de reactiebuffer zijn. Dimethylsulfoxide worden N, N-dimethylformamide en acetonitril alle gangbare toevoegsels om te helpen bij het oplossen van laagmoleculaire 12, vaak hydrofoob maleïmide reactanten. - Bereid een bufferoplossing met 100 mM fosfaatbuffer en 100 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA, Mw = 292,24 g / mol), die, wanneer verdund tot 20 mM bij pH 7. Voeg vast natriumhydroxyde totdat het EDTA opgelost (enkele grammen meestal ) en breng de pH op 7.
- Los op 2,87 mg Tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP 15, Mw = 286,65 g / mol) in 1 ml ultrazuiver water om een 10 mM voorraadoplossing te bereiden. Deze stap is importmier dat de cysteïne op het proteïne volledig vóór maleïmide koppeling 15 wordt verminderd.
Opmerking: De TCEP voorraadoplossing moet vers worden bereid voor elke reactie, aangezien dit reagens gevoelig is voor oxidatieve deactivering in waterige oplossing. - Combineer 11,4 ml ultrazuiver water met 3 ml 100 mM fosfaat / EDTA stockoplossing in een 50 ml plastic buis. Bij het verder verdund met eiwit en maleimide stamoplossingen de buffer concentratie zal zijn 20 mm.
Opmerking: Als het eiwit gelabeld is een transmembraaneiwit ervoor dat een geschikte detergens wordt toegevoegd aan de buffer om het eiwit oplosbaar. Als een reinigingsmiddel niet gebruikt wordt het membraan eiwit kan langzaam neerslaan, die een negatieve invloed reactie opbrengsten. Gebruik het reinigingsmiddel in alle volgende zuiveringsstappen. - Voeg 0,15 umol (3 ml van een 50 pM oplossing, 1 equivalent) gezuiverd cyt c de fosfaat-EDTA buffer.
- Voeg 7,5 ul van de TCEP voorraad solution (0,075 umol, 0,5 equivalent) aan de eiwitoplossing en laat roeren gedurende 5 minuten aan een eiwit dat kan zijn gedimeriseerd cysteine door oxidatie te verminderen.
Opmerking: Weet TCEP niet toevoegen als het eiwit van interesse niet gemakkelijk dimeriseren. Controleer dit door het uitvoeren van een eiwit gel onder niet-reducerende omstandigheden. - Voeg 600 ul van de oplossing van acetonitril Ru (II) (tpy) 2 maleïmide de verminderde, gebufferde oplossing van cyt c, en laat het reactiemengsel onder roeren in het donker, bij kamertemperatuur, gedurende 24 uur.
- Concentreer het reactiemengsel met behulp van 3,5 kDa MWCO spin-filters, centrifugeren bij 3000 xg, herhalen 2-3 keer met verse 20 mM fosfaatbuffer tot het filtraat helder is. Verwijder zoveel ongereageerd maleïmide uit het reactiemengsel mogelijk vóór de volgende stap van de zuivering.
Opmerking: Op dit punt kan het ruwe mengsel bioconjugatie worden bewaard in de koelkast in het donker. Het is belangrijk om ongereageerde kleurstof maleïmide door cv verwijderenifuge dialyse vóór opslag als maleïmide kan langzaam en niet-specifiek reageren met lysine residuen op het oppervlak van het proteïne.
3. Zuivering van Cytochroom c Bioconjugaten
- Los op 2,4 g natriumdiwaterstoffosfaat en 29,22 g natriumchloride in 1 liter ultrazuiver water om een bufferoplossing met 20 mM NaH 2PO 4 en 0,5 M NaCl bereid. Dit is de loopbuffer de geïmmobiliseerde metaal affiniteitschromatografie (IMAC) zuivering.
- Los op 17 g imidazool (Mw = 68,077 g mol -1) in 500 ml 20 mM NaH 2PO 4 en 0,5 M NaCl buffer. Dit is de elutiebuffer de IMAC zuivering.
- Breng de pH van beide buffers tot pH 7 met behulp van 1 M NaOH of HCl, en filteren door 0,22 urn geregenereerde cellulose membranen voor gebruik in de FPLC.
- Zoals de IMAC kolommen gekocht worden geleverd zonder metaalionen op de col geladenUMN Bereid de kolom een Ni2 + -gebaseerde zuivering door wassen van de kolom met 3 ml ultrazuiver water, 3 ml 100 mM nikkelacetaat-oplossing en 6 ml ultrazuiver water. Als de kolom wordt niet onmiddellijk gebruikt doorspoel 3 ml 20% ethanol en bewaar de kolom in de koelkast om bacteriegroei te voorkomen.
- Bevestig een Ni-geladen 2 + 1 ml IMAC kolom aan de FPLC tussen de injectie lus en UV-Vis detector.
- Equilibreren van de kolom met 3 kolomvolumes van 20 mM fosfaat, 0,5 M NaCl buffer met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min.
- Belasting 100 pl ruwe reactiemengsel (gefiltreerd door een 0,22 urn spuitfilter) op de kolom Ni2 + IMAC. Was de kolom met 3 kolomvolumes loopbuffer om de niet-gereageerde cyt c elueren, gevolgd door een imidazoolgradiënt 0-125 mM dan 3 kolomvolumes de ruthenium bisterpyridine-cytochroom c bioconjugaat elueren (Ru (II) -CYT c) .
- Was de column met 250 mM imidazool buffer gedurende 5 kolomvolumes, vervolgens opnieuw equilibreren van de kolom met 20 mM fosfaat, 0,5 M NaCl en herhaal stap 3,7 tot alle ruwe bioconjugaat is gezuiverd.
- Zwembad de bioconjugaat fracties en concentreren ze met behulp van een 3,5 kDa MWCO spin-filter, centrifugeren bij 3000 x g.
- Laad de geconcentreerde bioconjugaat in 3,5 kDa MWCO dialyse cassettes en dialyze tegen ultrapuur water 's nachts, met 2 veranderingen van water.
- Bepaal de concentratie van de zuivere, geconcentreerde oplossing bioconjugaat door UV-Vis, met dezelfde molaire absorptie waarde iso-1 cytochroom c (97,6 mM -1 cm -1) bij 410 nm. Kenmerkend is de bioconjugaat concentratie in de orde van 50 - 100 pM.
- Verdeel de bioconjugaat in 25 ul porties en bewaar bevroren bij -20 ° C totdat ze nodig zijn.
4. Karakterisering van cytochroom c Bioconjugaten
- afschrikkenling van bioconjugaat massa door MALDI-TOF MS
- Los 10 mg cafeïne zuur in 1 ml van een acetonitril / water / trifluorazijnzuur-oplossing (80: 20: 0,1, v / v / v).
- Verdun 5 gl geconcentreerde proteïneoplossing met 5 ui caffeic zuuroplossing.
- Spot 0,5 pi caffeïnezuur oplossing op de MALDI richtplaat en laat de oplossing te drogen.
- Spot 0,5 pi van het monster / matrix-oplossing op de top van deze cafeïne zuur plek, zodat de plek om te drogen. Spot nog 0,5 ul van het monster matrix op de top van dit "sandwich" het monster tussen de lagen van de matrix, en laten drogen.
- Acquire massaspectra in lineaire modus met behulp van geschikte instrument instellingen voor eiwitten 16.
- Onderzoek van bioconjugaten door gelelektroforese
- Bereid 10 pi van elk eiwit monster te worden gerund door verdunnen eiwit monsters met een vooraf gemengd lithium dodecylsulfaat (LDS, pH 8,4) buffer (4x) to een eindconcentratie van ongeveer 20 ug per putje. Voor putten die vereisen reducerende omstandigheden, voeg 1 pl van 500 mM dithiothreitol (DTT) reduceermiddel (10x).
- Warmte monsters bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
- Voeg 50 ml voorgemengde 1 M MES, 1 M Tris-base, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7,7) loopbuffer mengsel (20x) van een commerciële bron 950 ml ultrazuiver water aan de gel loopbuffer bereiden.
- Verwijder de plastic kam uit de gel en plaats de gel in de gel running tank. Tanken met gel loopbuffer zodat de putjes worden bedekt met buffer.
- monsters lading voorzichtig op een prefab 12% Bis-Tris, 1 mm, 10-well gel met behulp van lange pipet tips om te helpen bij het laden. Laad de prestained 10 eiwit moleculair gewicht marker (3-188 kDa) in een middelste putje van de gel om de analyse te helpen.
- Voer de elektroforese bij 200 V constant voltage gedurende 35 minuten.
- Vlekken op de gel met Coomassie blue commerciële oplossing gedurende 2 uur, en was met ultrapure water gedurende 48 uur.
- Bepaling van bioconjugaat zuiverheid UV-Vis spectroscopie
- Bereid 120 gl 5 uM oplossing van Ru (II) (tpy) 2 maleïmide, iso-1 cyt c, en Ru (II) -CYT c.
- Meet de basislijn spectrum van de kwartscuvette met alleen ultrapuur water, van 250 nm tot 650 nm.
- Meet het spectrum van elk onderdeel, zodat de cuvette gespoeld en gedroogd tussen elke meting.
- Zet de absorptie van elk bestanddeel als functie van de golflengte, en vergelijk de lineaire som van de uitgangsmaterialen met het eindproduct te bepalen of een 1: 1 verhouding van Ru (II) (tpy) 2 maleïmide aan cyt c gereageerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De synthese van bioconjugaten wordt bevestigd door drie primaire methoden:-MALDI Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), polyacrylamide gelelektroforese en ultraviolet-zichtbaar licht (UV-Vis) spectroscopie, zoals weergegeven in figuren 2, 3 en 4. Een massatoename overeenkomt met de massa van de bijgevoegde kleine moleculen en het ontbreken van een ongereageerd eiwit toont de succesvolle covalente koppeling van Ru (II) (tpy) 2 maleïmide aan cyt c en daaropvolgende zuivering van het bioconjugaat. Het UV-Vis spectrum van het bioconjugaat kan de opbrengst te berekenen met de absorptie bij 410 nm, en door het vergelijken van het spectrum met het verwachte 1: 1 toevoeging spectrum van de uitgangsmaterialen de samenstelling van het bioconjugaat kan worden afgeleid. In het bovenstaande voorbeeld, de opbrengst nogal varieert van partij tot partij, maar in het algemeen tussen 15-27% na FPLC Purifica15 tie.
Bovendien, het verschijnen van een nieuwe piek in het chromatogram tijdens zuivering bevestigt de synthese van een nieuwe soort. Dit wordt geïllustreerd in figuur 5, waarbij analyse van de verschillende UV-Vis sporen kan aangeven of een species bevat de Ru (II) (tpy) 2 maleïmide component.
Figuur 2. MALDI-TOF massaspectra van eiwitten. Massa spectra van zuivere iso-1 cytochroom c (zwart) en Ru (II) -CYT c (rood). Pieken worden waargenomen die overeenkomen met de berekende massa van iso-1 cyt c (12.706 Da) en Ru (II) -CYT c (13.559 Da) met een caffeïnezuur adduct zichtbaar bij 179 Da. Dit adduct wordt gezien in grotere hoeveelheden in het ongereageerde cyt c spectra door reactie tussen de α, β-onverzadigde carbonyl van cafeïne zuur en het vrije thiol van het eiwit bij hoge energie MALDI omstandigheden. Matrixadducten worden vaak gezien in MALDI-MS en kan zowel covalente als niet- covalente aard zijn. Spectra zijn basislijn gecorrigeerd, lawaai gefilterd, en genormaliseerd ter vergelijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. SDS-PAGE van eiwitten. 12% Bis-Tris gel van gereduceerd en niet-gereduceerde cyt C en Ru (II) -CYT c. Laan 3 bevat een pre-lood eiwit standaard, met polypeptide massa geannoteerde aan de rechterkant van elke band (kDa). Klik hier om een grotere versio bekijkenn van deze figuur.
Figuur 4. UV-Vis spectra van eiwitten: Het absorptiespectrum van Ru (II) -CYT c (groen) komt nauw overeen met de lineaire toevoeging (streeplijnen blauw) zuiver ongereageerd cyt c (rood) en niet gereageerd Ru (II) ( ton per jaar) 2 maleïmide (zwart). Dit toont aan dat de biologisch conjugaat bestaat uit een 1:. 1 bevestiging van de maleimide aan het eiwit Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5 Chromatogram van Ni-IMAC zuivering van bioconjugaten: IMAC spoor van Ru (II) -CYT c zuivering. UV-Vis sporen: 410 nm komt overeen met de Soret band van cyt c, 280 nm komt overeen met zowel cyt c en Ru (II) (ton per jaar) 2 maleïmide, en 475 nm komt overeen met de metaal-op-ligand ladingsoverdracht band van het ruthenium (II) complex. Klik hier om te bekijken grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zuivering van de uitgangsmaterialen voor een bioconjugatie van het allergrootste belang. Proteïnen verkregen uit commerciële recombinante bronnen bevatten vaak andere isovormen van het eiwit van belang, die verschillende oppervlaktechemie en reactiviteit hebben. Bijvoorbeeld in de beschreven bioconjugatie, in de handel verkrijgbare cyt c bevat een mengsel van beide iso-1 en iso-2 cyt c 12,14,17. Iso-2 en iso-1 vormen van cytochroom c grotendeels homoloog, met als belangrijkste verschil is de aanwezigheid van een vrije cysteïnerest nabij de C-terminus van iso-1 cytochroom c. In het hier gegeven voorbeeld wordt zuivering bereikt met waterige sterke kationenwisselingshars FPLC echter andere vormen van FPLC zoals anionenuitwisseling, affiniteit, hydrofobe of grootte-exclusie chromatografie mogelijk meer van toepassing zijn. Het eiwit wordt ook verminderd in deze stap dat de cysteïnerest op het eiwit van belang (hier cytochroom c) fully gereduceerd vóór bioconjugatie de maleimide gekoppelde doelwit. Verder is het nuttig op basis waarvan de maleïmide toegevoegd klein molecuul voor gebruik met een cysteïne bevattend eiwit is zuiver en dat de maleimide heeft geen reactie opgeslagen ondergaan, zoals maleïmiden zijn licht en temperatuurgevoelig. Dit kan snel en eenvoudig worden gecontroleerd door middel van 1H NMR, als vinyl protonen van een intact maleimide verschijnt als een singlet bij 6-6,5 ppm, terwijl de protonen van een open maleïmide zal verschuiven upfield; en ook massaspectrometrie, met een open maleïmide ring overeenkomt met een Da massale toename van 18.
Buffer keuze, pH, en de toevoeging van hulpstoffen zoals detergenten, organische oplosmiddelen, en reductiemiddelen zal een diepgaand effect op bioconjugatie opbrengst 5,15 hebben. Bij een Michael additie van een maleïmide en een thiol, moet de pH boven 6 nog onder 8 voor een snelle, specifieke reactie plaatsvindt. Beneden pH 6, specificiteit hooghet maleïmide niet kunnen reageren met aminen, maar het thiol geprotoneerd en dus een slecht nucleofiel Michael toevoeging leidt tot een langzame reactie. Boven pH 8, kunnen oppervlakte lysineresten gedeprotoneerd worden en reageren met beschikbare maleïmiden, wat leidt tot een niet-specifieke covalente binding van het maleimide component aan het eiwit. Fosfaatbuffer wordt in deze bioconjugatie omdat het een sterke buffer in het pH-traject en heeft geen wisselwerking met elk van de reagentia. Tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris) buffer, bijvoorbeeld, zou een slechte keuze als de aminegroep in deze buffer zou kunnen reageren met de maleïmide, wat zou leiden tot slechte opbrengsten zijn. Oplosbaarheid van reagentia is ook belangrijk om hoge opbrengsten. De toevoeging van kleine hoeveelheden (<10% v / v) organisch oplosmiddel kan helpen bij het oplossen van niet-polaire componenten, terwijl de juiste pH en zoutconcentratie essentieel voor het houden van eiwitten in oplossing en 12 gevouwen. Voor grote membraan Proteins met grote hydrofobe resten oppervlak, een surfactant noodzakelijk om te voorkomen dat het eiwit van 18 neerslaan.
Indien het eiwit in de bioconjugatie is gevoelig voor oxidatie en dimerisatie, heeft de toevoeging van een reductiemiddel zoals TCEP aangetoond bioconjugatie opbrengst 15 te verbeteren. De in situ reductie van het eiwit aan de monomere vrije thiol-vorm kan een groter aantal actieve plaatsen thiol toegankelijk zijn na het maleïmide. Echter, volgorde van toevoeging en stoichiometrie is de sleutel tot een succesvolle opbrengstverhoging als TCEP zal reageren met maleïmide. Het plakken maleimide na TCEP wordt de TCEP worden door verlaging van de proteïne eerst. Half equivalent TCEP eiwit wordt gebruikt om dezelfde reden, dat een te TCEP niet beschikbaar ongunstig reageren met het vrije maleïmide. Structurele disulfidebruggen aan de binnenkant van het eiwit waarschijnlijk niet worden beïnvloed door de toevoeging van TCEPof andere reducerende middelen zoals DTT, mits het eiwit niet denaturerende omstandigheden wordt gehouden zoals hoge temperatuur of een hoge concentratie van ureum. Bijvoorbeeld, de toevoeging van een grote overmaat aan DTT cyt c voorafgaand aan FPLC zuivering heeft geen significant effect op de hoeveelheid eiwit teruggewonnen na zuivering hebben. Als vermindering van cysteïnebruggen structurele door TCEP wordt vermoed, kan bevestigd worden door het uitvoeren van een eiwit gel onder oorspronkelijke, niet-denaturerende omstandigheden.
De Ru (II)-bisterpyridine gemerkte cytochroom c gesynthetiseerd in deze werkwijze wordt gezuiverd door Ni2 + geïmmobiliseerd metaal affiniteitschromatografie 14. Andere zuiveringsmethoden bestaan, zoals grootte-uitsluitingschromatografie, anion / kation uitwisselingschromatografie, affiniteitschromatografie en specifieke zoals een antilichaam stationaire fase. In het algemeen is de methode blijft hetzelfde als hierboven beschreven, met de concentratie en dialyse stappen following chromatografische zuivering bioconjugaat het product naar een geschikte buffer voor opslag.
De primaire methode voor het bepalen of een bioconjugatie gelukt is via MALDI-TOF MS. Het is de meest nauwkeurige manier om het kleine verschil in massa tussen natieve eiwit en eiwit covalent gelabeld met een klein molecuul, een verschil vaak minder dan 1000 Da bepalen. Het moeilijkste deel van het runnen van een MALDI-TOF MS experiment is matrix keuze en het spotten van techniek; echter caffeïnezuur is gebleken een betrouwbare, universele matrix voor de analyse van de eiwitten en biologische conjugaten gebruikt in dit werk. Als een mogelijk alternatief, sinapinezuur is een veelgebruikte MALDI matrix voor de analyse van eiwitten. Analyse van MALDI-TOF MS-gegevens is relatief eenvoudig. Figuur 2 toont de typische MALDI-TOF MS spectrum van zowel zuivere iso-cyt c 1 (Mw = 12.706 Da) en zuiver Ru (II) -CYT c (Mw = 13.559 Da), die beide nauw overeenkomt met de berekende molecuulmassa. De zuiverheid kan ook worden waargenomen, wijzend op het ontbreken van een iso-2 cytochroom c piek (Mw = 12.532 Da) in het ongereageerde spectrum en het ontbreken van een iso-1 cytochroom c piek in het spectrum bioconjugaat. De massa bioconjugaat kan worden geschat met behulp van gelelektroforese. Figuur 3, een 12% Bis-Tris gel eiwit, levert twee bewijzen voor bioconjugatie. Ten eerste, het ontbreken van een band dimeer onder niet-reducerende omstandigheden van Ru (II) -CYT c geeft aan dat er niet langer een vrij cysteïne, en anderzijds de lichte verschuiving van het bioconjugaat band vertaalt omhoog tot een toename van het molecuulgewicht. Eiwitgels zijn waardevol en kan definitief bewijs van succesvolle bioconjugatie niet alleen voor kleine moleculen attachments, maar ook voor de synthese van eiwit dimeren 5 of eiwit-polymeer bioconjugaten 9.
voor eiwittenbevattende chromoforen zoals groen fluorescerend eiwit of heembevattende cytochromen, UV-Vis spectroscopie wordt gebruikt om de samenstelling en de opbrengst van het bioconjugaat bepalen. De 1: 1 lineair toevoeging van de uitgangsmaterialen spectra maakt de constructie van een hypothetische UV-Vis spectrum van het bioconjugaat, zoals weergegeven in figuur 4 door de werkelijk bioconjugaat spectrum deze 1:. 1 bovendien spectrum, kan de samenstelling afgeleid zijn . Bijvoorbeeld, indien twee of meer Ru (II) (tpy) 2 -maleimides was niet-specifiek gebonden aan het eiwit, de 480 nm band van het bioconjugaat zou die de voorspelde spectrum. Bovendien kan de concentratie van het bioconjugaat worden benaderd met de 410 nm maal absorbeerbaarheid waarde van 97,6 cm -1 -1 mM. Dit is gelijk verondersteld het bioconjugaat omdat de Ru (II) (tpy) 2 maleïmide heeft minimale absorptie in dit gebied.
Opgemerkt that bioconjugatie via cysteïne-maleïmide chemie heeft verschillende beperkingen. Ten eerste moet het eiwit van belang hebben één toegankelijke cysteïnerest of anders eiwitmanipulatie worden uitgevoerd om één introduceren. Ten tweede, de cysteine-maleimide binding gevoelig te wisselen met andere vrije thiolen, zoals albumine en glutathion in de context van plasmatoepassingen 19. De uitwisseling is sterk afhankelijk van de toegankelijkheid voor oplosmiddel en lokale last op het oppervlak van het proteïne. Maleïmide-thiol verbindingen kan nog steeds geschikt zijn voor plasma-toepassingen, maar op lange termijn stabiliteit moeten worden gecontroleerd met behulp van massaspectrometrie en gelelektroforese.
Desondanks hebben de zeer specifieke, hoge opbrengst hechting van nieuwe moleculen zoals fluorescerende kleurstoffen, redoxcentra, polymeren en andere eiwitten om eiwitten via cysteïne-maleïmide chemie is een techniek die een reeks interessante macromoleculaire constructen toelaat een teccessed. Het hebben van grote hoeveelheden chemisch duidelijk omschreven eiwit bioconjugaten is de sleutel tot toekomstige studies met eiwitbinding, zelf-assemblage, enzymkinetiek en eiwit lokalisatie. Zoals hierboven aangetoond uitgangsmateriaal zuivering keuze reactiemedium en dat extra reagentia zoals reductiemiddelen of oppervlakteactieve stoffen staan aanzienlijke gevolgen voor bioconjugatie opbrengsten. Zuivering wordt het gemakkelijkst bereikt door proteïne-compatibele chromatografie en karakterisering wordt uitgevoerd met een combinatie van MALDI-TOF MS, gel elektroforese en UV-Vis spectroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Elsevier: Oxford. (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
