Summary
Ce protocole détaille les étapes importantes nécessaires pour la bioconjugaison d'une cystéine contenant la protéine à un maléimide, y compris la purification des réactifs, des conditions de réaction, la purification de bioconjugués et bioconjugué de caractérisation.
Introduction
Bioconjugaison consiste à lier de façon covalente une molécule biologique avec un autre ou avec une molécule synthétique tel qu'un colorant, un médicament ou un polymère. Méthodes de bioconjugaison de protéines sont maintenant largement utilisés dans de nombreux groupes de recherche chimie, la biologie et de la nanotechnologie avec des applications allant de fluorescent étiquetage de colorant 1,2, ce qui rend la protéine (anticorps) -prodrugs 3 (conjugués anticorps - médicaments - CAN) la synthèse de dimères de protéines 4,5 grâce à des hybrides d'auto-assemblage des protéines utilisées dans les polymères 6,7 nanomedicine 8 et les systèmes de chimie 9.
Spécificité de la chimie utilisée pour la bioconjugaison, tandis que pas toujours critique, est d'une importance capitale pour les bioconjugués protéiques les plus fonctionnels, de manière à ne pas interférer avec le site actif de la protéine cible. La réaction de bioconjugaison idéal doit remplir plusieurs critères, y compris: i) ciblant des sites rares ou uniques sur la protéine d'intérêt,ii) être sélectif vers cet objectif, iii) procéder dans des conditions non dénaturantes pour éviter le dépliement des protéines et iv) être à haut rendement comme la protéine cible est habituellement disponible uniquement à la concentration de sous-millimolaire. Le maléimide - Michael addition de cystéine se rapproche de remplir tous ces critères, et a pour cette raison selon longtemps un statut particulier dans le domaine de la chimie bioconjugué 10. En effet, i) de nombreuses protéines contenant des résidus une seule cystéine sur leur surface peuvent être génétiquement là, ii) au bon pH de la réaction est très sélective vers cystéine, iii) il se déroule sans problème dans des tampons aqueux et iv) il est très rapide avec la seconde constante de vitesse de premier ordre de maléimides à des protéines contenant de la cystéine déclarés dépasse 5 000 M -1 s -1 dans certains 11 cas. Pourvu que la protéine d'intérêt peut tolérer un petit (≈ 5-10%) quantité de co-solvant organique 12, presque tout colorant maléimide fonctionnalisés, poLymer, une surface ou une autre protéine peut être liée aux protéines. En outre, les maléimides sont plus spécifiques pour les cysteines sur les protéines que les iodoacétamides, qui sont plus enclins à réagir avec d'autres agents nucléophiles à un pH élevé; et plus stables que les conjugaisons à base de disulfures, qui doivent être conservés à un pH acide pour empêcher l' échange de disulfure 13.
Nous rapportons ici un protocole générique pour la conjugaison de molécules à fonction maléimide à une protéine contenant un résidu de cystéine unique en utilisant la réaction entre un Ru (II) à base chromophore et la protéine d'oxydo - réduction du cytochrome c à titre d'exemple. Ce protocole est également applicable à la plupart des autres protéines contenant un résidu de cystéine de la surface accessible et la cible correspondante à fonction maléimide, que ce soit une autre protéine, un colorant fluorescent, un chromophore ou un polymère synthétique.
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Protocol
Remarque: Le protocole suivant a été conçu pour la synthèse d'un bioconjugué protéine-colorant , comme illustré sur la figure 1 Il est un protocole général pour la réaction d'un maléimide avec des protéines cystéine libre de surface contenant, avec des notes insérées le cas échéant , pour aider à la protéine membranaire. bioconjugués, bioconjugués protéine-polymère et d'un dimère de synthèse des protéines (protéine-protéine) bioconjugués. Dans ce cas particulier, la protéine iso-1 cytochrome c a un résidu cystéine de surface disponible pour réagir qui permet à un étiquetage très spécifique de se produire. Si une protéine d'intérêt a plusieurs résidus cystéine, le même protocole est applicable, bien que la perte de la spécificité et l'homogénéité du produit. Résidus de lysine de surface de chimie de ciblage, en utilisant les esters ou isothiocyanates de N, peut être une approche plus simple si la spécificité est pas nécessaire.
1. La purification du cytochrome c
Remarque: Cette étape est pas applicable à toutes les protéines. Cependant, il est important de savoir qu'une protéine obtenue à partir d' un fournisseur commercial peut contenir d' autres isoformes de protéines indésirables qui peuvent avoir besoin d'être éliminés par une purification supplémentaire 13.
- Dissoudre 2,4 g de dihydrogénophosphate de sodium (M = 120 g mol -1) dans 1 litre d'eau ultrapure à prepare une solution tampon contenant 20 mM de NaH 2 PO 4. Ajuster le pH avec du NaOH 1 M à un pH de 7.
Remarque: Les tampons phosphates utilisés dans ce protocole doivent être fraîchement préparés sur une base quotidienne, et filtrés à travers un filtre à membrane de 0,2 um de cellulose avant l'utilisation. - Dissoudre 29,22 g de chlorure de sodium (M = 58,44 g -1 mol) dans 500 ml de NaH 2 PO 4 20 mM de tampon pour effectuer une mM de NaH 2 PO 4 20 et du tampon 1 M de NaCl. Ceci est le tampon d'élution pour la purification à l'étape 1.6).
- Dissoudre 12,0 mg du cytochrome c lyophilisé (cyt c) dans 6 ml de pH 7 , 20 mM de tampon phosphate.
- Séparément dissoudre 14,7 mg de dithiothréitol (DTT, M w = 154.25 g / mol) dans 95,3 ul d'eau ultrapure pour préparer une solution mère 1 M.
Remarque: La solution stock TNT doit être préparée fraîchement, car ce réactif est sensible à l'oxydation de désactivation en solution aqueuse. - Pépinette 60 ul de la solution 1 M DTT dans la solution de protéines pour réduire la cyt c. La couleur de la solution passe du rouge foncé au rouge clair lors du mélange.
- Filtrer la solution de protéine réduite à travers un filtre en PVDF de liaison à seringue de 0,22 um faible en protéines avant l'injection sur tout support chromatographique.
- Fixer une colonne d'échange de cations de 3,3 ml forte entre la boucle d'injection et d'un détecteur Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Instrument UV-Vis.
- Équilibrer la colonne avec 3 volumes de colonne d'eau ultra-pure, suivi par 3 volumes de colonne de tampon à pH 7 de phosphate 20 mM, en utilisant un débit de 1 ml / min.
- Charge 1 ml de brut réduit cyt c dans la boucle d'injection, et commencer une méthode de gradient 328-450 mM de NaCl, plus de 5 volumes de colonne. Surveiller les 280 nm et 410 nm canaux du détecteur UV-Vis, et recueillir le plus grand pic.
- Augmenter la concentration en sel de 1 M à 2 volumes de colonne pour éluer iso-2 cytochromee c, et après la colonne a été rincée, ré-équilibrer la colonne avec 2 volumes de colonne de 20 mM de tampon phosphate avant d' injecter le prochain aliquote brut.
- Répétez les étapes 01.09 à 01.10 jusqu'à ce que toute la protéine brute a été purifiée.
- Réunir les fractions contenant iso-1 et les concentrer en utilisant un 3,5 kDa de poids moléculaire Cutoff (MWCO) filtre rotatif et centrifugation à 3000 x g.
- Charger la protéine concentrée dans 3,5 kDa MWCO cassettes de dialyse et dialyser contre ultrapure eau pendant la nuit, avec 2 changements d'eau.
- Déterminer la concentration de la solution de protéine pure, concentrée en prenant 10 pl, diluer à 100 ul avec de l'eau ultra-pure, et en prenant un spectre d'absorbance. Utilisez un faible volume, 100 cuvette de quartz ul pour obtenir les spectres d'absorption des protéines. En règle générale, la concentration en protéine non dilué est de l'ordre de 50 - 100 um.
- Utilisez le pic caractéristique 410 nm de cyt c pour quantifier la Concentration en utilisant la loi de Beer-Lambert avec une valeur d'absorptivité molaire de 97,6 cm -1 mM -1:
A = ε × c × ι
où A est l'absorbance, ε est la capacité d' absorption molaire, c est la concentration en mM et ι est la longueur du trajet de la cuvette 13 en cm.
- Utilisez le pic caractéristique 410 nm de cyt c pour quantifier la Concentration en utilisant la loi de Beer-Lambert avec une valeur d'absorptivité molaire de 97,6 cm -1 mM -1:
- À ce stade, il faut diviser la protéine dans 1 ml aliquotes et garder congelé à -20 ° C jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires. Cyt c peut être congelé et décongelé sans perte de structure ou de fonction, mais les cycles répétés commencera à dénaturer la protéine.
Nota: Les protéines tolèrent le gel à des degrés différents. Par exemple, les protéines fluorescentes vertes 5,9 doivent pas être congelés, à la place conservés dans un réfrigérateur.
2. Synthèse de Cytochrome c bioconjugués
- Dissoudre 0,9 mg de ruthénium (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (tpa) 2 -maléimide, 0,975 umol, 6 équivalents) dans 600 ul d'acétonitrile.
Remarque: Si le maléimide utilisé est soluble dans l'eau, préparer une solution mère dans de l'eau au lieu de l'acétonitrile. Il est important que le maléimide soluble dans le tampon de réaction. Le diméthylsulfoxyde, le N, N - diméthylformamide et l' acétonitrile sont tous les adjuvants couramment utilisés pour aider à la dissolution de faible masse moléculaire 12, souvent des réactifs maléimide hydrophobes. - Préparer une solution tampon contenant 100 mM de tampon de phosphate et 100 mM d' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, M = 292,24 g / mol), qui , lorsqu'elle est diluée à 20 mM est à pH 7. Ajouter de l' hydroxyde de sodium solide jusqu'à ce que l'EDTA soit dissous (plusieurs grammes typiquement ) et ajuster le pH à 7.
- Dissoudre 2,87 mg de Tris (2-carboxyéthyl) chlorhydrate de phosphine (TCEP 15, M w = 286,65 g / mol) dans 1 ml d'eau ultrapure pour préparer une solution mère 10 mM. Cette étape est l'importationant d'assurer que la cystéine sur la protéine est complètement réduite avant le couplage 15 maléimide.
Note: La solution stock PTCE doit être préparée fraîchement pour chaque réaction, que ce réactif est sensible à la désactivation par oxydation en solution aqueuse. - Combinez 11,4 ml d'eau ultrapure avec 3 ml de phosphate mM / EDTA solution mère 100 dans un tube en plastique de 50 ml. Lorsqu'elle est diluée davantage avec des solutions de protéines et de stocks maléimide la concentration du tampon est de 20 mM.
Remarque: Si la protéine étant marqué est une protéine transmembranaire, en sorte qu'un détergent approprié est ajouté au tampon pour solubiliser la protéine. Si un détergent ne sert pas la protéine membranaire peut précipiter lentement, ce qui aura un impact négatif sur les rendements de la réaction. Utiliser le détergent dans toutes les étapes de purification ultérieures. - Ajouter de 0,15 pmol (3 ml d'une solution à 50 um, 1 équivalent) de purifié cyt c dans le tampon phosphate-EDTA.
- Ajouter 7,5 ul du PTCE Stock solution (0,075 mol, 0,5 équivalent) à la solution de protéine et laisser sous agitation pendant 5 min pour réduire toute protéine qui peut avoir dimérisé due à l'oxydation de la cystéine.
Remarque: Ne pas ajouter PTCE si la protéine d'intérêt ne dimériser pas facilement. Vérifier en exécutant un gel de protéine dans des conditions non réductrices. - Ajouter 600 ul de la solution dans l'acétonitrile de Ru (II) (tpa) 2 -maléimide à la solution tamponnée réduite de cyt c et laisser l'agitation du mélange réactionnel, dans l'obscurité, à température ambiante, pendant 24 heures.
- Concentrer le mélange de réaction en utilisant 3,5 filtres de spin kDa MWCO, centrifuger à 3000 xg, répéter 2-3 fois avec des produits frais 20 mM de tampon phosphate jusqu'à ce que le filtrat soit claire. Enlever autant maléimide qui n'a pas réagi à partir du mélange réactionnel que possible avant l'étape suivante de purification.
Remarque: À ce stade, le mélange de bioconjugaison brut peut être conservé au réfrigérateur, dans l'obscurité. Il est important d'enlever n'a pas réagi colorant maléimide par centrifuge dialyse avant stockage maléimide peut lentement et de façon non spécifique réagir avec des résidus de lysine sur la surface de la protéine.
3. Purification du cytochrome c bioconjugués
- Dissoudre 2,4 g de dihydrogénophosphate de sodium et 29,22 g de chlorure de sodium dans 1 L d'eau ultra pure pour préparer une solution tampon contenant 20 mM de NaH 2 PO 4 et 0,5 M de NaCl. Ceci est le tampon en cours d'exécution pour la purification Chromatographie métal affinité immobilisé (IMAC).
- Dissoudre 17 g d'imidazole (Mw = 68,077 g -1 mol) dans 500 ml de 20 mM de NaH 2 PO 4 et du tampon 0,5 M de NaCl. Ceci est le tampon d'élution pour la purification IMAC.
- Ajuster le pH des deux tampons à pH 7 en utilisant du NaOH 1 M ou du HCl, et les filtrer à travers des membranes de 0,22 um de cellulose régénérée avant son utilisation dans la FPLC.
- Comme les colonnes IMAC achetés sont expédiés sans ions métalliques chargés sur le collonne, préparer la colonne pour une purification à base de Ni 2+ par lavage de la colonne avec 3 ml d'eau ultrapure, 3 ml d' une solution d'acétate de nickel 100 mM et 6 ml d'eau ultrapure. Si la colonne ne doit pas être utilisé immédiatement par lavage 3 ml d'éthanol à 20% et de stocker la colonne dans le réfrigérateur pour empêcher la croissance bactérienne.
- Joindre un Ni 2+ 1 ml colonne chargé en IMAC le FPLC entre la boucle d'injection et détecteur UV-Vis.
- Équilibrer la colonne avec 3 volumes de colonne de phosphate 20 mM, tampon de NaCl 0,5 M en utilisant un débit de 0,5 ml / min.
- Charge 100 ul de mélange réactionnel brut (filtré à travers un filtre à seringue de 0,22 um) sur la colonne Ni 2+ IMAC. Laver la colonne avec 3 volumes de colonne de tampon courante pour éluer qui n'a pas réagi cyt c, suivie d'un gradient d'imidazole 0 à 125 mM , plus de 3 volumes de colonne pour éluer le ruthénium bisterpyridine cytochrome c bioconjugué (Ru (II) -cyt c) .
- Laver le cOLONNE avec 250 mM de tampon imidazole pour 5 volumes de colonne, puis ré-équilibrer la colonne avec du phosphate 20 mM, NaCl 0,5 M et répétez l'étape 3.7 jusqu'à ce que tout le bioconjugué brut a été purifié.
- Réunir les fractions de bioconjugués et les concentrer en utilisant une kDa MWCO filtre 3,5 spin, centrifugation à 3000 x g.
- Chargez le bioconjugué concentré dans 3,5 kDa MWCO cassettes de dialyse et dialyser contre ultrapure eau pendant la nuit, avec 2 changements d'eau.
- Déterminer la concentration de la solution pure bioconjugué concentrée par UV-Vis, en utilisant la même valeur d'absorptivité molaire que l' iso-1 cytochrome c (97,6 mM -1 cm -1) à 410 nm. En règle générale, la concentration en bioconjugué est de l'ordre de 50 - 100 um.
- Diviser le bioconjugué en 25 aliquotes et garder congelé à -20 ° C jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires.
4. Caractérisation du cytochrome c bioconjugués
- Dissuadermination de la masse bioconjugué par MALDI-TOF
- Dissoudre 10 mg d'acide caféique dans 1 ml d'une solution / d'eau / acide trifluoroacétique dans l'acétonitrile (80: 20: 0,1 v / v / v).
- Diluer 5 pi de solution concentrée de protéine avec 5 ul d'une solution d'acide caféique.
- Coin 0,5 ul d'une solution d'acide caféique sur la plaque cible MALDI et laisser la solution sécher.
- Spot 0,5 ul de la solution échantillon / matrice sur le dessus de cet endroit de l'acide caféique, laisser place à sécher. Repérez un autre 0,5 pi de matrice de l'échantillon au-dessus de cela "sandwich" l'échantillon entre les couches de la matrice, et laisser sécher.
- Acquérir des spectres de masse en mode linéaire en utilisant les paramètres appropriés de l' instrument pour les protéines 16.
- Etude de bioconjugués par électrophorèse sur gel
- Préparer 10 pi de chaque échantillon de protéine à exécuter par dilution d'échantillons de protéines avec du sulfate dodécylique prémélangée de lithium (LDS, pH 8,4) tampon (4x) toa concentration finale d'environ 20 pg par puits. Pour les puits qui nécessitent des conditions de réduction, ajouter 1 pl de dithiothréitol 500 mM (DTT) Agent (10x) réduire.
- Des échantillons de la chaleur à 70 ° C pendant 10 min.
- Ajouter 50 ml de pré-mélangé 1 M MES, une base M de Tris, 2% de SDS, EDTA 20 mM (pH 7,7) fonctionnant mélange tampon (20x) à partir d'une source commerciale de 950 ml d'eau ultra pure pour préparer le tampon de gel en cours d'exécution.
- Retirez le peigne en plastique à partir du gel et placer le gel dans le réservoir de gel de roulement. Remplir le réservoir avec un tampon de gel de roulement de sorte que les puits sont recouverts avec un tampon.
- Charger les échantillons soigneusement sur un préfabriqué de 12% Bis-Tris, 1 mm, gel à 10 puits en utilisant des embouts de pipette longues pour aider au chargement. Chargez le précolorés 10 protéine marqueur de poids moléculaire (3-188 kDa) dans un puits milieu du gel pour faciliter l'analyse.
- Exécutez le gel à 200 V tension constante pendant 35 min.
- Colorer le gel avec une solution bleue commerciale Coomassie pendant 2 heures, et laver avec ultrapeau ure pendant 48 heures.
- Détermination de la pureté de bioconjugués par spectroscopie UV-Vis
- Préparer 120 ul de solution 5 uM de Ru (II) (tpa) -maléimide 2, l' iso-1 cyt c et Ru (II) c -cyt.
- Mesurer le spectre de la cuvette en quartz contenant de l'eau ultra-pure uniquement de référence, de 250 nm à 650 nm.
- Mesurer le spectre de chaque composant, assurant la cuve est rincée et séchée entre chaque mesure.
- Tracer l'absorbance de chaque composant en fonction de la longueur d' onde, et comparer la somme linéaire des matériaux de départ avec le produit final afin de déterminer si un rapport 1: 1 de Ru (II) (tpa) 2 -maléimide à cyt c a réagi.
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Representative Results
La synthèse de bioconjugués est confirmée par trois méthodes principales: Matrix Assisted Laser Désorption Ionisation spectromètre de masse à temps de vol (MALDI-TOF), l' électrophorèse sur gel de polyacrylamide et ultraviolet-visible par spectroscopie (UV-Vis), comme représenté sur les figures 2, 3 et 4. Une augmentation de la masse correspondant à la masse de la petite molécule jointe et l'absence d'une protéine qui n'a pas réagi démontre avec succès la liaison covalente de Ru (II) (tpa) 2 -maléimide à cyt c et la purification subséquente du bioconjugué. Le spectre du bioconjugué UV-Vis permet le rendement à calculer avec l'absorbance à 410 nm, et en comparant le spectre à un 1 prédit: spectre 1 d'addition des matières premières de la composition du bioconjugué peut être déduit. Dans l'exemple ci-dessus, le rendement varie quelque peu d'un lot à lot, mais elle généralement comprise entre 15 à 27% après FPLC purification 15.
En outre, l'apparition d'un nouveau pic dans le chromatogramme pendant la purification confirme la synthèse d'une nouvelle espèce. Ceci est illustré sur la figure 5, où l' analyse des différentes traces d'UV-VIS peut indiquer si oui ou non une espèce contenant le (II) (tpa) 2 Ru composant -maléimide.
Figure 2. MALDI-TOF Les spectres de masse des protéines. Les spectres de masse pure iso-1 du cytochrome c (noir) et Ru (II) -cyt c (rouge). Peaks peuvent être observées qui correspondent aux masses calculées des iso-1 cyt c (12706 Da) et Ru (II) -cyt c (13559 Da) avec un produit d'addition d'acide caféique visible à +179 Da. Ce produit d' addition est vu dans des quantités plus élevées dans le cyt qui n'a pas réagi c spectra due à une réaction entre l'α, β-carbonyle insaturé de l'acide caféique et le thiol libre de la protéine dans des conditions MALDI à haute énergie. adduits Matrix sont fréquemment observées dans MALDI-MS et peuvent être à la fois covalente et non covalente dans la nature. Spectra sont corrigées de base, le bruit filtré et normalisé pour la comparaison. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : SDS-PAGE des protéines. 12% Bis-Tris de gel réduit ou non réduit cyt c et Ru (II) c -cyt. Lane 3 contient une protéine standard pré-teinté, avec une masse de polypeptide annotée à la droite de chaque bande (kDa). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
La figure 4. spectres UV-vis des protéines: Le spectre d'absorption de Ru (II) , c -cyt (vert) correspond sensiblement à l'addition linéaire ( en pointillé bleu) de pureté, qui n'a pas réagi cyt c (rouge) et qui n'a pas réagi de Ru (II) , ( tpa) 2 -maléimide (noir). Cela démontre que le bioconjugué se compose d'un 1: 1. Fixation du maléimide à la protéine S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Chromatogramme de Ni-IMAC purification de bioconjugués: IMAC trace de Ru (II) -cyt c purification. UV-Vis trace: 410 nm correspond à la bande Soret de cyt c, 280 nm correspond à la fois cyt c et Ru (II) (tpa) 2 -maléimide et 475 nm correspond à la bande du ruthénium complexe (II) métal-ligand transfert de charge. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une une plus grande version de ce chiffre.
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Discussion
Purification des matières premières avant une bioconjugaison est d'une importance capitale. Les protéines obtenues à partir de sources recombinantes du commerce contiennent souvent d'autres isoformes de la protéine d'intérêt, qui peut avoir différentes chimie de surface et de la réactivité. Par exemple, dans la bioconjugaison décrit, la cyt disponible dans le commerce c contient un mélange des deux iso-1 et iso-2 cyt c 12,14,17. Iso-2 et l' iso-1 forme de cytochrome C sont en grande partie homologue, la principale différence étant la présence d'un résidu cystéine libre près de l' extrémité C-terminale de l' iso-1 cytochrome c. Dans cet exemple, la purification est réalisée avec une solution aqueuse forte FPLC échangeuse de cations, cependant, d'autres formes telles que FPLC échangeuse d'anions, l'affinité hydrophobe ou la chromatographie d'exclusion de taille peut être plus applicable. La protéine est également réduite dans cette étape pour faire en sorte que le résidu de cystéine de la protéine d'intérêt (ici le cytochrome c) est fully réduite avant bioconjugaison avec la cible de maléimide lié. En outre, il est utile de savoir si la petite molécule maléimide annexé à être utilisé avec une cystéine contenant la protéine est pur et que le maléimide n'a pas subi une réaction en stockage, les maléimides sont légers et sensibles à la température. Cela peut être rapidement et facilement vérifié par RMN 1 H, comme les protons vinyliques d'un maléimide intact apparaît comme un singulet à 6-6,5 ppm, alors que les protons d'une maléimide ouverte se déplacera à travers le terrain; ainsi que la spectrométrie de masse, avec un anneau maléimide ouvert correspondant à une augmentation de 18 Da de masse.
Choix du tampon, le pH et l'inclusion d'adjuvants tels que les détergents, les solvants organiques, et des agents réducteurs auront un effet profond sur les rendements de bioconjugaison 5,15. Dans le cas d'une addition de Michael d'un maléimide et d'un thiol, le pH doit être supérieur à 6 mais inférieure à 8 pour une réaction spécifique rapide de se produire. Ci-dessous un pH de 6, la spécificité est élevéele maléimide ne sera pas capable de réagir avec des amines quelconques, mais le thiol est protonée et est un mauvais nucléophile pour l'addition de Michael qui conduit à une réaction lente ainsi. PH supérieur à 8, des résidus de lysine de surface peuvent être déprotoné et réagir avec des maléimides disponibles, ce qui conduit à une liaison covalente non spécifique du composant maléimide de la protéine. un tampon phosphate est utilisé dans cette bioconjugaison, car il est un puissant tampon dans cette plage de pH et ne réagit pas avec l'un des réactifs. Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris) tampon, par exemple, serait un mauvais choix que le groupe amine dans ce tampon pourrait potentiellement réagir avec le maléimide, ce qui conduirait à des rendements médiocres. La solubilité de tous les réactifs est également essentielle pour des rendements élevés. L'addition de petites quantités (<10% v / v) de solvant organique peut aider à la dissolution des composants non polaires, tandis que le pH correct et la concentration en sel sont essentiels pour maintenir les protéines en solution et 12 plies. Pour les grandes protei à membranens avec des résidus de surface hydrophobes significatifs, un agent tensioactif est nécessaire pour éviter la précipitation de la protéine 18.
Si la protéine dans la bioconjugaison est sujette à l' oxydation et à la dimérisation, l'addition d'un agent réducteur tel que le TCEP a été montré pour améliorer les rendements de 15 bioconjugaison. La réduction in situ de la protéine à sa forme thiol libre monomère permet une plus grande proportion de sites thiol actifs devant être accédé par le maléimide. Cependant, l'ordre d'addition et de stoechiométrie est la clé d'une augmentation réussie du rendement que PTCE sera également réagir avec maléimide. En ajoutant le maléimide après TCEP, la TCEP sera consommée en réduisant d'abord la protéine. un demi équivalent de TCEP à une protéine est utilisée pour la même raison, de sorte que l'excès de TCEP ne sont pas disponibles pour réagir défavorablement avec le maléimide libre. des ponts disulfure de structure à l'intérieur de la protéine ne sont pas susceptibles d'être affectés par l'addition de TCEPou d'autres agents réducteurs tels que le DTT, à condition que la protéine ne soit pas maintenue dans des conditions dénaturantes telles que des températures élevées ou une forte concentration d'urée. Par exemple, l'addition d'un grand excès de DTT Cyt c avant la purification par FPLC n'a pas d'effet significatif sur la quantité de protéine récupérée après purification. Si la réduction des ponts structurels de cystéine par TCEP est suspectée, ce qui peut être confirmé par l'exécution d'un gel de protéine dans des conditions non dénaturantes natives.
Ru (II) bisterpyridine marqué cytochrome c synthétisé dans ce procédé est purifié par Ni 2+ métal Immobilisé 14 Chromatographie d' affinité. D'autres procédés de purification existent, telles que la Chromatographie d'exclusion de taille, la chromatographie anionique / d'échange de cations, et la chromatographie d'affinité spécifique telle qu'une phase stationnaire d'anticorps. D'une manière générale, le procédé reste le même que celui décrit ci-dessus, avec concentration et dialyse étapes following purification chromatographique pour retourner le produit de bioconjugués à un tampon approprié pour le stockage.
La principale méthode de déterminer si une bioconjugaison est réussie est par MALDI-TOF MS. Il est le moyen le plus précis pour déterminer la petite différence de masse entre la protéine native et de protéines de manière covalente marquée avec une petite molécule, une différence souvent inférieure à 1000 Da. La partie la plus difficile de diriger une expérience MALDI-TOF MS est le choix de la matrice et spotting technique; Cependant l'acide caféique a été jugée, une matrice d'usage général fiable pour l'analyse des protéines et bioconjugués utilisées dans ce travail. En tant que solution de rechange possible, l'acide sinapinique est une autre matrice MALDI couramment utilisée pour l'analyse des protéines. L' analyse des données MALDI-TOF MS est relativement simple. La figure 2 montre le spectre typique MALDI-TOF MS des deux pures iso-1 cyt c (M w = 12706 Da) et pur Ru (II) -cyt c (Mw = 13559 Da), les deux qui correspondent étroitement à la masse moléculaire calculée. La pureté peut également être observé, notant l'absence d'un cytochrome c pic iso-2 (M w = 12532 Da) dans le spectre qui n'a pas réagi et l'absence d'une iso-1 cytochrome c pic dans le spectre de bioconjugués. La masse bioconjugué peut également être estimée par électrophorèse sur gel. La figure 3, d' un gel à 12% de la protéine Bis-Tris, fournit deux éléments de preuve pour bioconjugaison. Tout d' abord, l'absence d'une bande de dimère dans des conditions non réductrices pour Ru (II) -cyt c indique qu'il n'y a pas plus d' une cystéine libre, et d' autre part, le léger glissement de la bande de bioconjugués se traduit par le haut à une augmentation de la masse moléculaire. Gels de protéines sont inestimables et peuvent fournir une preuve définitive de bioconjugaison avec succès , non seulement pour les petites pièces jointes de la molécule, mais aussi pour la synthèse de dimères de protéine 5 ou protéine-polymère bioconjugués 9.
pour les protéinescontenant des chromophores tels que la protéine fluorescente verte ou cytochromes contenant hème, spectroscopie UV-Vis est utilisée pour déterminer la composition et le rendement du bioconjugué. L'addition 1: 1 linéaire des spectres des matériaux de départ permet la construction d'un spectre UV-Vis hypothétique du bioconjugué, comme représenté sur la figure 4 en comparant le spectre de bioconjugués réelle à ce 1: 1. Spectre d'addition, la composition peut être déduite . Par exemple, si deux ou plus de Ru (II) (tpa) 2 -maleimides avaient attaché de manière non spécifique à la protéine, la bande 480 nm du bioconjugué serait plus élevé que le spectre prédit. En outre, la concentration du bioconjugué peut être approchée de la nm en utilisant la valeur de capacité d' absorption molaire de 410 cm -1 97,6 mM -1. Ceci est supposé être le même pour le bioconjugué , car le Ru (II) (tpa) -maléimide 2 présente un minimum d' absorption dans cette région.
Il convient de noter that bioconjugaison via la chimie de cystéine-maléimide présente plusieurs limites. En premier lieu, la protéine d'intérêt doit avoir un seul résidu cysteine accessible ou encore l'ingénierie des protéines doivent être réalisées pour présenter une. D' autre part, la liaison cystéine maléimide est susceptible d'échanger avec d' autres thiols libres, tels que l' albumine et de glutathion dans le contexte des applications plasma 19. Un tel échange est très dépendante de l'accessibilité au solvant et la charge locale à la surface de la protéine. liens maléimide-thiol peuvent encore être adapté pour des applications de plasma, mais la stabilité à long terme devraient être vérifiées par spectrométrie de masse et électrophorèse sur gel.
Malgré cela, la haute attache à rendement très spécifique de nouvelles molécules telles que des colorants fluorescents, des centres d'oxydo - réduction, des polymères et d' autres protéines à des protéines par l' intermédiaire de la chimie de la cystéine-maléimide est une technique puissante qui permet à une gamme de produits d'assemblage macromoléculaire intéressants pour être unccessed. Avoir de grandes quantités de bioconjugués protéiques chimiquement bien définies est la clé pour les futures études portant sur la protéine de liaison, d'auto-assemblage, la cinétique enzymatique et la localisation des protéines. Comme cela est démontré ci-dessus, la purification à partir du matériau, le choix du milieu réactionnel et l'addition des réactifs supplémentaires tels que des agents réducteurs ou des agents tensioactifs ont tous un impact significatif sur le rendement de bioconjugaison. La purification est plus facilement obtenue par Chromatographie compatible avec les protéines, et la caractérisation est effectuée en utilisant une combinaison de MALDI-TOF MS, l'électrophorèse sur gel, et la spectroscopie UV-Vis.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
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