Summary
Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte für die Biokonjugation eines Cysteins erforderlich Proteins an ein Maleimid enthalten, einschließlich Reagenz Reinigung, Reaktionsbedingungen Biokonjugat Reinigung und Charakterisierung Biokonjugat.
Introduction
Biokonjugation beinhaltet die Verknüpfung kovalent ein Biomolekül mit einem anderen oder mit einem synthetischen Molekül, wie ein Farbstoff, Arzneimittel oder einem Polymer. Protein Biokonjugation Methoden werden nun ausführlich in vielen Chemie, Biologie und Nanotechnologie Forschungsgruppen mit Anwendungen , die von fluoreszierenden Farbstoffmarkierung 1,2, Herstellung von Protein (Antikörper) -prodrugs 3 (Antikörper - Wirkstoff - Konjugate - ADCs) verwendet Synthese von Protein - Dimere 4,5 bis hin zu selbstorganisierenden Protein-Polymer - Hybriden 6,7 verwendet in den Bereich Nanomedizin 8 und Systemchemie 9.
Spezifität der Chemie für die Biokonjugation verwendet, während nicht immer kritisch, ist von größter Bedeutung für die meisten funktionellen Protein Biokonjugate, um nicht mit der aktiven Stelle des Zielproteins zu stören. Die ideale Biokonjugation Reaktion muss mehrere Kriterien erfüllen, darunter: i) Targeting seltene oder einzigartige Stellen auf dem Protein von Interesse,ii) werden selektiv in Richtung auf dieses Ziel, iii) gehen unter nicht-denaturierenden Bedingungen Proteins zu vermeiden Entfalten und iv) werden mit hoher Ausbeute als das Zielprotein bei unteratmosphärischem millimolar Konzentration der Regel nur zur Verfügung steht. Das Maleimid - Cystein Michael Zusätzlich kommt in der Nähe , alle diese Kriterien zu erfüllen, und hat aus diesem Grund lange einen besonderen Status im Bereich der Biokonjugat Chemie 10 beansprucht. Dies ist, weil i) viele Proteine nur einen Cysteinrest an ihrer Oberfläche enthalten, können genetisch es so konstruiert werden, ii) in der richtigen pH der Reaktion auf Cystein hochselektiv ist, iii) es verläuft glatt in wässrigen Puffern und iv) es ist sehr schnell mit der Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung von Maleimiden in Cystein enthaltenden Proteinen berichtet überschreiten 5,000 M -1 sec -1 in einigen Fällen 11. Sofern das Protein von Interesse einen kleinen (≈ 5-10%) Menge an organischem Co-Lösungsmittel 12, fast jede Maleimid-funktionalisierten Farbstoff tolerieren kann, polymer, Oberfläche oder ein anderes Protein können an Proteine gebunden werden. Darüber hinaus sind Maleinimide spezifischer für Cysteine an Proteinen als iodoacetamides, die Reaktion mit anderen Nucleophilen bei erhöhten pH anfälliger sind; und stabiler als Disulfid-basierte Konjugationen , die bei einem sauren pH gehalten werden müssen Disulfidaustausch 13 zu verhindern.
Hier berichten wir über ein generisches Protokoll für die Konjugation von Maleimid-funktionalisierten Molekülen an ein Protein , einen einzelnen Cysteinrest unter Verwendung der Reaktion zwischen einem Ru (II) -Basis Chromophor und dem Redoxprotein Cytochrom c als Beispiel enthalten. Dieses Protokoll ist gleichermaßen auf die meisten anderen Proteine, die eine zugängliche Oberfläche Cysteinrest und das entsprechende Maleimid-funktionalisierten Ziel, sei es ein anderes Protein, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Chromophor oder ein synthetisches Polymer enthält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Das folgende Protokoll wird für die Synthese eines Proteins-Farbstoff - Biokonjugat ausgelegt wie in Figur 1 gezeigt , ist es ein allgemeines Protokoll für die Reaktion einer Maleimid mit freien Oberfläche Cystein enthaltenden Proteinen, mit Anmerkungen eingefügt gegebenenfalls mit Membranprotein zu unterstützen. Biokonjugate, Protein-Polymer-Biokonjugate und synthetische Protein-Dimer (Protein-Protein) Biokonjugate. In diesem speziellen Fall das Protein iso-1 - Cytochrom c hat eine Oberfläche Cysteinrest Verfügung zu reagieren , die auftreten , eine hochspezifische Kennzeichnung ermöglicht. Wenn ein Protein von Interesse mehrere Cysteinreste hat, gilt das gleiche Protokoll, wenn auch mit dem Verlust der Spezifität und Produkthomogenität. Chemie Targeting Oberfläche Lysinresten unter Verwendung von N -hydroxysuccinimidyl Ester oder Isothiocyanate kann ein einfacherer Ansatz, wenn Spezifität nicht erforderlich ist.
1. Reinigung von Cytochrom c
Hinweis: Dieser Schritt für alle Proteine, die nicht anwendbar ist. Jedoch ist es wichtig , dass ein Protein von einem kommerziellen Lieferanten erhalten wissen kann andere unerwünschte Protein - Isoformen enthalten , die durch weitere Reinigung 13 entfernt werden müssen.
- Man löst 2,4 g Natriumdihydrogenphosphat (M w = 120 g mol -1) in 1 l Reinstwasser prepare eine Pufferlösung 20 mM NaH 2 PO 4 enthält. Den pH-Wert mit 1 M NaOH auf pH 7 gestellt.
Anmerkung: Die Phosphatpuffer in diesem Protokoll verwendet werden, sollten frisch auf einer täglichen Basis hergestellt werden, und filtriert durch ein 0,2 um Cellulose-Membranfilter vor der Verwendung. - Man löst 29,22 g Natriumchlorid (M w = 58.44 g mol -1) in 500 ml des 20 mM NaH 2 PO 4 Puffer 20 mM NaH 2 PO 4 und 1 M NaCl - Puffer zu machen. Dies ist der Elutionspuffer für die Reinigung in Schritt 1.6).
- Man löst 12,0 mg lyophilisiertes Cytochrom C (cyt c) in 6 ml pH 7 20 mM Phosphatpuffer.
- Auflösen Getrennt 14,7 mg Dithiothreitol (DTT, M w = 154,25 g / mol) in 95,3 ul Reinstwasser zu einer 1 M Stammlösung vorzubereiten.
Hinweis: Die DTT-Stammlösung sollte frisch hergestellt werden, da dieses Reagenz zu oxidative Deaktivierung in wässriger Lösung anfällig ist. - Pipette 60 ul der 1 M DTT - Lösung in die Proteinlösung den cyt c zu reduzieren. Die Farbe der Lösung von dunkelrot bis hellrot ändern beim Mischen.
- Filtern Sie die reduzierte Proteinlösung durch ein 0,22 & mgr; m geringer Proteinbindung PVDF-Spritzenfilter, bevor sie auf jedem chromatographischen Medium zu injizieren.
- Bringen Sie ein 3,3 ml starke Kationenaustauschsäule zwischen der Injektionsschleife und UV-Vis-Detektor eines Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Instrument.
- Äquilibrierung der Säule mit 3 Säulenvolumina Reinstwasser, gefolgt von 3 Säulenvolumina 20 mM pH 7 Phosphatpuffer, eine Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min verwendet wird.
- Last 1 ml reduziertes Rohöl cyt c in die Injektionsschleife, und starten Sie eine Gradientenmethode 328-450 mM NaCl, über 5 Säulenvolumen. Überwachen Sie die 280 nm und 410 nm Kanäle des UV-Vis-Detektor, und sammeln die größte Spitze.
- Erhöhung der Salzkonzentration auf 1 M für 2 Säulenvolumina iso-2 Cytochrom zu eluierene c, und nachdem die Säule gespült wurde, Re-Äquilibrieren der Säule mit 2 Säulenvolumina von 20 mM Phosphatpuffer , bevor der nächste grobe Aliquot einzuspritzen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,9-1,10, bis das gesamte rohe Protein gereinigt worden ist.
- Pool, die iso-1 enthaltenden Fraktionen und konzentriert sie mit einem 3,5 kDa Molekulargewichtsgrenze (MWCO) Spinfilter und Zentrifugieren bei 3000 x g.
- Legen Sie das konzentrierte Protein in 3,5 kDa MWCO Dialysekassetten und dialysiert gegen Reinstwasser über Nacht, mit 2 Wasserwechsel.
- Bestimmen Sie die Konzentration des reinen, konzentrierten Proteinlösung von 10 & mgr; l nehmen, Verdünnen auf 100 ul mit Reinstwasser und unter ein Absorptionsspektrum. Verwenden Sie ein geringes Volumen, 100 & mgr; l Quartzküvette Protein Absorptionsspektren zu erhalten. Typischerweise ist das unverwässerte Proteinkonzentration in der Größenordnung von 50 bis 100 & mgr; M.
- Verwenden Sie die charakteristische 410 nm - Spitze von Cyt c , um den concentratio quantifizierenn mit dem Beer-Lambert - Gesetz mit einem molaren Absorptionswert von 97,6 cm -1 mM -1:
A = ε × c × ι
wobei A die Extinktion ist, ε der molare Extinktionskoeffizient, c die Konzentration in mM ist und ι die Weglänge der Küvette in cm 13.
- Verwenden Sie die charakteristische 410 nm - Spitze von Cyt c , um den concentratio quantifizierenn mit dem Beer-Lambert - Gesetz mit einem molaren Absorptionswert von 97,6 cm -1 mM -1:
- An dieser Stelle teilen das Protein in 1 ml Aliquots und gefroren halten bei -20 ° C, bis sie benötigt werden. Cyt c kann ohne Verlust der Struktur oder Funktion eingefroren und aufgetaut werden, aber Wiederholungszyklen beginnt das Protein zu denaturieren.
Hinweis: Die Proteine tolerieren Einfrieren in unterschiedlichem Ausmaß. Zum Beispiel sollte grün fluoreszierende Proteine 5,9 nicht eingefroren werden, statt in einem Kühlschrank gelagert.
2. Synthese von Cytochrom c -Biokonjugaten
- Man löst 0,9 mg Ruthenium (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (jato) 2 -Maleimid, 0,975 & mgr; mol, 6 Äquivalente) in 600 & mgr; l Acetonitril.
Hinweis: Bei Verwendung der Maleimid in Wasser löslich ist, um eine Stammlösung in Wasser herzustellen, anstatt Acetonitril. Es ist wichtig für das Maleimid löslich in dem Reaktionspuffer sein. Dimethylsulfoxid, N, N - Dimethylformamid und Acetonitril werden alle Hilfsstoffe gemeinhin verwendet in der Auflösung von niedrigem Molekulargewicht , 12 zu unterstützen, häufig hydrophobe Maleimid Reaktanden. - Bereiten einer Pufferlösung , enthaltend 100 mM Phosphatpuffer und 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, M w = 292,24 g / mol), die , wenn sie 7 bis 20 mM bei pH verdünnt festes Natriumhydroxid hinzu , bis das EDTA gelöst (mehrere Gramm typischerweise ) und stellen Sie den pH-Wert auf 7.
- Man löst 2,87 mg Tris (2-carboxyethyl) phosphin - Hydrochlorid (TCEP 15, M w = 286,65 g / mol) in 1 ml Reinstwasser eine 10 mM Stammlösung herzustellen. Dieser Schritt ist der Important , um sicherzustellen , daß das Cystein auf dem Protein vollständig vor verringert Kupplung 15 an Maleimid.
Anmerkung: Die Stammlösung sollte TCEP frisch für jede Reaktion hergestellt werden, da dieses Reagenz oxidative Deaktivierung in wässriger Lösung anfällig ist. - Kombinieren 11,4 ml Reinstwasser mit 3 ml 100 mM Phosphat / EDTA-Stammlösung in einem 50 ml Kunststoffröhrchen. Wenn weiter verdünnt mit Protein und Maleimid Stammlösungen der Pufferkonzentration 20 mM sein.
Hinweis: Wenn das Protein markiert ist ein Transmembranprotein ist, stellen Sie sicher, dass ein geeignetes Reinigungsmittel zu dem Puffer hinzugefügt wird, das Protein löslich zu machen. Wenn ein Reinigungsmittel nicht verwendet wird, kann das Membranprotein langsam auszufallen, was sich negativ auf die Reaktionsausbeuten auswirken wird. Verwenden Sie das Waschmittel in allen nachfolgenden Reinigungsschritte. - 0.15 & mgr; mol (3 ml einer 50 uM - Lösung, 1 Äquivalent) gereinigt cyt c mit dem Phosphat-EDTA - Puffer.
- 7.5 ul der TCEP Lager solutIon (0,075 & mgr; mol, 0,5 Äquivalente) zu der Proteinlösung und lassen Sie für 5 min Rühren jedes Protein zu reduzieren, die aufgrund Cysteinoxidation dimerisierte haben.
Hinweis: TCEP nicht hinzufügen, wenn das Protein von Interesse nicht ohne weiteres dimerisieren. Überprüfen Sie dies durch ein Protein-Gel unter nicht reduzierenden Bedingungen läuft. - Hinzufügen 600 ul der Acetonitrillösung von Ru (II) (tpy) 2 -maleinimid der reduzierten, gepufferten Lösung von cyt c und lassen das Reaktionsgemisch unter Rühren im Dunkeln bei RT 24 h.
- Konzentriere das Reaktionsgemisch mit 3,5 kDa MWCO Spinfilter, bei 3000 × g zentrifugiert, wiederholen 2-3 mal mit frischem 20 mM Phosphatpuffer, bis das Filtrat klar bleibt. Entfernen Sie so viel nicht umgesetzte Maleimid aus dem Reaktionsgemisch wie möglich, bevor die nächste Stufe der Reinigung.
Anmerkung: An diesem Punkt kann die rohe Biokonjugation Gemisch im Kühlschrank aufbewahrt werden, in der Dunkelheit. Es ist wichtig, um nicht umgesetztes Maleimid centr Farbstoff zu entfernenifuge Dialyse vor der Lagerung als Maleinimid langsam und unspezifisch mit Lysinresten auf der Oberfläche des Proteins reagieren.
3. Reinigung von Cytochrom c -Biokonjugaten
- Man löst 2,4 g Natriumdihydrogenphosphat und 29.22 g Natriumchlorid in 1 l Reinstwasser eine Pufferlösung herzustellen , die 20 mM NaH 2 PO 4 und 0,5 M NaCl. Dies ist der Laufpuffer für die immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) Reinigung.
- Man löst 17 g Imidazol (M w = 68,077 g mol -1) in 500 ml des 20 mM NaH 2 PO 4 und 0,5 M NaCl - Puffer. Dies ist der Elutionspuffer für die IMAC-Reinigung.
- Der pH-Wert beider Puffer pH 7 unter Verwendung von 1 M NaOH oder HCl, und filtern sie durch 0,22 um regenerierte Cellulosemembranen vor der Verwendung in der FPLC.
- Da die IMAC Spalten gekauft werden ohne Metallionen ausgeliefert auf den col geladenUMN, bereiten Sie die Spalte für eine Ni 2+ -basierten Reinigung durch die Säule mit 3 ml Reinstwasser Waschen, 3 ml 100 mM Nickelacetat - Lösung und 6 ml Reinstwasser. Wenn die Spalte nicht sofort durch 3 ml 20% igem Ethanol und speichern die Säule im Kühlschrank waschen verwendet werden Bakterienwachstum zu verhindern.
- Bringen Sie ein Ni 2+ -beladene 1 ml IMAC - Säule auf die FPLC zwischen der Injektionsschleife und UV-Vis - Detektor.
- Äquilibrierung der Säule mit 3 Säulenvolumina 20 mM Phosphat, 0,5 M NaCl-Puffer mit einem Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min verwendet wird.
- Last 100 ul des rohen Reaktionsgemisches (filtriert durch ein 0,22 um - Spritzenfilter) auf der Ni 2+ IMAC - Säule. Die Säule wird mit 3 Säulenvolumina Puffer läuft nicht umgesetztem cyt c zu eluieren, gefolgt von einem Imidazol - Gradienten von 0 bis 125 mM über 3 Säulenvolumina des Rutheniums bisterpyridine-Cytochrom c Biokonjugat zu eluieren (Ru (II) -cyt c) .
- Waschen Sie die cPALTE mit 250 mM Imidazol-Puffer für 5 Säulenvolumina, anschließend erneut äquilibriert Die Säule wird mit 20 mM Phosphat, 0,5 M NaCl und wiederhole Schritt 3.7, bis das gesamte rohe Biokonjugat gereinigt wurde.
- Pool die Biokonjugat Fraktionen und konzentrieren sie mit einem 3,5 kDa MWCO Spinfilter, Zentrifugieren bei 3000 x g.
- Legen Sie das konzentrierte Biokonjugat in 3,5 kDa MWCO Dialysekassetten und dialysiert gegen Reinstwasser über Nacht, mit 2 Wasserwechsel.
- Bestimmung der Konzentration des reinen, konzentrierten Biokonjugat Lösung durch UV-Vis, unter Verwendung der gleichen molaren Absorptionswert als iso-1 - Cytochrom c (97,6 mM -1 cm -1) bei 410 nm. Typischerweise ist die Biokonjugat Konzentration in der Größenordnung von 50 bis 100 uM.
- Teilen Sie die Biokonjugat in 25 ul Aliquots und halten gefroren bei -20 ° C, bis sie benötigt werden.
4. Charakterisierung von Cytochrom c -Biokonjugaten
- AbhaltenDigen Biokonjugat Masse durch MALDI-TOF-MS
- Man löst 10 mg Kaffeesäure in 1 ml eines Acetonitril / Wasser / Trifluoressigsäure-Lösung (80: 20: 0,1, v / v / v).
- Verdünne 5 & mgr; l konzentrierte Proteinlösung mit 5 ul Kaffeinsäure Lösung.
- Spot 0,5 ul Kaffeinsäure Lösung auf dem MALDI Zielplatte und die Lösung zu trocknen.
- Spot 0,5 & mgr; l der Probe / Matrix-Lösung im oberen Teil der Kaffeesäure Stelle, kann der Stelle zu trocknen. Beschmutzen weitere 0,5 & mgr; l Probenmatrix auf dieses auf "Sandwich" der Probe zwischen den Schichten der Matrix und trocknen lassen.
- Erwerben Massenspektren im linearen Modus geeignet Geräteeinstellungen für Proteine 16 verwenden.
- Untersuchung der Biokonjugate durch Gelelektrophorese
- Herstellung von 10 ul jeder Proteinprobe durch Verdünnen von Proteinproben mit vorgemischten Lithiumdodecylsulfat (LDS, pH 8,4) Puffer (4x) t zu laufenoa Endkonzentration von etwa 20 & mgr; g pro Vertiefung. Für Brunnen, die reduzierenden Bedingungen benötigen, fügen 1 ul 500 mM Dithiothreitol (DTT) Reduktionsmittel (10x).
- Wärme Proben bei 70 ° C für 10 min.
- 50 ml vorgemischtes 1 M MES, 1 M Tris-Base, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7,7) Laufpuffergemisch (20x) von einer handelsüblichen Quelle auf 950 ml Reinstwasser des Gel-Laufpuffer herzustellen.
- Entfernen Sie die Kunststoff-Kamm aus dem Gel und legen Sie das Gel in dem Gel Lauftank. Füllen Sie den Tank mit Gel-Laufpuffer, so dass die Vertiefungen mit Puffer bedeckt sind.
- Laden Sie die Proben vorsichtig auf eine Fertig 12% Bis-Tris, 1 mm, 10-Well-Gel lange Pipettenspitzen beim Laden zu unterstützen. Laden Sie das färbten 10 Protein-Molekulargewichtsmarker (3-188 kDa) in eine mittlere Vertiefung der Gel-Analyse zu unterstützen.
- Führen Sie das Gel bei 200 V konstanter Spannung für 35 min.
- Stain das Gel mit einem kommerziellen Coomassieblau-Lösung für 2 Stunden und waschen mit ultrapure Wasser für 48 Stunden.
- Bestimmung von Biokonjugat Reinheit durch UV-Vis - Spektroskopie
- Bereiten 120 & mgr; l von 5 & mgr; M Lösungen von Ru (II) (tpy) 2 -maleimid, iso-1 cyt c und Ru (II) -cyt c.
- Messen der Basislinienspektrum der Quarzküvette nur Reinstwasser, von 250 nm bis 650 nm enthält.
- Messen Sie das Spektrum der einzelnen Komponenten gewährleistet die Küvette gespült und zwischen jeder Messung getrocknet.
- Plotten die Absorption jeder Komponente als eine Funktion der Wellenlänge, und vergleichen die lineare Summe der Ausgangsmaterialien mit dem Endprodukt zu bestimmen , ob eine 1: 1 - Verhältnis von Ru (II) (tpy) -maleinimid 2 bis cyt c reagiert hat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Synthese von Biokonjugaten wird durch drei primäre Methoden bestätigt: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), Polyacrylamid - Gelelektrophorese und UV-VIS (UV-Vis) Spektroskopie, wie in den 2, 3 und 4. Eine Massenzunahme der Masse des beigefügten kleine Molekül und das Fehlen eines nicht - umgesetztem Protein entspricht zeigt die erfolgreiche kovalente Verknüpfung von Ru (II) (tpy) -maleinimid 2 bis cyt c und anschließender Reinigung des Biokonjugats. Das UV-Vis-Spektrum des Biokonjugat kann die Ausbeute der Absorption bei 410 nm berechnet werden, und durch das Spektrum zu einem vorhergesagten 1 Vergleich: 1-Additionsspektrum der Ausgangsstoffe der Zusammensetzung des Biokonjugats abgeleitet werden kann. In dem obigen Beispiel variiert die Ausbeute etwas von Charge zu Charge jedoch im allgemeinen zwischen 15-27% nach FPLC Purification 15.
Darüber hinaus bestätigt das Auftreten eines neuen Peaks in dem Chromatogramm während der Reinigung die Synthese einer neuen Spezies. Dies ist in Abbildung 5 veranschaulicht, bei der die Analyse der verschiedenen UV-Vis - Spuren zeigen können , ob eine Spezies enthält den Ru (II) (jato) 2 -Maleimid Komponente.
Abbildung 2. MALDI-TOF - Massenspektren von Proteinen. Massenspektren von reinem iso-1 - Cytochrom c (schwarz) und Ru (II) -cyt c (rot). Peaks können beobachtet werden , dass auf die berechneten Massen von iso-cyt c 1 (12.706 Da) und Ru (II) -cyt c (13.559 Da) mit einer Kaffeesäure - Adduktes sichtbar +179 Da entsprechen. Dieses Addukt wird in höheren Mengen in dem nicht umgesetzten cyt c s gesehenpectra aufgrund einer Reaktion zwischen dem α, β-ungesättigten Carbonyl-von Kaffeesäure und dem freien Thiol des Proteins unter energie MALDI Bedingungen. Matrix-Addukte werden in MALDI-MS allgemein gesehen und kann sowohl kovalente als auch nicht-kovalente Natur sein. Spectra sind Basis korrigiert, Rauschen gefiltert und normalisiert zum Vergleich. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. SDS-PAGE von Proteinen. 12% Bis-Tris - Gel der reduzierten und nicht reduzierten cyt c und Ru (II) -cyt c. Spur 3 enthält eine vorgefärbten Proteinstandard, mit Masse Polypeptid nach rechts von jedem Band kommentierten (kDa). Bitte klicken Sie hier , um eine größere versio zu sehenn dieser Figur.
Abbildung 4. UV-Vis - Spektren von Proteins: Das Absorptionsspektrum des Ru (II) -cyt c (grün) entspricht weitgehend der linearen Addition (gestrichelte blau) reines, nicht umgesetztes cyt c (rot) und nicht umgesetztes Ru (II) ( jato) 2 -Maleimid (schwarz). Dies zeigt , dass das Biokonjugat eines 1 besteht. 1 Befestigung des Maleimid an das Protein Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Chromatogramm von Ni-IMAC Reinigung von bioconjugates: IMAC Spur von Ru (II) -cyt c Reinigung. UV-Vis-Spuren: 410 nm auf die Soret-Bande von cy entsprichtt c, 280 nm sowohl auf cyt c und Ru (II) (jato) 2 -Maleimid entspricht, und 475 nm zu der Ladungstransferband des Ruthenium - Metall-Ligand entspricht (II) -Komplex. Bitte klicken Sie hier anzuschauen größere Version der Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reinigung der Ausgangsmaterialien vor einer Biokonjugation ist von größter Bedeutung. Proteine, erhalten aus kommerziellen rekombinanten Quellen enthalten oft andere Isoformen des Proteins von Interesse, die unterschiedliche Oberflächenchemie und Reaktivität aufweisen. Beispielsweise in dem beschriebenen Biokonjugation, enthält das handelsübliche cyt c ein Gemisch aus beiden iso-1 und iso-cyt c 2 12,14,17. Iso-2 und iso-1 Formen von Cytochrom c sind weitgehend homolog mit der Hauptunterschied die Anwesenheit eines freien Cysteinrest in der Nähe des C-Terminus des iso-1 - Cytochrom c ist. Im Beispiel wird die Reinigung mit wässrigem erreicht starken Kationenaustausch-FPLC, jedoch können auch andere Formen von FPLC wie Anionenaustausch, Affinitäts-, hydrophobe oder Grßenausschlußchromatographie kann mehr anwendbar. Das Protein wird auch in diesem Schritt reduziert , um sicherzustellen , daß der Cysteinrest an dem Protein von Interesse (hier Cytochrom c) fu istlly vor reduziert mit dem Maleimid-linked Ziel Biokonjugation. Darüber hinaus ist es sinnvoll, wenn das Maleimid-beigefügten kleines Molekül mit einem Cystein-Protein ist in Speicherunterzogen wurde keine Reaktion enthält, verwendet werden, um festzustellen, rein und daß das Maleimid als Maleimide Licht und Temperatur empfindlich sind. Dies kann schnell und einfach überprüft werden durch 1 H - NMR, da die vinylischen Protonen eines intakten Maleimid als Singulett bei 6-6,5 ppm, während die Protonen eines offenen Maleimid verschiebt hohem Feld erscheint; und auch die Massenspektrometrie, mit einem offenen Maleimidring entsprechend einer 18 Da Massenzunahme.
Buffer Wahl, pH - Wert und die Einbeziehung von Hilfsstoffen wie Detergenzien, organische Lösungsmittel und Reduktionsmittel wird eine tiefe Wirkung auf Biokonjugation Erträge 5,15 haben. Im Falle einer Michael-Addition eines Maleimid und Thiol, muss der pH oberhalb von 6 noch unter 8 für eine schnelle, spezifische Reaktion zu treten. Unterhalb von pH 6, ist Spezifität so hoch wiedas Maleimid mit beliebigen Aminen reagieren können, zu, nicht aber das Thiol protoniert und somit ein schlechtes Nukleophil für die Michael-Addition zu einer langsamen Reaktion führen. Oberhalb pH 8, kann mit den verfügbaren Maleimide werden Lysinresten Oberfläche deprotonierten und reagieren auf eine unspezifische kovalente Bindung des Maleimid-Komponente zu dem Protein führt. Phosphatpuffer wird in diesem Biokonjugation verwendet, da es ein starker Puffer in diesem pH-Bereich ist, und tritt nicht in Wechselwirkung mit einem der Reagenzien. Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris) -Puffer, beispielsweise würde in diesem Puffer eine schlechte Wahl als Amingruppe sein könnte möglicherweise mit dem Maleinimid reagieren, was zu schlechten Ausbeuten führen würde. Die Löslichkeit von allen Reagenzien ist auch der Schlüssel zu hohen Ausbeuten. Die Zugabe von geringen Mengen (<10% v / v) eines organischen Lösungsmittels kann in der Auflösung von nicht-polaren Komponenten unterstützen, während richtigen pH - Wert und Salzkonzentration sind für Proteine in Lösung zu halten und 12 gefaltet. Für große Membran proteins mit signifikanten hydrophoben Oberflächenresten, wird ein Tensid erforderlich sein , das Protein zu verhindern , 18 ausgefällt wird .
Wenn das Protein in der Biokonjugation Oxidations- und Dimerisierung neigt, hat die Zugabe eines Reduktionsmittels wie TCEP wurde Biokonjugation Ausbeuten zu verbessern 15 gezeigt. Die in - situ - Reduktion des Proteins in seine monomeren, frei thiol Form ermöglicht ein größerer Anteil der aktiven Thiol Seiten durch den Maleimid zugegriffen wird. Allerdings Reihenfolge der Zugabe und Stöchiometrie ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Steigerung der Ausbeute als TCEP wird auch mit Maleimid reagieren. Durch Zugabe des Maleimid nach TCEP wird das TCEP durch Reduzierung des Protein zuerst konsumiert werden. Ein halbes Äquivalent TCEP zu Protein wird aus dem gleichen Grund verwendet, so dass überschüssige TCEP nicht verfügbar ist ungünstig mit dem freien Maleimid zu reagieren. Structural Disulfidbrücken im Inneren des Proteins wahrscheinlich nicht durch die Zugabe von TCEP beeinflußt zu werdenoder andere Reduktionsmittel wie DTT, vorausgesetzt, dass das Protein nicht in denaturierenden Bedingungen wie hoher Temperatur oder hoher Konzentration von Harnstoff gehalten wird. Beispielsweise auf cyt die Zugabe eines großen Überschusses an DTT c vor der FPLC - Reinigung nach Reinigung gewonnen keinen signifikanten Effekt auf die Menge des Proteins haben. Wenn Reduzierung der strukturellen Cysteinbrücken von TCEP vermutet wird, kann dies durch Ausführen eines Proteingels unter nativen, nicht-denaturierenden Bedingungen bestätigt werden.
Der Ru (II) bisterpyridine-markierten Cytochrom c in diesem Verfahren synthetisiert wird über Ni 2+ Immobilisierte Metall - Affinitätschromatographie 14 gereinigt. Andere Reinigungsmethoden existieren, wie Grßenausschlußchromatographie, Anionen- / Kationenaustauscherchromatographie und spezifische Affinitätschromatographie wie einem Antikörper stationären Phase. Im allgemeinen bleibt das Verfahren das gleiche wie oben beschrieben, mit der Konzentration und Dialyse Schritte following chromatographische Reinigung das Biokonjugat Produkt zu einem geeigneten Puffer zur Speicherung zurückzukehren.
Die primäre Methode der Bestimmung , ob eine Biokonjugation erfolgreich ist über MALDI-TOF MS. Es ist die genaueste Art und Weise der kleine Unterschied in der Masse zwischen nativem Protein und Protein kovalent mit einem kleinen Molekül, einem Unterschied oft weniger als 1.000 Da markiert zu ermitteln. Der schwierigste Teil eines MALDI-TOF MS-Experiment des Laufens ist Matrix Wahl und Spek Technik; jedoch Kaffeesäure ist eine zuverlässige, Allzweck-Matrix für die Analyse der Proteine und Biokonjugate in dieser Arbeit erwiesen. Als mögliche Alternative ist Sinapinsäure eine andere häufig verwendete MALDI-Matrix für die Analyse von Proteinen. Die Analyse der MALDI-TOF - MS - Daten ist relativ einfach. Abbildung 2 zeigt die typischen MALDI-TOF - MS - Spektrum von sowohl reine iso-1 cyt c (M w = 12.706 Da) und reinem Ru (II) -cyt c (Mw = 13.559 Da), welche beide dicht mit dem berechneten Molekularmasse entsprechen. Die Reinheit kann auch beobachtet werden , und stellt fest , das Fehlen eines iso-2 Cytochrom c peak (M w = 12.532 Da) in dem nicht umgesetzten Spektrum und das Fehlen eines iso-1 - Cytochrom c Peak im Biokonjugat Spektrums. Das Biokonjugat Masse kann auch unter Verwendung von Gelelektrophorese abgeschätzt werden. In 3 ist eine 12% Bis-Tris - Gel Protein liefert zwei Beweisstücke zur Biokonjugation. Zunächst zeigt das Fehlen eines Dimers Band unter nicht reduzierenden Bedingungen für die Ru (II) -cyt c , dass es nicht mehr ist ein freies Cystein und zweitens die leichte Verschiebung des Biokonjugats Band übersetzt aufwärts zu einer Erhöhung des Molekulargewichts. Protein - Gele sind von unschätzbarem Wert und der Nachweis der erfolgreichen Biokonjugation endgültig liefern kann nicht nur für kleine Molekül - Anhänge, sondern auch für die Synthese von Protein Dimere 5 oder Protein-Polymer - Biokonjugate 9.
für Proteineenthaltende Chromophore wie grün fluoreszierendes Protein oder Häm-haltigen Cytochrome, UV-Vis-Spektroskopie wird verwendet, um die Zusammensetzung und die Ausbeute des Biokonjugat zu bestimmen. Die 1: 1 linear Zugabe der Ausgangsmaterialien Spektren erlaubt den Aufbau eines hypothetischen UV-Vis - Spektrum des Biokonjugat, wie in Figur 4 gezeigt , durch die tatsächliche Biokonjugat Spektrum dieser 1 zu vergleichen. 1 zusätzlich Spektrum kann die Zusammensetzung gefolgert werden . Wenn beispielsweise zwei oder mehr Ru (II) (tpy) 2 -maleimides unspezifisch an das Protein gebunden war, das 480 nm - Band des Biokonjugats wäre höher als der vorhergesagte Spektrum. Darüber hinaus kann die Konzentration des Biokonjugats unter Verwendung der 410 nm molaren Absorptionswert von 97,6 cm -1 mM -1 approximiert werden. Dies wird angenommen , das gleiche für das Biokonjugat zu sein , weil der Ru (II) (tpy) 2 -maleinimid minimal Absorption in diesem Bereich aufweist.
Es sollte beachtet werden, That Biokonjugation über Cystein-maleimid Chemie hat einige Einschränkungen. Erstens muss das Protein von Interesse eine einzige zugängliche Cysteinrest, oder Protein-Engineering eine einzuführen ausgeführt werden müssen. Zweitens ist die Cystein-maleimid Bindung empfänglich mit anderen freien Thiolen, wie beispielsweise Albumin und Glutathion im Rahmen der Plasmaanwendungen 19 auszutauschen. Ein solcher Austausch ist stark abhängig von der Lösungsmittelzugänglichkeit und lokale Ladung auf der Oberfläche des Proteins. Maleimid-thiol Bindungen können noch geeignet sein für Plasmaanwendungen, aber die Langzeitstabilität sollte mittels Massenspektrometrie und Gelelektrophorese überprüft werden.
Trotzdem ist die hochspezifische, ertragreiche Anlagerung von neuen Molekülen wie beispielsweise fluoreszierende Farbstoffe, Redox - Zentren, Polymeren und anderen Proteinen an Proteine über Cystein-maleimid Chemie ist eine leistungsfähige Technik , die eine Reihe von interessanten hochmolekularen Konstrukte ermöglicht eine seinccessed. große Mengen an chemisch definierte Protein bioconjugates ist der Schlüssel für künftige Studien mit Proteinbindung, Selbstorganisation, Enzymkinetik und Proteinlokalisierung. Wie oben gezeigt, Material Reinigung beginnen, Auswahl des Reaktionsmediums und die Zugabe von Zusatzreagenzien, wie Netzmittel oder oberflächenaktive alle haben erhebliche Auswirkungen auf die Biokonjugation Ausbeuten reduzieren. Die Reinigung erfolgt am einfachsten durch Protein-kompatible Chromatographie erreicht und Charakterisierung erfolgt mit einer Kombination von MALDI-TOF MS, Gelelektrophorese, und UV-Vis-Spektroskopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Elsevier: Oxford. (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
