Summary
Detta protokoll detaljer de viktiga åtgärder som krävs för biokonjugering av en cysteininnehållande protein till en maleimid, inklusive reagens rening, reaktionsbetingelser, biokonjugatet rening och biokonjugatet karakterisering.
Introduction
Biokonjugering involverar kovalent bindning av en biomolekyl med en annan eller med en syntetisk molekyl såsom ett färgämne, läkemedel eller en polymer. Protein biokonjugering metoder nu i stor utsträckning används i många kemi, biologi och nanoteknik forskargrupper med tillämpningar som sträcker sig från fluorescerande färgämne märkning 1,2, vilket protein (antikropp) -prodrugs 3 (antikropp läkemedelskonjugat - ADC) syntes av protein dimerer 4,5 , genom att självsamlande proteinpolymerhybrider 6,7 används i nanomedicin 8 och system kemi 9.
Specificitet av kemin som används för biokonjugering, medan inte alltid är kritisk, är av yttersta vikt för de flesta funktionella protein biokonjugat, för att inte interferera med det aktiva stället i målproteinet. Den idealiska biokonjugering reaktion måste uppfylla flera kriterier, bland annat: i) riktar sällsynta eller unika ställen på proteinet av intresse,ii) vara selektiv mot detta mål, iii) fortsätta under icke-denaturerande förhållanden för att undvika protein utspelas och iv) vara högavkastande som målproteinet är vanligtvis endast tillgänglig vid under millimolar koncentration. Den maleimid - cystein Michael tillägg kommer nära att uppfylla alla dessa kriterier, och har av den anledningen länge hävdat en särställning när det gäller Bioconjugate Chemistry 10. Detta beror på att i) många proteiner som endast innehåller en cysteinrest på sin yta kan manipuleras genetiskt där, ii) vid korrekt pH reaktionen är i hög grad selektiv mot cystein, iii) det förs framåt i vattenhaltiga buffertar och iv) det är mycket snabb med den andra ordningens hastighetskonstant av maleimider till cysteininnehållande proteiner som rapporterats överstiga 5.000 M -1 sek -1 i vissa fall 11. Förutsatt att proteinet av intresse kan tolerera en liten (≈ 5-10%) mängd organiskt samlösningsmedel 12, nästan alla maleimid-funktion färgämne, polymer, yta eller ett annat protein kan kopplas till proteiner. Dessutom maleimider är mer specifika för cysteiner på proteiner än jodacetamider, som är mer benägna att reagera med andra nukleofiler vid förhöjt pH; och mer stabil än disulfid-baserade konjugationer som måste hållas vid surt pH för att förhindra disulfidutbyte 13.
Här rapporterar vi ett generiskt protokoll för konjugering av maleimid-funktionaliserade molekyler till ett protein som innehåller en enda cysteinrest med användning av reaktionen mellan en Ru (II) -baserade kromofor och redox-proteinet cytokrom c som ett exempel. Detta protokoll är lika tillämpbar på de flesta andra proteiner som innehåller en tillgänglig yta cysteinrest och motsvarande maleimid-funktionaliserad mål, vare sig det ett annat protein, ett fluorescerande färgämne, en kromofor eller en syntetisk polymer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Följande protokoll är avsedd för syntesen av ett protein-dye biokonjugat som visas i figur 1 Det är ett allmänt protokoll för reaktionen av en maleimid med fri yta cystein innehåller proteiner, med noter infogas i förekommande fall för att hjälpa till med membranprotein. biokonjugat, protein-polymer biokonjugat och syntetisk protein dimer (protein-protein) biokonjugat. I detta särskilda fall har proteinet iso-1 cytokrom c en yta cysteinrest tillgänglig för att reagera som tillåter en mycket specifik märkning för att inträffa. Om ett protein av intresse har flera cysteinrester, samma protokoll gäller, om än med en förlust av specificitet och produkthomogenitet. Kemi inriktning yta lysinrester användning av N -hydroxysuccinimidyl estrar eller isotiocyanater, kan vara en enklare metod om specificitet inte krävs.
1. Rening av cytokrom c
Obs: Det här steget är inte tillämplig på alla proteiner. Det är dock viktigt att veta att ett protein erhållet från en kommersiell leverantör kan innehålla andra, oönskade proteinisoformer som kan behöva avlägsnas genom ytterligare rening 13.
- Lös upp 2,4 g natriumdivätefosfat (Mw = 120 g mol -1) i 1 L ultrarent vatten till prepare en buffertlösning innehållande 20 mM NaH 2 PO 4. Justera pH med 1 M NaOH till pH 7.
Obs! Fosfatbuffertar som används i detta protokoll bör beredas på en daglig basis, och filtreras genom ett 0,2 pm cellulosamembranfilter före användning. - Lös upp 29,22 g natriumklorid (Mw = 58,44 g mol -1) i 500 ml av 20 mM NaH 2 PO 4-buffert för att göra en 20 mM NaH 2 PO 4 och 1 M NaCl-buffert. Detta är elueringsbufferten för rening i steg 1,6).
- Lös 12,0 mg frystorkat cytokrom c (cyt c) i 6 ml pH 7 20 mM fosfatbuffert.
- Separat upplösa 14,7 mg ditiotreitol (DTT, M ^ = 154,25 g / mol) i 95,3 | il av ultrarent vatten för att framställa en 1 M förrådslösning.
Obs! DTT lager lösning bör beredas, eftersom detta reagens är känslig för oxidativ inaktivering i vattenlösning. - Pipette 60 pl av 1 M DTT-lösning i proteinlösningen för att minska cyt c. Färgen på lösningen ändras från mörkt röd till ljusröd vid blandning.
- Filtrera den reducerade proteinlösningen genom ett 0,22 um låg proteinbindning PVDF sprutfilter före injektion på någon kromatografiska media.
- Bifoga en 3,3 ml stark katjonbytarkolonn mellan injektionsslingan och UV-Vis-detektor av en snabb protein vätskekromatografi (FPLC) instrument.
- Jämvikta kolonnen med 3 kolonnvolymer ultrarent vatten, följt av 3 kolonnvolymer av 20 mM fosfatbuffert pH 7, med användning av en flödeshastighet av 1 ml / min.
- Belastning 1 ml reducerad rå cyt c in i injektionsslingan, och starta en gradientmetoden 328-450 mM NaCl, över 5 kolonnvolymer. Övervaka de 280 nm och 410 nm kanalerna hos UV-Vis-detektor, och samla den största topp.
- Öka saltkoncentrationen till ett M för två kolonnvolymer för att eluera iso-2 cytokrome c, och efter kolonnen har spolats, åter jämvikt kolonnen med 2 kolonnvolymer av 20 mM fosfatbuffert före injektion av nästa rå portionen.
- Upprepa steg 1,9-1,10 tills all råprotein har renats.
- Pool ISO-1 innehållande fraktionerna och koncentrera dem med en 3,5 kDa molekylviktgräns (MWCO) spinnfilter och centrifugering vid 3000 x g.
- Ladda koncentrerade proteinet i 3,5 kDa MWCO dialyskassetter och dialysera mot ultrarent vatten över natten, med 2 byten av vatten.
- Bestämma koncentrationen av det rena, koncentrerade proteinlösningen genom att ta 10 ul, späda den till 100 pl med ultrarent vatten, och med en absorbans-spektrum. Använd en låg volym, till 100 ^ kvartskuvett erhålla protein absorbansspektra. Typiskt är den outspädda proteinkoncentration i storleksordningen 50 - 100 pM.
- Använda den karakteristiska 410 nm toppen av cyt c för att kvantifiera concentration med hjälp av Beer-Lambert lag med en molar absorptionsförmåga värde av 97,6 cm -1 mM -1:
A = ε × c × ι
där A är absorbansen, är ε molar absorptionsförmåga, c är koncentrationen i mM, och ι är banlängden av kyvetten i cm 13.
- Använda den karakteristiska 410 nm toppen av cyt c för att kvantifiera concentration med hjälp av Beer-Lambert lag med en molar absorptionsförmåga värde av 97,6 cm -1 mM -1:
- Vid denna punkt, dela proteinet i 1 ml alikvoter och hålla fryst vid -20 ° C tills de behövs. Cyt c kan frysas och tinas utan förlust av struktur eller funktion, men upprepade behandlingscykler börjar att denaturera proteinet.
Obs: Proteiner tål frysning i olika grad. Till exempel, grönt fluorescerande proteiner 5,9 bör inte frysas, i stället förvaras i kylskåp.
2. Syntes av cytokrom c biokonjugat
- Lös upp 0,9 mg av rutenium (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (ton per år) 2 -maleimide, 0,975 pmol, 6 ekvivalenter) i 600 | il acetonitril.
Obs: Om maleimid som används är löslig i vatten, bereda en stamlösning i vatten i stället för acetonitril. Det är viktigt för den maleimid vara löslig i reaktionsbufferten. Dimetylsulfoxid, N, N-dimetylformamid och acetonitril är alla vanligen använda adjuvans för att hjälpa till vid upplösningen av låg molekylvikt 12, ofta hydrofoba maleimid reaktanter. - Bered en buffertlösning innehållande 100 mM fosfatbuffert och 100 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA, M ^ = 292,24 g / mol), som när den späds till 20 mM är vid pH 7. Lägg fast natriumhydroxid tills EDTA löses (flera gram typiskt ) och justera pH till 7.
- Lös upp 2,87 mg Tris (2-karboxietyl) fosfin hydroklorid (TCEP 15, M ^ = 286,65 g / mol) i 1 ml ultrarent vatten för att framställa en 10 mM förrådslösning. Detta steg är important för att säkerställa att cysteinet på proteinet är fullständigt reduceras före maleimid koppling 15.
Obs! TCEP lager lösning bör beredas för varje reaktion, eftersom detta reagens är känslig för oxidativ inaktivering i vattenlösning. - Kombinera 11,4 ml ultrarent vatten med 3 ml 100 mM fosfat / EDTA stamlösning i 50 ml plaströr. Vid utspädning ytterligare med protein och maleimid stamlösningar buffertkoncentrationen kommer att vara 20 mM.
Obs: Om proteinet är märkt är ett transmembranprotein, se till att en lämplig detergent tillsätts till bufferten för att solubilisera proteinet. Om ett rengöringsmedel inte används membranproteinet kan sakta falla ut, vilket negativt påverkar reaktionsutbyten. Använd tvättmedel i alla efterföljande reningssteg. - Lägga 0,15 | imol (3 ml av en 50 ^ M lösning, 1 ekvivalent) av renat cyt c till fosfat-EDTA-buffert.
- Lägga 7,5 pl av TCEP lager lösnjon (0,075 pmol, 0,5 ekvivalenter) till proteinlösningen och lämna under omröring i 5 min för att minska vilket som helst protein som kan ha dimeriseras på grund av cystein oxidation.
Obs: Lägg inte till TCEP om proteinet av intresse inte dimerisera lätt. Kontrollera detta genom att köra ett protein gel under icke-reducerande betingelser. - Tillsätt 600 pl av acetonitrillösning av Ru (II) (ton per år) 2 -maleimide till den reducerade, buffrad lösning av cyt c, och lämnar reaktionsblandningen under omröring, i mörker, vid RT, under 24 timmar.
- Koncentrera reaktionsblandningen under användning av 3,5 kDa MWCO spinnfilter, centrifugering vid 3000 xg, upprepa 2-3 gånger med färska 20 mM fosfatbuffert tills filtratet är klart. Ta bort så mycket oreagerad maleimid från reaktionsblandningen som möjligt innan nästa steg i reningen.
Obs: Vid denna punkt kan den råa biokonjugering blandning förvaras i kylskåp, i mörkret. Det är viktigt att avlägsna oreagerad maleimid färgämne genom centrifuge dialys före lagring som maleimiden kan långsamt och ospecifikt reagera med lysinrester på ytan av proteinet.
3. Rening av cytokrom c biokonjugat
- Lös upp 2,4 g natriumdivätefosfat och 29,22 g natriumklorid i 1 liter ultrarent vatten för att framställa en buffertlösning innehållande 20 mM NaH 2 PO 4 och 0,5 M NaCl. Detta är löpbufferten för den immobiliserade metall-affinitetskromatografi (IMAC) rening.
- Lös upp 17 g imidazol (M ^ = 68,077 g mol -1) i 500 ml av 20 mM NaH 2 PO 4 och 0,5 M NaCl-buffert. Detta är elueringsbufferten för IMAC-rening.
- Justera pH för båda buffertarna till pH 7 med användning av 1 M NaOH eller HCl och filtrera dem genom 0,22 | im regenererade cellulosamembran före användning i FPLC.
- Som iMac kolumner köps levereras utan några metalljoner lastas på colUMN, förbereda kolonnen för en Ni2 + -baserad rening genom tvättning av kolonnen med 3 ml av ultrarent vatten, 3 ml av 100 mM nickelacetat-lösning och 6 ml ultrarent vatten. Om kolumnen inte skall användas omedelbart tvätta genom 3 ml 20% etanol och lagra kolumn i kylskåp för att förhindra bakterietillväxt.
- Bifoga en Ni2 + -loaded 1 ml IMAC-kolonnen till FPLC mellan injektionsslingan och UV-Vis-detektor.
- Jämvikta kolonnen med 3 kolonnvolymer 20 mM fosfat, 0,5 M NaCl-buffert med användning av en flödeshastighet av 0,5 ml / min.
- Belastning 100 pl råa reaktionsblandningen (filtrerades genom ett 0,22 | j, m sprutfilter) på Ni 2+ IMAC-kolonnen. Tvätta kolonnen med 3 kolonnvolymer av körningsbuffert för att eluera icke-reagerat cyt C, följt av en imidazol-gradient 0-125 mM över tre kolonnvolymer för eluering av rutenium bisterpyridine-cytokrom c biokonjugat (Ru (II) -cyt c) .
- Tvätta column med 250 mM imidazol buffert för 5 kolonnvolymer, sedan åter jämvikta kolonnen med 20 mM fosfat, 0,5 M NaCl och upprepa steg 3,7 tills all den råa biokonjugatet har renats.
- Pool biokonjugatet fraktionerna och koncentrera dem med en 3,5 kDa MWCO spinnfilter, centrifugering vid 3000 x g.
- Ladda koncentrerade biokonjugatet i 3,5 kDa MWCO dialyskassetter och dialysera mot ultrarent vatten över natten, med 2 byten av vatten.
- Bestämma koncentrationen av det rena, koncentrerade biokonjugatet lösningen genom UV-Vis, med användning av samma molära absorptiviteten värde som iso-1 cytokrom c (97,6 mM -1 cm -1) vid 410 nm. Typiskt är biokonjugatet koncentration av storleksordningen 50 - 100 pM.
- Dela biokonjugatet i 25 pl portioner och hålla fryst vid -20 ° C tills de behövs.
4. Karakterisering av cytokrom c biokonjugat
- Avskräckaställandet av biokonjugat massa med MALDI-TOF MS
- Lös upp 10 mg av kaffeinsyra i 1 ml av en acetonitril / vatten / trifluorättiksyra-lösning (80: 20: 0,1, volym / volym / volym).
- Späd 5 | il av koncentrerade proteinlösningen med 5 pl av kaffeinsyra lösning.
- Spot 0,5 pl av kaffeinsyra lösningen på MALDI målplattan och låt lösningen torka.
- Spot 0,5 pl prov / matrislösning ovanpå denna kaffeinsyra plats, låt fläcken torka. Spot ytterligare 0,5 pl av provmatris ovanpå detta till "sandwich" provet mellan skikt av matrisen, och låt torka.
- Förvärva masspektra i linjärt läge med lämpliga instrumentinställningar för proteiner 16.
- Undersökning av biokonjugat med gelelektrofores
- Förbered 10 l av varje prov protein som ska köras genom att späda proteinprover med färdigblandad litium-dodecylsulfat (LDS, pH 8,4) buffert (4x) toa slutlig koncentration av ca 20 | j, g per brunn. För brunnar som kräver reducerande betingelser, tillsätts 1 | il av 500 mM ditiotreitol (DTT) reduktionsmedel (10x).
- Värme prover vid 70 ° C under 10 minuter.
- Tillsätt 50 ml av den förblandade 1 M MES, 1 M Tris-bas, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7,7) körningsbuffert blandning (20x) från en kommersiell källa till 950 ml av ultrarent vatten för att framställa gelén löpbufferten.
- Ta bort plast kammen från gelén och placera gelen i gelén bränsletanken. Fyll upp tanken med gel rinnande buffert så att brunnarna är täckta med buffert.
- Belastningsprov försiktigt på en prefabricerad 12% Bis-Tris, 1 mm, 10 brunnar under användning av långa pipettspetsar för att underlätta lastning. Ladda förfärgade 10 proteinmolekylviktsmarkör (3-188 kDa) i en mitt brunn av gelén för att underlätta analys.
- Kör gelén vid 200 V konstant spänning under 35 minuter.
- Fläcka gelén med en kommersiell Coomassie blå lösning under 2 timmar, och tvätta med ultrapure vatten under 48 timmar.
- Fastställande av biokonjugat renhet genom UV-Vis-spektroskopi
- Förbereda 120 pl av 5 | iM lösningar av Ru (II) (ton per år) 2 -maleimide, iso-1 cyt c, och Ru (II) -cyt c.
- Mäta baslinjen spektrum för kvartskyvett innehållande enbart ultrarent vatten, från 250 nm till 650 nm.
- Mäta spektrum för varje komponent, vilket garanterar kyvetten sköljs och torkas mellan varje mätning.
- Plotta absorbansen för varje komponent som en funktion av våglängd, och jämför den linjära summan av utgångsmaterialen med den slutliga produkten för att bestämma om ett 1: 1 förhållande av Ru (II) (ton per år) 2 -maleimide till cyt c har reagerat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syntesen av biokonjugat bekräftas av tre primära metoder: Matrix-Assisted Laser Desorption lonization Time of Flight-masspektrometri (MALDI-TOF MS), polyakrylamid-gelelektrofores, och ultraviolett ljus-synligt (UV-Vis) spektroskopi, såsom visas i figurerna 2, 3 och 4. En massökning som motsvarar massan av den bifogade liten molekyl, och avsaknaden av en oreagerad protein demonstrerar den framgångsrika kovalenta kopplingen av Ru (II) (ton per år) 2 -maleimide till cyt c och efterföljande rening av biokonjugatet. UV-Vis-spektrumet för biokonjugatet tillåter utbytet som skall beräknas med absorbansen vid 410 nm, och genom jämförelse av spektrumet till ett förutsagt en: en tillsats spektrum av utgångsmaterialen sammansättningen av biokonjugatet kan utläsas. I exemplet ovan, varierar avkastningen något från sats till sats, men det i allmänhet mellan 15-27% efter FPLC purification 15.
Dessutom, uppkomsten av en ny topp i kromatogrammet under rening bekräftar syntes av en ny art. Detta exemplifieras i fig 5, där analysen av de olika UV-Vis spår kan indikera huruvida eller inte en art innehåller Ru (II) (ton per år) 2 -maleimide komponent.
Figur 2. MALDI-TOF Mass-spektra av proteiner. Masspektra av ren iso-1 cytokrom c (svart) och Ru (II) -cyt c (röd). Toppar kan observeras som motsvarar de beräknade massorna av iso-1 cyt c (12706 Da) och Ru (II) -cyt c (13559 Da) med en koffeinsyra addukt synlig vid 179 Da. Denna addukt ses i större mängder i den oreagerade cyt c spectra på grund av en reaktion mellan α, β-omättade karbonyl av kaffeinsyra och den fria tiolen av proteinet under hög-energi MALDI förhållanden. Matris addukter är vanliga i MALDI-MS och kan vara både kovalent och icke-kovalent till sin natur. Spectra är baslinjen korrigeras buller filtreras, och normaliseras för jämförelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. SDS-PAGE av proteiner. 12% Bis-Tris-gel av reducerad och icke-reducerad cyt c och Ru (II) -cyt c. Bana 3 innehåller en pre-målat proteinstandard, med polypeptid massa kommenterade till höger om varje band (kd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. UV-Vis-spektra för Proteins: Absorbansen spektrum av Ru (II) -cyt c (grön) motsvarar nära den linjära additions (streckad blå) ren, oreagerad cyt c (röd) och oreagerad Ru (II) ( ton per år) 2 -maleimide (svart). Detta visar att biokonjugatet består av en 1: 1. Fastsättning av maleimid till proteinet Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Kromatogram av Ni-IMAC-rening av biokonjugat: IMAC spår av Ru (II) -cyt c rening. UV-Vis spår: 410 nm motsvarar Soret band cyt c, 280 nm motsvarar både cyt c och Ru (II) (ton per år) 2 -maleimide och 475 nm motsvarar metall-mot-ligand laddningsöverföringsband av rutenium (II) komplex. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rening av utgångsmaterial innan en biokonjugering är av yttersta vikt. Proteiner erhållna från kommersiella rekombinanta källor innehåller ofta andra isoformer av proteinet av intresse, som kan ha olika ytkemi och reaktivitet. Till exempel i den beskrivna biokonjugering, den kommersiellt tillgängliga cyt c innehåller en blandning av båda iso-1 och iso-2 cyt c 12,14,17. Iso-2 och iso-1 former cytokrom c är i stort sett homolog med den huvudsakliga skillnaden är närvaron av en fri cysteinrest nära C-terminalen av iso-1 cytokrom c. I exemplet här är rening uppnås med vatten stark katjonbytarmembran FPLC, men andra former av FPLC såsom anjonbyte, affinitet, hydrofoba eller storlek kromatografi kan vara mer relevant. Proteinet reduceras även i detta steg för att säkerställa att cysteinresten på proteinet av intresse (här cytokrom c) är fully reduceras före biokonjugering med maleimid bundna mål. Dessutom är det användbart att säkerställa om den maleimid-bifogad liten molekyl som skall användas med en cysteininnehållande protein är ren och att den maleimid inte har genomgått en reaktion i lagring, såsom maleimider är ljus- och temperaturkänsliga. Detta kan snabbt och enkelt kontrolleras av ett H-NMR, såsom de vinyliska protonerna i en intakt maleimid kommer att visas som en singlett vid 6-6,5 ppm, medan de protoner i en öppen maleimid kommer att skifta uppåt fältet; och även masspektrometri, med en öppen maleimid ring motsvarar en 18 Da massökning.
Buffert val, pH, och införandet av adjuvans såsom tvättmedel, organiska lösningsmedel, och reduktionsmedel kommer att ha en stor inverkan på biokonjugering ger 5,15. I fallet med en Michael-addition av en maleimid och en tiol och pH-värdet ligga över 6 ännu lägre än 8 för en snabb, specifik reaktion skall inträffa. Under pH 6, är hög specificitetmaleimiden kommer inte att kunna reagera med eventuella aminer, men tiolen är protonerad och sålunda är en dålig nukleofil för Michael-addition som leder till en långsam reaktion. Över pH 8, kan ytan lysinrester blivit deprotonerad och reagerar med tillgängliga maleimider, vilket leder till en icke-specifik kovalent bindning av den maleimid komponenten till proteinet. Fosfatbuffert används i denna biokonjugering eftersom det är en stark buffert i detta pH-område och interagerar inte med något av reagensen. Tris (hydroximetyl) aminometan (Tris) buffert, till exempel, skulle vara ett dåligt val som amingruppen i denna buffert kan potentiellt reagera med maleimid, vilket skulle leda till dåliga utbyten. Löslighet av samtliga reagens är också nyckeln till hög avkastning. Tillsats av små mängder (<10% volym / volym) av organiskt lösningsmedel kan bistå vid upplösningen av icke-polära komponenter, samtidigt rätt pH och saltkoncentration är viktigt för att hålla proteinerna i lösning och viks 12. För stora membran proteins med betydande hydrofoba ytan rester kommer ett ytaktivt vara nödvändiga för att förhindra proteinet från utfällning 18.
Om proteinet i biokonjugering är benägen att oxidation och dimerisering, har tillsatsen av ett reduktionsmedel, såsom TCEP visat sig förbättra biokonjugering utbyten 15. In situ reduktion av proteinet till dess monomera, fria-tiol formen tillåter en större andel av aktiva tiol områden som skall nås av maleimid. Men är tillsatsordning och stökiometri nyckeln till en framgångsrik ökning av utbytet som TCEP kommer också att reagera med maleimid. Genom att lägga till maleimid efter TCEP kommer TCEP förbrukas genom att reducera proteinet först. En halv ekvivalent av TCEP till protein används av samma skäl, så att överskott av TCEP inte är tillgänglig för att reagera ogynnsamt med den fria maleimid. Strukturella disulfidbryggor på insidan av proteinet sannolikt inte att påverkas genom tillsats av TCEPeller andra reduktionsmedel såsom DTT, under förutsättning att proteinet inte hålls i denaturerande betingelser såsom hög temperatur eller en hög koncentration av urea. Till exempel, tillsats av ett stort överskott av DTT cyt c före FPLC rening inte har någon signifikant effekt på mängden protein återvinns efter rening. Vid misstanke om minskning av struktur cystein broar av TCEP är, kan detta bekräftas genom att köra en proteingel under nativa, icke-denaturerande betingelser.
Ru (II) bisterpyridine-märkt cytokrom c syntetiseras i denna metod renas via Ni2 + Immobiliserad Metal Affinity Chromatography 14. Andra reningsmetoder finns, såsom gelkromatografi, anjon / katjon-byteskromatografi, och specifik affinitetskromatografi såsom en antikropp stationär fas. I allmänhet, den metod som förblir densamma som beskrivits ovan, med koncentration och dialysstegen following kromatografisk rening för att returnera biokonjugatet produkten till en lämplig buffert för lagring.
Den primära metoden för att fastställa om en biokonjugering är framgångsrika är via MALDI-TOF MS. Det är det mest korrekta sättet att fastställa den lilla skillnaden i massa mellan nativt protein och protein kovalent märkt med en liten molekyl, en skillnad ofta mindre än 1000 Da. Den svåraste delen av att driva en MALDI-TOF MS experiment är matris val och observation teknik; men kaffesyra har visat sig vara en pålitlig, generell matris för analys av proteiner och biokonjugat som används i detta arbete. Som en potentiell alternativ är sinapinsyra annan vanligt förekommande MALDI matris för analys av proteiner. Analys av MALDI-TOF MS-data är relativt rättfram. Figur 2 visar den typiska MALDI-TOF MS-spektrum av både rena iso-1 cyt c (Mw = 12706 Da) och ren Ru (II) -cyt c (Mw = 13559 Da), vilka båda nära motsvara den beräknade molekylmassan. Renheten kan också observeras, att notera avsaknaden av en iso-2 cytokrom c topp (M ^ = 12532 Da) i den oreagerade spektrum och avsaknaden av en iso-1 cytokrom c topp i biokonjugatet spektrumet. Biokonjugatet massa kan också uppskattas med hjälp av gelelektrofores. Figur 3, en 12% Bis-Tris-protein gel, ger två bevis för biokonjugering. För det första, frånvaron av en dimer band under icke-reducerande betingelser för Ru (II) -cyt c indikerar att det inte längre finns en fri cystein, och för det andra den liten förskjutning av biokonjugatet bandet översätter uppåt till en ökning i molekylvikt. Protein geler är ovärderliga och kan definitivt ge bevis på framgångsrik biokonjugering inte bara för småmolekylära bilagor, men även för syntes av protein dimerer 5 eller proteinpolymer biokonjugat 9.
för proteinerinnehållande kromoforer såsom grönt fluorescerande protein eller heme-innehållande cytokromer, UV-Vis-spektroskopi användes för att bestämma sammansättningen och utbytet av biokonjugatet. Den 1: 1 linjär tillsats av utgångsmaterialen spektra medger konstruktion av en hypotetisk UV-Vis-spektrumet för biokonjugatet, såsom visas i figur 4 Genom att jämföra den faktiska biokonjugatet spektrum till detta en:. En tillsats-spektrum, kan kompositionen vara härledd . Till exempel, om två eller flera Ru (II) (ton per år) 2 -maleimides hade icke-specifikt bundna till proteinet, skulle 480 nm band av biokonjugatet vara högre än det förutsagda spektrat. Dessutom kan koncentrationen av biokonjugatet approximeras med hjälp av 410 nm molar absorptivitet värde av 97,6 cm -1 mM -1. Detta antas vara densamma för biokonjugatet eftersom Ru (II) (ton per år) 2 -maleimide har minimal absorbans i denna region.
Det bör noteras that biokonjugering via cystein-maleimid kemi har flera begränsningar. För det första måste det intressanta proteinet har en enda, tillgänglig cysteinrest, annars proteinteknik måste utföras för att införa en. För det andra är cystein-maleimid bindning mottaglig för utbyte med andra fria tioler, såsom albumin och glutation i samband med plasmaapplikationer 19. Ett sådant utbyte är i hög grad beroende av den lösningsmedelstillgänglighet och lokal laddning på ytan av proteinet. Maleimid-tiol bindningar kan fortfarande vara lämplig för plasmatillämpningar, men långtidsstabilitet bör kontrolleras med hjälp av masspektrometri och gelelektrofores.
Trots detta är det mycket specifika, högavkastande fastsättning av nya molekyler såsom fluorescerande färgämnen, redoxcentra, polymerer och andra proteiner till proteiner via cystein-maleimid kemi en kraftfull teknik som möjliggör en rad intressanta makromolekylära konstruktioner att vara enccessed. Med stora mängder kemiskt väldefinierade protein biokonjugat är nyckeln till framtida studier av proteinbindning, självorganisering, enzymkinetik och protein lokalisering. Som framgår ovan, utgångsmaterial rening, val av reaktionsmedium, och tillägget av extra reagens, såsom reduktionsmedel eller ytaktiva alla har en betydande inverkan på biokonjugering avkastning. Rening uppnås enklast genom proteinkompatibel kromatografi och karakterisering åstadkommes med användning av en kombination av MALDI-TOF MS, gelelektrofores, och UV-Vis-spektroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Elsevier: Oxford. (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
