Summary
Denne protokollen detaljer de viktigste trinnene som kreves for bioconjugation av en cystein som inneholder protein til en maleimide, inkludert reagent rensing, reaksjonsbetingelser, biokonjugatet rensing og biokonjugatet karakterisering.
Introduction
Bioconjugation involverer kovalent å knytte en biomolekyl med hverandre eller med en syntetisk molekyl, så som et fargestoff, medikament eller en polymer. Protein bioconjugation metoder er nå mye brukt i mange kjemi, biologi og nanoteknologi forskningsgrupper med applikasjoner som spenner fra fluorescerende fargestoff merking 1,2, noe som gjør av protein (antistoff) -prodrugs 3 (antistoff medikamentkonjugater - ADCs) syntese av protein dimer 4,5 gjennom å selv-montering protein-polymer hybrider 6,7 som brukes i nanomedisin 8 og systemer kjemi 9.
Spesifisitet av kjemien benyttet for bioconjugation, samtidig som det ikke alltid er kritisk, er av største betydning for de funksjonelle protein bioconjugates, slik at det ikke forstyrrer det aktive sete av målproteinet. Den ideelle bioconjugation reaksjon må oppfylle flere kriterier, blant annet: i) rettet mot sjeldne eller unike steder på protein av interesse,ii) være selektiv mot dette målet, iii) går under ikke-denaturerende betingelser for å unngå protein utfoldelse og iv) være høy avkastning som mål protein er vanligvis bare tilgjengelig på sub-millimolar konsentrasjon. Den maleimid - cystein Michael-addisjon kommer nær til å oppfylle alle disse kriteriene, og har av den grunn lenge ifølge en spesiell status på området biokonjugatet kjemi 10. Dette er fordi i) mange proteiner som inneholder bare en cysteinresidie på sin overflate kan fremstilles ved gensløyd der, ii) ved den riktige pH-verdi i reaksjons er meget selektive overfor cystein, iii) den fortsetter jevnt i vandige buffere, og iv) det er meget rask med den annen ordens hastighetskonstant av maleimider til cystein-inneholdende proteiner som er rapportert å overstige 5000 M -1 sek -1 i noen tilfeller 11. Forutsatt at proteinet av interesse kan tolerere en liten (≈ 5-10%) mengde av organisk ko-oppløsningsmiddel 12, kan nesten alle maleimid-funksjonalisert fargestoff, po-polymer, overflate eller et annet protein kan knyttes til proteiner. I tillegg er maleimider er mer spesifikk for cysteinene på proteiner enn iodoacetamides, som er mer tilbøyelig til å reagere med andre nukleofiler ved forhøyet pH-verdi; og mer stabil enn disulfid-baserte bøyning som må holdes ved sur pH for å hindre disulfid utveksling 13.
Her kan vi rapportere en generisk protokoll for konjugering av maleimid-funksjonalisert molekyler til et protein som inneholder en enkelt cysteinresidie ved hjelp av reaksjonen mellom en Ru (II) -basert kromofor og redoks-proteinet cytokrom c som et eksempel. Denne protokollen er like anvendelig for de fleste andre proteiner inneholdende et tilgjengelig overflate cysteinresidie og det tilsvarende maleimid-funksjonalisert mål, det være seg et annet protein, et fluorescerende fargestoff, en kromofor eller en syntetisk polymer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Den følgende protokoll er konstruert for syntese av et protein-dye biokonjugatet som vist i figur 1. Det er en generell protokoll for omsetning av et maleimid med fri overflate cystein inneholdende proteiner, med noter innsatt der det er aktuelt å hjelpe til med membranprotein. bioconjugates, protein-polymer bioconjugates og syntetisk protein dimer (protein-protein) bioconjugates. I dette spesielle tilfelle, har proteinet iso-1-cytokrom c en overflate cysteinresiduum tilgjengelig for reaksjon, som tillater en svært spesifikk merking for å forekomme. Hvis et protein av interesse har flere cysteinrester, gjelder den samme protokoll, men med tap av spesifisitet og produkt homogenitet. Kjemi rettet mot overflaten lysinrester, ved anvendelse av N -hydroxysuccinimidyl estere eller isotiocyanater, kan være en enklere tilnærming hvis spesifisitet er ikke nødvendig.
1. Rensing av cytokrom c
Merk: Dette trinnet er ikke aktuelt for alle proteiner. Imidlertid er det viktig å vite at en oppnådd fra en kommersiell leverandør protein kan inneholde andre, uønskede protein isoformer som kan trenge å bli fjernet ved ytterligere rensing 13.
- Oppløs 2,4 g natrium-dihydrogenfosfat (Mw = 120 g mol -1) i 1 liter ultrarent vann til prepare en bufferoppløsning inneholdende 20 mM NaH 2PO 4. Juster pH med 1M NaOH til pH 7.
Merk: fosfatbuffere anvendt i denne protokollen bør fremstilles friskt hver dag, og filtrert gjennom et 0,2 pm cellulosemembranfilter før bruk. - Oppløs 29,22 g natrium-klorid (Mw = 58,44 g mol-1) i 500 ml av 20 mM NaH 2PO 4-buffer for å lage en 20 mM NaH 2PO 4 og 1 M NaCl-buffer. Dette er elueringsbufferen for rensing i trinn 1.6).
- Oppløs 12,0 mg lyofilisert cytokrom c (cyt c) i 6 ml pH 7 20 mM fosfatbuffer.
- Separat oppløses 14,7 mg ditiotreitol (DTT, Mw = 154,25 g / mol) i 95.3 pl av ultrarent vann for å fremstille en 1 M stamløsning.
Merk: DTT stamløsningen bør fremstilles friskt, da dette reagens er tilbøyelig til oksydativ deaktivering i vandig oppløsning. - Pipette 60 ul av 1 M DTT oppløsning inn i proteinoppløsningen for å redusere cyt c. Fargen på løsningen vil endre seg fra mørkerød til lyserød etter blanding.
- Filtrer redusert protein løsning gjennom et 0,22 mikrometer lav proteinbinding PVDF sprøytefilter før injisering på noen kromatografiske medier.
- Fest en 3,3 ml sterk kationbytterkolonne mellom injeksjons loop og UV-Vis-detektor for en rask protein væskekromatografi (FPLC) instrument.
- Ekvilibrere kolonnen med 3 kolonnevolumer av ultrarent vann, fulgt av 3 kolonnevolumer av 20 mM pH 7 fosfatbuffer, ved anvendelse av en strømningshastighet på 1 ml / min.
- Laste 1 ml av redusert råolje cyt c inn i injeksjonssløyfe, og starte en gradient metode 328-450 mM NaCl, over 5 kolonnevolumer. Overvåke 280 nm og 410 nm kanaler av de UV-Vis detektor, og samle den største topp.
- Øke saltkonsentrasjonen til en M for to kolonnevolumer for å eluere iso-2 cytochrome c, og etter at kolonnen er blitt spylt, re-ekvilibreres kolonnen med 2 kolonnevolumer av 20 mM fosfatbuffer før injisering av den neste urene alikvoten.
- Gjenta trinn 1.9 til 1.10 inntil all olje protein er blitt renset.
- Pool iso-en inneholder fraksjoner og konsentrere dem ved hjelp av en 3,5 kDa molekylvekt Cutoff (MWCO) spin-filter og sentrifugering ved 3000 x g.
- Laste konsentrert protein i 3,5 kDa MWCO dialyse kassetter og dialyser mot ultrarent vann over natten, med 2 endringer av vann.
- Bestemme konsentrasjonen av det rene, konsentrerte proteinoppløsning ved å ta 10 ul, fortynne den til 100 pl med ultrarent vann, og å ta en absorbans spektrum. Bruke et lavt volum, til 100 ul kvartskuvette oppnå protein absorbans spektra. Typisk er ufortynnet proteinkonsentrasjon i størrelsesorden 50 - 100 uM.
- Bruk den karakteristiske 410 nm toppen av cyt c å kvantifisere-konsentrasjonn bruke Beer-Lamberts lov med en molar absorptivity verdi på 97,6 cm -1 mM -1:
A = ε × c × ι
hvor A er absorbans, er ε den molare absorpsjonsevne, c er konsentrasjonen i mM, og ι er banelengden av kyvetten i cm 13.
- Bruk den karakteristiske 410 nm toppen av cyt c å kvantifisere-konsentrasjonn bruke Beer-Lamberts lov med en molar absorptivity verdi på 97,6 cm -1 mM -1:
- På dette punktet, dele protein i 1 ml aliquoter og holde frosset ved -20 ° C inntil de skal brukes. Cyt c kan fryses og tines uten tap av struktur eller funksjon, men gjentatte sykluser vil begynne å denaturere proteinet.
Merk: Proteiner tåler frysing i forskjellig grad. For eksempel, grønt fluorescerende protein 5,9 bør ikke fryses, i stedet lagres i et kjøleskap.
2. Syntese av cytokrom c Bioconjugates
- Løs opp 0,9 mg av ruthenium (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (TPY) 2 -maleimide, 0,975 mikromol, 6 ekvivalenter) i 600 mL acetonitril.
Merk: Hvis maleimid som anvendes er løselig i vann, fremstille en stamoppløsning i vann i stedet for acetonitril. Det er viktig for den maleimidet å være løselig i reaksjonsbufferen. Dimetylsulfoksyd, er N, N-dimetylformamid og acetonitril alle vanlige hjelpestoffer for å hjelpe til i oppløsningen av lav molekylvekt 12, ofte hydrofobe maleimid reaktanter. - Fremstille en bufferoppløsning inneholdende 100 mM fosfatbuffer og 100 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, Mw = 292,24 g / mol), som når de fortynnes til 20 mM ved pH er 7. Tilsett fast natriumhydroksyd inntil EDTA oppløses (flere gram typisk ) og justere pH til 7.
- Oppløs 2,87 mg av tris (2-karboksyetyl) fosfin-hydroklorid (TCEP 15, Mw = 286,65 g / mol) i 1 ml ultrarent vann for å fremstille en 10 mM stamløsning. Dette trinnet er importmaur for å sikre at cystein på proteinet er fullstendig redusert før maleimid kopling 15.
Merk: TCEP stamløsningen bør fremstilles friskt for hver reaksjon, da dette reagens er tilbøyelig til oksydativ deaktivering i vandig oppløsning. - Kombiner 11,4 ml ultrarent vann med 3 ml 100 mM fosfat / EDTA-stamoppløsning i et 50 ml plastrør. Når fortynnes videre med protein og maleimide stamløsninger bufferkonsentrasjonen vil være 20 mm.
Merk: Hvis proteinet ble merket som er et transmembranprotein, sikre at en passende detergent blir tilsatt til bufferen for å solubilisere proteinet. Hvis et vaskemiddel ikke brukes membranprotein kan sakte bunnfall, som vil negativt påvirke reaksjons avkastning. Bruk vaskemiddel i alle etterfølgende rensetrinn. - Legg 0,15 umol (3 ml av en 50 uM løsning, 1 ekvivalent) av renset cyt c til fosfat-EDTA-buffer.
- Legg 7,5 mL av TCEP lager solution (0,075 ^ mol, 0,5 ekvivalenter) til proteinoppløsningen og lar omrøring i 5 minutter for å redusere en hvilken som helst protein som kan ha dimerisert på grunn av cystein oksydasjon.
Merk: Ikke legg TCEP hvis proteinet av interesse ikke dimerisere lett. Kontroller dette ved å kjøre et protein-gel under ikke-reduserende betingelser. - Legg 600 mL av acetonitril oppløsning av Ru (II) (TPY) 2 -maleimide til den reduserte, bufret oppløsning av cyt c, og lar reaksjonsblandingen under omrøring i mørket ved romtemperatur i 24 timer.
- Konsentrer reaksjonsblandingen ved å anvende 3,5 kDa MWCO ring filtre, sentrifugering ved 3000 x g, gjentatt 2-3 ganger med friske 20 mM fosfatbuffer inntil filtratet er klart. Fjern så mye ureagert maleimide fra reaksjonsblandingen som mulig før den neste fasen av rensing.
Bemerk: Ved dette punkt kan den urene bioconjugation blandingen oppbevares i kjøleskap, i mørket. Det er viktig å fjerne ureagert maleimid fargestoff ved centrifuge dialyse før Lagring som maleimid kan langsomt og ikke-spesifikt reagerer med lysinrester på overflaten av proteinet.
3. Rensing av cytokrom c Bioconjugates
- Oppløs 2,4 g natrium-dihydrogenfosfat og 29,22 g natriumklorid i en liter ultrarent vann for å fremstille en bufferoppløsning inneholdende 20 mM NaH 2PO 4 og 0,5 M NaCl. Dette er den rennende buffer for det immobiliserte metall-affinitetskromatografi (IMAC) rensing.
- Oppløs 17 g imidazol (Mw = 68,077 g mol-1) i 500 ml av 20 mM NaH 2PO 4 og 0,5 M NaCl-buffer. Dette er elueringsbufferen for IMAC-rensing.
- Justere pH i begge buffere til pH 7 ved anvendelse av 1 M NaOH eller HCl, og filtrere dem gjennom 0,22 um regenererte cellulosemembraner før anvendelse ved FPLC.
- Som IMAC kolonner kjøpt leveres uten noen metallioner lastet på colUMN, forberede kolonnen for en Ni2 + -basert rensning ved vasking av kolonnen med 3 ml ultrarent vann, 3 ml 100 mM nikkelacetat løsning, og 6 ml av ultrarent vann. Hvis kolonnen ikke skal brukes umiddelbart vaske gjennom 3 ml 20% etanol og lagre kolonnen i kjøleskap for å hindre bakterievekst.
- Fest en Ni 2+ -loaded 1 ml IMAC kolonnen til FPLC mellom injeksjons loop og UV-Vis-detektor.
- Ekvilibrere kolonnen med 3 kolonnevolumer av 20 mM fosfat, 0,5 M NaCl-buffer ved bruk av en strømningshastighet på 0,5 ml / min.
- Belastning 100 ul av rå reaksjonsblanding (filtrert gjennom et 0,22 um sprøytefilter) på Ni2 + IMAC-kolonne. Vask kolonnen med 3 kolonnevolumer av buffer for å eluere ikke-reagerte cyt c, etterfulgt av et imidazol gradient 0-125 mM over 3 kolonnevolumer for å eluere ruthenium bisterpyridine-cytokrom c biokonjugatet (Ru (II) -cyt c) .
- Vask column med 250 mM imidazol-buffer for 5 kolonnevolumer, og deretter re-ekvilibreres kolonnen med 20 mM fosfat, 0,5 M NaCl og gjenta trinn 3.7 inntil alt det urene biokonjugatet er blitt renset.
- Pool biokonjugatet fraksjoner og konsentrere dem ved hjelp av en 3,5 kDa MWCO spin filter, sentrifugering ved 3000 x g.
- Laste konsentrert biokonjugatet inn 3,5 kDa MWCO dialyse kassetter og dialyser mot ultrarent vann over natten, med 2 endringer av vann.
- Bestemme konsentrasjonen av det rene, konsentrerte biokonjugatet oppløsning av UV-Vis, ved hjelp av den samme molare absorptiviteten verdi som iso-1-cytokrom c (97,6 mM -1 cm -1) ved 410 nm. Vanligvis er biokonjugatet konsentrasjon i størrelsesorden 50 - 100 mikrometer.
- Fordel biokonjugatet inn i 25 mL alikvoter og holde frosset ved -20 ° C inntil de skal brukes.
4. Karakterisering av cytokrom c Bioconjugates
- Avskrekkemelse av biokonjugatet masse ved MALDI-TOF MS
- Oppløs 10 mg av koffeinsyre i 1 ml av en acetonitril / vann / trifluoreddiksyre-løsning (80: 20: 0,1, v / v / v).
- Fortynn 5 ul av konsentrerte proteinløsning med 5 ul av koffeinsyreløsning.
- Flekk 0,5 ul av koffeinsyre løsning på MALDI skyteskiven og la oppløsningen tørke.
- Flekk 0,5 pl prøve / matriseoppløsningen på toppen av denne koffeinsyre sted, lar stedet for å tørke. Spot ytterligere 0,5 ul prøve matrise på toppen av denne til "sandwich" av prøven mellom lag av matrise, og la den tørke.
- Acquire massespektra i lineær modus ved hjelp av egnede instrumentinnstillinger for proteiner 16.
- Undersøkelse av bioconjugates ved gel elektroforese
- Forbered 10 ul av hver proteinprøve til å være drevet ved å fortynne proteinprøver med forblandet litium-dodecyl-sulfat (LDS, pH 8,4) buffer (4x) to en endelig konsentrasjon på omtrent 20 ug per brønn. For brønner som krever reduserende betingelser, tilsett 1 mL 500 mM ditiotreitol (DTT) reduksjonsmiddel (10x).
- Varme prøvene ved 70 ° C i 10 min.
- Tilsett 50 ml av forhåndsblandet 1 M MES, 1 M Tris-base, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7,7) som løper bufferblanding (20x) fra en kommersiell kilde til 950 ml ultrarent vann for å fremstille gelen rennende buffer.
- Fjern plast kammen fra gelen og plassere gelen i gelen løpe tanken. Fylle opp tanken med gelen rennende buffer slik at brønnene er dekket med buffer.
- Laste prøvene nøye på en precast 12% Bis-Tris, 1 mm, 10-brønn gel ved hjelp av lange pipetter for å bistå i lasting. Installering av prestained 10 proteinmolekylvektmarkør (3-188 kDa) inn i en midtre brønn av gelen for å lette analysen.
- Kjør gelen ved 200 V konstant spenning i 35 minutter.
- Flekk gelen med en kommersiell Coomassie blå løsning i 2 timer, og vask med ultrapure vann i 48 timer.
- Fastsettelse av biokonjugatet renhet ved UV-Vis-spektroskopi
- Forbered 120 mL av 5 mM løsninger av Ru (II) (TPY) 2 -maleimide, iso-en cyt c, og Ru (II) -cyt c.
- Mål grunnlinjen spektrum av kvarts kuvette inneholdende bare ultrarent vann, fra 250 nm til 650 nm.
- Mål spekteret av hver komponent, slik kyvetten skylles og tørkes mellom hver måling.
- Plotte absorbansen av hver komponent som funksjon av bølgelengde, og sammenligne den lineære summen av utgangsmaterialene med det endelige produkt for å bestemme om et 1: 1 forhold av Ru (II) (TPY) 2 -maleimide til cyt c har reagert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syntesen av bioconjugates bekreftes av tre hovedmetoder: Matrix-assistert laserdesorpsjon ionisering Time of Flight massespektrometri (MALDI-TOF MS), polyakrylamid-gel-elektroforese og ultrafiolett-synlig (UV-Vis) spektroskopi, som vist i figurene 2, 3 og 4. En masseøkning som tilsvarer massen av det etterfølgende lille molekyl, og mangelen på en ureagert protein viser den vellykkede kovalent binding av Ru (II) (TPY) 2 -maleimide til cyt c og etterfølgende rensing av biokonjugatet. UV-Vis spekteret av biokonjugatet lar utbyttet beregnes med absorbans ved 410 nm, og ved å sammenligne spektrumet til et forutsagt 1: 1 tillegg spektrum av utgangsmaterialene sammensetningen av biokonjugatet kan utledes. I eksempelet ovenfor, varierer utbyttet noe fra batch-til-batch, men det er vanligvis mellom 15-27% etter FPLC purificasjon 15.
I tillegg er utseendet av en ny topp i kromatogrammet under rensingen bekrefter syntesen av en ny art. Dette er eksemplifisert på figur 5, hvor analysen av de forskjellige UV-Vis-trasene kan indikere hvorvidt eller ikke en art inneholder Ru (II) (TPY) 2 -maleimide komponent.
Figur 2. MALDI-TOF Mass Spectra av proteiner. Massespektra av ren iso-en cytokrom c (svart) og Ru (II) -cyt c (rød). Topper kan observeres som tilsvarer de beregnede masser av iso-en cyt c (12706 Da) og Ru (II) -cyt c (13559 Da) med en koffeinsyre addukt synlig på 179 Da. Dette addukt er sett i større mengder i den ureagerte cyt c spectra på grunn av en reaksjon mellom α, β-umettet karbonyl med koffeinsyre og den frie tiol fra proteinet under høyt energi-MALDI betingelser. Matriks-addukter blir ofte sett i MALDI-MS og kan være både kovalent og ikke-kovalent i naturen. Spectra er baseline korrigert, støy filtrert, og normalisert for sammenligning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. SDS-PAGE av proteiner. 12% Bis-Tris gel av redusert og ikke-redusert cyt c og Ru (II) -cyt c. Lane 3 inneholder en pre-farget protein standard, med polypeptid masse kommenterte til høyre for hvert bånd (kDa). Klikk her for å se et større versjon av dette tallet.
Figur 4. UV-Vis Spectra of Proteins: Absorpsjonsspekteret av Ru (II) -cyt c (grønn) samsvarer godt med den lineære tilsetning (stiplet blå) rent, uomsatt cyt c (rød) og ureagert Ru (II) ( TPY) 2 -maleimide (svart). Dette viser at biokonjugatet består av en 1:. 1 festing av maleimide til protein Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. kromatogram av Ni-IMAC rensing av bioconjugates: IMAC spor av Ru (II) -cyt c rensing. UV-Vis spor: 410 nm tilsvarer Soret båndet cyt c, 280 nm tilsvarer både cyt c og Ru (II) (TPY) 2 -maleimide, og 475 nm tilsvarer metall mot ligand ladningsoverføring bandet av ruthenium (II) kompleks. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rensing av utgangsmaterialene før en bioconjugation er av største betydning. Proteiner erholdt fra kommersielle kilder rekombinante inneholder ofte andre isoformer av proteinet av interesse, som kan ha forskjellig overflatekjemi og reaktivitet. For eksempel, i den beskrevne bioconjugation, inneholder det kommersielt tilgjengelige cyt c en blanding av begge deler iso-1 og iso-2 cyt c 12,14,17. Iso-2 og iso-1-former av cytokrom c er i stor grad homolog med den største forskjellen er nærværet av en fri cysteinrest nær den C-terminale ende av iso-1-cytokrom c. I eksempelet her, er rensing oppnås med vandig sterk kation-utveksling FPLC, men andre former for FPLC som anionbytting, affinitetskromatografi, hydrofob eller størrelse-eksklusjonskromatografi kan være mer anvendelig. Proteinet blir også redusert i dette trinnet for å sikre at cysteinresten på proteinet av interesse (her cytokrom c) er fully redusert før bioconjugation med maleimide bundet mål. I tillegg, er det nyttig for å fastslå om den maleimid-føyd lite molekyl for å brukes sammen med en cystein-inneholdende protein er ren og at den maleimid har ikke gjennomgått en reaksjon på lager, som maleimider er lette og temperaturfølsomme. Dette kan raskt og enkelt kontrolleres ved 1H NMR, som de vinyliske protoner i en intakt maleimid vil vises som en singlett ved 6 til 6,5 ppm, mens protonene i en åpen maleimid vil skifte upfield; og også massespektrometri, med en åpen ring maleimid som svarer til en 18 Da masseøkning.
Buffer valg, pH, og inkludering av hjelpemidler slik som vaskemidler, organiske løsemidler, og reduksjonsmidler vil ha en dyp effekt på bioconjugation avkastning 5,15. I tilfelle av en Michael-addisjon av et maleimid og en tiol, må pH være over 6, men under 8 for en rask og spesifikk reaksjon oppstår. Under pH 6, er spesifisiteten høy sommaleimidet vil ikke være i stand til å reagere med eventuelle aminer, men tiolen er protonert og derfor er en dårlig nukleofil for Michael-addisjon som fører til en langsom reaksjon. Over pH 8, kan overflate lysinrestene blir deprotonerte og reagere med tilgjengelige maleimider, som fører til en ikke-spesifikk kovalent binding av maleimid-komponenten til proteinet. Fosfat-bufferen brukes i denne bioconjugation fordi det er en sterk buffer i dette pH-området og ikke reagerer med noen av reagensene. Tris (hydroksymetyl) aminometan (tris) buffer, for eksempel, ville være et dårlig valg som amingruppen i denne bufferen potensielt kan reagere med den maleimid, noe som ville føre til dårlige utbytter. Løseligheten av alle reagenser er også nøkkelen til høy avkastning. Tilsetningen av små mengder (<10% v / v) av organisk oppløsningsmiddel kan hjelpe til i oppløsningen av ikke-polare komponenter, mens riktig pH og saltkonsentrasjon er nødvendig for å holde proteinene i oppløsning og foldet 12. For stor membran Proteinkonns med vesentlige hydrofobe overflaterester, blir et overflateaktivt middel være nødvendig for å forhindre proteinet fra utfelling 18.
Hvis proteinet i bioconjugation er utsatt for oksydasjon og dimerisering, har tilsetningen av et reduksjonsmiddel slik som TCEP vist seg å forbedre bioconjugation utbytter 15. Den in situ reduksjon av protein til sin monomere, fritt tiol formen gir en større andel av aktive tiol nettsider for å nås av maleimide. Imidlertid tilsetningsrekkefølge og støkiometri er nøkkelen til vellykket en økning i utbytte som TCEP vil også reagere med maleimid. Ved å legge til maleimid etter TCEP, vil TCEP forbrukes ved reduksjon av proteinet først. En halv ekvivalent av TCEP til protein anvendes for samme grunn, slik at overflødig TCEP er ikke tilgjengelig for å reagere ufordelaktig med den fri maleimid. Strukturelle disulfidbroer på innsiden av protein er ikke sannsynlig å bli påvirket ved tilsetning av TCEPeller andre reduksjonsmidler, så som DTT, forutsatt at proteinet ikke blir holdt i denaturerende betingelser, slik som høy temperatur, eller en høy konsentrasjon av urea. For eksempel vil tilsetning av et stort overskudd av DTT Cyt c før FPLC rensingen ikke har en signifikant effekt på mengden av protein utvunnet etter rensing. Hvis man mistenker reduksjonen av struktur cystein-broer med TCEP, kan dette bli bekreftet ved å kjøre et protein-gel i henhold til native, ikke-denaturerende betingelser.
Det Ru (II) bisterpyridine-merket cytokrom c syntetisert ved denne fremgangsmåten renses ved Ni2 + immobilisert Metal Affinity Chromatography 14. Andre rensemetoder eksisterer, slik som størrelse-utelukkelses-kromatografi, anion / kation-byttekromatografi, og spesifikk affinitetskromatografi slik som et antistoff stasjonær fase. Generelt forblir fremgangsmåten den samme som beskrevet ovenfor, med konsentrering og dialysetrinn following kromatografisk rensing for å returnere biokonjugatet produktet til en egnet buffer for lagring.
Den primære metoden for å avgjøre om en bioconjugation er vellykket er via MALDI-TOF MS. Det er den mest nøyaktige måten å fastslå den lille forskjellen i masse mellom native protein og protein kovalent merket med et lite molekyl, en forskjell ofte mindre enn 1000 Da. Den vanskeligste delen av å kjøre en MALDI-TOF MS eksperimentet er matrise valg og spotting teknikk; imidlertid koffeinsyre har vist seg å være en pålitelig og generelle formål matriks for analyse av proteiner og bioconjugates som brukes i dette arbeidet. Som et potensielt alternativ, er sinapinic syre et annet vanlig brukt MALDI matrise for analyse av proteiner. Analyse av MALDI-TOF-MS-data er forholdsvis enkel. Figur 2 viser det typiske MALDI-TOF-MS-spektrum både i ren iso-en cyt c (Mw = 12 706 Da) og ren Ru (II) -cyt c (Mw = 13 559 Da), som begge nøye svarer til den beregnede molekylvekt. Renheten kan også observeres, og legg merke til mangelen på en iso-2-cytokrom c topp (Mw = 12 532 Da) i det ureagerte spektrum og mangelen på en iso-1-cytokrom c topp i biokonjugatet spekteret. Biokonjugatet masse kan også beregnes ved hjelp av gelelektroforese. Figur 3, en 12% Bis-Tris protein gel, gir to stykker av bevis for bioconjugation. Først fraværet av en dimer bånd under ikke-reduserende betingelser for Ru (II) -cyt c indikerer at det ikke lenger er en fri cystein, og andre, liten forskyvning av biokonjugatet båndet oppover betyr en økning i molekylvekt. Protein gels er uvurderlig og kan definitivt gi bevis på vellykket bioconjugation ikke bare for små molekyl vedlegg, men også for syntesen av protein dimer 5 eller protein-polymer bioconjugates 9.
for proteinersom inneholder kromoforer som for eksempel grønt fluorescerende protein eller hemeinneholdende cytokromer, UV-vis spektroskopi benyttes for å bestemme sammensetningen og utbyttet av biokonjugatet. 1: 1 lineær tilsetning av utgangsmaterialene spektra tillater bygging av en hypotetisk UV-Vis spekteret av biokonjugatet, som vist i figur 4 Ved å sammenligne de faktiske biokonjugatet spektret til denne. 1: 1 tillegg spektrum, kan preparatet være antatt . Hvis for eksempel to eller flere Ru (II) (TPY) 2 -maleimides var ikke-spesifikt bundet til proteinet, vil det 480 nm bånd av biokonjugatet være høyere enn den anslåtte spektrum. I tillegg kan konsentrasjonen av biokonjugatet tilnærmes ved å bruke 410 nm molare absorptiviteten verdi på 97,6 cm -1 -1 mM. Dette antas å være den samme for biokonjugatet fordi Ru (II) (TPY) 2 -maleimide har minimal absorbans i denne regionen.
Det bør bemerkes that bioconjugation via cystein-maleimide kjemi har flere begrensninger. For det første må proteinet av interesse har en enkelt, tilgjengelig cysteinrest, eller annet protein engineering må utføres for å innføre en. For det andre er det cystein-maleimid bindingen utsatt for utveksling med andre frie tioler, som for eksempel albumin og glutation i lys av plasma-applikasjoner 19. En slik utveksling er svært avhengig av løsningsmidlet tilgjengelighet og lokal ladning på overflaten av proteinet. Maleimide-tiol sammenhengene kan likevel være egnet for plasma-applikasjoner, men langsiktig stabilitet bør kontrolleres ved hjelp av massespektrometri og gel elektroforese.
Til tross for dette meget spesifikk, høy givende festing av nye molekyler slik som fluorescerende fargestoffer, redox-sentre, polymerer og andre proteiner til proteinene via cystein-maleimid kjemi er en kraftfull teknikk som gjør det mulig for en rekke interessante makromolekylære konstruksjoner for å være enccessed. Å ha store mengder kjemisk veldefinerte protein bioconjugates er nøkkelen til fremtidige studier som involverer proteinbinding, selvbygging, enzymkinetikk og protein lokalisering. Som vist ovenfor, utgangsmateriale rensing, valg av reaksjonsmedium, og tillegg av supplerende reagenser som reduksjonsmidler eller overflate alle har en betydelig innvirkning på bioconjugation avkastning. Rensning lettest oppnås ved protein-kompatibel kromatografi, og karakteriseringen blir oppnådd ved hjelp av en kombinasjon av MALDI-TOF-MS, gelelektroforese, og UV-vis spektroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Elsevier: Oxford. (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
