Summary
Bu protokol, reaktif saflaştırma, reaksiyon koşulları, Bioconjugate saflaştırma ve Bioconjugate karakterizasyonu dahil olmak üzere, bir maleimid proteini ihtiva eden bir sisteinin bioconjugation için gerekli olan önemli adımlar göstermektedir.
Introduction
Bioconjugation kovalent bir boya, bir ilaç veya bir polimer gibi bir sentetik molekülü bir ya da sadece bir biyomolekülün bağlantı içerir. Protein bioconjugation yöntemleri artık yoğun protein yapma, floresan boya etiketleme 1,2 arasında değişen uygulamalarla birçok kimya, biyoloji ve nanoteknoloji araştırma gruplarında kullanılan (antikor) 3 (antikor ilaç konjugatları - ADK) -prodrugs protein dimerleri 4,5 sentezini , nanotıp 8 ve sistemler kimya 9 kullanılan kendinden montaj protein polimer melezler 6,7 kadar.
kimya Özelliği, her zaman kritik olmasa da, hedef proteinin aktif site ile müdahale etmeyecek şekilde, en fonksiyonel proteini biyokonjugatlar için büyük önem taşımaktadır, bioconjugation kullanılır. Ilgilenilen protein i) hedefleme nadir veya benzersiz siteler: İdeal bioconjugation reaksiyonu da dahil olmak üzere, çeşitli kriterleri yerine getirmek gerekiyorii) iii) açılımı protein önlemek için denatüre edici olmayan koşullar altında devam, bu hedefe yönelik seçici olmak ve hedef protein genellikle alt milimolar konsantrasyonda kullanılabilir olarak iv) yüksek verimli olacak. Maleimid - sistein Michael katılması, tüm bu kriterlere uygun yakın geliyor ve bu nedenle uzun Bioconjugate Chemistry 10 alanında özel bir statüye iddia için vardır. i) kendi yüzeyi üzerinde tek bir sistein kalıntısı ihtiva eden bir çok protein, genetik doğru pH Reaksiyon sistein karşı yüksek oranda seçicidir ii) vardır tasarlanmış olabilir, çünkü bu, iii), sulu tamponlar içinde düzgün bir şekilde devam eder ve iv) çok hızlıdır bazı durumlarda, 11 5000 M-1 sn-1 aşan bildirilmiştir sistein içeren proteinlere maleimid ikinci dizi oranı sabiti ile. 12 ilgilenilen protein organik bir küçük (≈% 5-10) miktarı tolere edebilir sağlanan eş-çözücü, hemen hemen her maleimid fonksiyonlu boya, polymer, yüzey veya başka bir protein, protein ile bağlantılı olabilir. Buna ek olarak, maleimitler, yüksek pH diğer nükleofillerle reaksiyona daha yatkındır iyodoasetamid, daha proteinler üzerinde sistein daha özel olarak; ve disülfid değişim 13 önlemek için asidik pH değerinde tutulması gerekir disülfid tabanlı çekimleri daha kararlı.
Burada, bir Ru (ll) tabanlı kromofor ve örnek olarak redoks proteini sitokrom c arasındaki reaksiyonu kullanarak tek bir sistein kalıntısı ihtiva eden bir proteine maleimid işlevselleştirilmiş moleküllerin bağlanması için genel bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, erişilebilir bir yüzeye sistein kalıntısı ve karşılık gelen maleimid-işlevselleştirilmiş bir hedef içeren, başka proteinler için de geçerlidir, bu bir protein, bir floresan boya, bir kromofor veya sentetik polimer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Şekil 1 'de gösterildiği gibi, aşağıdaki protokolü, bir protein-boya Bioconjugate sentezi için tasarlanmıştır notları yerleştirilmiş membran protein ile yardımcı olmak için durumlarda bu, serbest yüzey sistein ihtiva eden proteinlerle bir maleimid reaksiyonu için genel bir protokoldür. Bioconjugatlar protein polimer Bioconjugatlar ve sentetik protein dimeri (protein-protein) Bioconjugatlar. Bu özel durumda, protein izo-1 sitokrom C yüksek ölçüde özel bir işaretleme meydana sağlar tepkimeye uygun bir yüzey sistein artığı bulunur. ilgi konusu bir protein çoklu sisteyin artıkları ihtiva ediyor ise, aynı protokol özgüllük ve ürün homojenliği kaybı olsa geçerlidir. Özgüllük gerekli değilse N -hydroxysuccinimidyl esterleri ya da izotiosiyanatlar kullanılarak Kimya hedefleme yüzeyi lisin artıkları, daha basit bir yaklaşım olabilir.
Sitokrom c 1. Saflaştırma
Not: Bu adım, tüm proteinlerin için geçerli değildir. Bununla birlikte, ticari bir kaynaktan elde edilen bir protein, bir daha arıtılmadan 13 çıkarılabilir gereken diğer istenmeyen protein izoformları içeren olduğunu bilmek önemlidir.
- Pr ultra saf su, 1 L (= 120 g mol-1 W E) sodyum dihidrojen fosfat 2.4 g çözülür20 mM NaH 2 PO 4 ihtiva eden bir tampon çözelti epare. pH 7-1 M NaOH ile pH ayarlayın.
Not: Bu protokolde kullanılan fosfat tampon her gün taze olarak hazırlanmıştır, ve kullanımdan önce 0.2 um'lik bir selüloz zar filtresi gerekir. - 20 mM NaH 2 PO 4 ve 1 M NaCl tampon yapmak için sodyum klorid 29.22 gramını (ağırlık M = 58.44 g mol-1), 20 mM NaH 2 PO 4 tampon, 500 ml içinde çözülür. Bu adım 1.6) 'de arıtma için elüsyon tamponudur.
- PH 7 20 mM fosfat tamponu içinde 6 ml liyofilize sitokrom c (cyt c) 12.0 mg eritin.
- Ayrıca, bir 1 M stok çözelti hazırlamak için ultra saf su 95,3 ul ditiyotreitol 14.7 mg (DTT, B, E = 154,25 g / Mol) çözülür.
Not: bu madde, sulu çözelti içinde oksidatif deaktivasyon duyarlı olduğu gibi DTT stok çözeltisi taze hazırlanmalıdır. - ölmekProtein çözeltisi içine 1 M DTT çözeltisi 60 ul ette Cyt c azaltır. çözeltinin renk karıştırma üzerine ışık kırmızı koyu kırmızı değişecektir.
- Herhangi bir kromatografik ortama enjekte etmeden önce 0.22 mikron düşük protein bağlayıcı PVDF şırınga filtresi aracılığıyla azaltılmış protein çözüm Filtre.
- enjeksiyon döngüsü ve Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) aletin UV-Vis detektörü ile 3.3 ml güçlü katyon değişim sütunu takın.
- 1 ml / dk'lık bir akış oranı kullanılarak, 20 mM pH 7 fosfat tamponunun 3 sütun hacim ardından ultra saf su, 3 kolon hacminde ile sütun dengelenmesi.
- Yük 1 enjeksiyon döngü içine indirgenmiş ham cyt c ml ve 328 bir degrade yöntemi başlatmak - 5 sütun hacmi üzerinde 450 mM NaCl,. UV-Vis dedektör 280 nm ve 410 nm kanalı izlemek, ve en büyük zirve toplamak.
- iso-2 sitokrom Zehir 1 M 2 kolon hacmi tuz konsantrasyonunu arttırmakE, C ve sütun boşaltılan sonra, aşağıdaki ham kısım enjekte edilmeden önce fosfat tampon 20 mM 2 sütun hacmi ile sütun yeniden dengeye.
- tüm ham protein saflaştırılmış kadar tekrarlayın 1.9-1.10 adımları.
- izo-1 ihtiva eden fraksiyonlar bir havuz ve 3.5 kDa moleküler ağırlık cutoff değeri (MWCO) sıkma filtre kullanılarak ve 3,000 x g de santrifüj bunları konsantre edin.
- 3.5 kDa MWCO diyaliz kasetleri içine konsantre protein yükleyin ve su 2 değişikliklerle, ultra saf su bir gecede karşı dialyze.
- 10 ul alan, aşırı saf su ile 100 ul'ye seyreltilmesi, ve absorbans spektrumunun alınarak saf, konsantre protein çözeltisi konsantrasyonunu belirlemek. Düşük hacim kullanın, 100 ul kuvars küvet protein emme spektrumları elde etmek. 100 uM - Tipik olarak, seyreltilmemiş protein konsantrasyonu 50 mertebesindedir.
- Concentratio ölçmek için Cyt c karakteristik 410 nm tepe kullanınn 97.6 cm -1 mM -1 molar absorptivite değeri Beer-Lambert yasası kullanılarak:
A = ε × c × ι
Bir emme olduğu, ε molar emicilik, Cı mM konsantrasyonu, ve ι cm 13 küvetin yolu uzunluğudur.
- Concentratio ölçmek için Cyt c karakteristik 410 nm tepe kullanınn 97.6 cm -1 mM -1 molar absorptivite değeri Beer-Lambert yasası kullanılarak:
- Bu noktada, 1 mL alikotlara protein bölmek ve gerekli olana kadar -20 ° C'de dondurulmuş tutun. Sit c dondurulmuş ve yapı ya da fonksiyon kaybı olmadan çözülmüş, ancak tekrar döngüleri proteinin denatüre başlayacak edilebilir.
Not: Proteinler farklı derecelerde dondurma tahammül. Örneğin, 5,9 dondurulamaz yeşil floresan protein yerine bir buzdolabı içinde depolanmıştır.
Biyokonjugatlar c Sitokrom 2. Sentezi
- rutenyum 0.9 mg çözülür (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (TPY) 2 -maleimid, 0.975 umol, 6 eşdeğer) ihtiva eden bir 600 ul.
Not: kullanılan maleimid suda çözünür ise, su yerine asetonitril içinde bir stok çözeltisi hazırlanır. maleimid reaksiyon tamponu çözünür olması çok önemlidir. Dimetilsülfoksid, N, N-dimetilformamid ve asetonitril tüm yaygın düşük moleküler ağırlık 12, genellikle hidrofobik maleimid reaktiflerin çözünmesine yardımcı olmak için yardımcı maddeler kullanılmaktadır. - 20 mM'ye seyreltilmiş EDTA çözünene kadar, tipik olarak (birkaç gram katı sodyum hidroksit ilave pH 7 olan 100 mM fosfat tamponu ve 100 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA, Mw = 292,24 g / mol) ihtiva eden bir tampon çözeltisi hazırlayın ) ile pH 7'ye ayarlanır.
- (286,65 g / Mol w = TCEP 15, m), aşırı saf su, 1 ml bir 10 mM stok çözelti hazırlamak için tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür 2.87 mg çözülür. Bu adım ithalatAnt protein sistein tam 15 bağlanması maleimide önceden indirgenmiş olduğundan emin olmak için.
Not: bu madde, sulu çözelti içinde oksidatif deaktivasyon duyarlı olduğu TCEP stok çözeltisi, her bir reaksiyon için, taze hazırlanmalıdır. - 50 ml'lik plastik bir tüp içinde 100 mM fosfat / EDTA stok çözeltisi 3 ml ultra saf su 11,4 ml birleştirin. Protein ve maleimid çözeltisi ile, daha da seyreltildi zaman tampon konsantrasyonunun 20 mM olacak.
Not: etiketlendikten protein, bir trans membran proteini olup, uygun bir deterjan proteini çözünür hale getirmek için tampona eklenir sağlamak. bir deterjan kullanılmazsa zar proteini yavaş olumsuz reaksiyon verimlerini etki edecek ve, hızlandırabilir. Sonraki tüm saflaştırma aşamaları deterjan kullanın. - Fosfat-EDTA tampon maddesi ile arıtılmış, Cyt c 0.15 umol (50 uM çözelti 3 ml, 1 eşdeğer) eklenir.
- TCEP stok SOLUT 7.5 ul ekleyinprotein çözeltisi iyon (0.075 umol, 0.5 eşdeğer) ve sistein oksidasyon nedeniyle dimerize olabilir herhangi bir protein azaltmak için 5 dakika boyunca karıştırıldıktan bırakın.
Not: İlgili protein kolayca dimerize yoksa TCEP katmayın. indirgeyici olmayan koşullar altında, bir protein jeli çalıştırarak kontrol edin. - 24 saat süre ile, oda sıcaklığında, karanlıkta, Ru (II) (TPY) Cyt c düşük tamponlu solüsyona 2 -maleimid asetonitril çözeltisi 600 ul ekleyin ve reaksiyon karışımı, karıştırma bırakın.
- 3.5 kDa MWCO döndürme filtreleri kullanarak reaksiyon karışımının, 3000 xg'de santrifüj süzüntü berrak bitene kadar taze 20 mM fosfat tamponu ile 2-3 kez tekrar konsantre. arıtılmadan bir sonraki aşamada önce mümkün olduğu reaksiyon karışımından kadar tepkimemiş maleimid çıkarın.
Not: Bu noktada ham bioconjugation Karışım, karanlıkta, buzdolabında saklanabilir. Centr ile reaksiyona girmeyen maleimid boya kaldırmak için önemlidirdepolamadan önce diyaliz ifuge maleimid yavaş olması ve spesifik olmayan protein yüzeyi üzerinde lizin kalıntıları ile reaksiyona girebilir.
Sitokrom c Bioconjugatlar 3. saflaştırılması
- 20 mM NaH 2 PO 4 ve 0.5 M NaCl içeren bir tampon çözeltisi hazırlamak için, sodyum dihidrojen fosfat 2.4 g ve ultra saf su, 1 L sodyum klorür 29.22 g çözündürülür. Bu hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi (IMAC) saflaştırma için çalışan tampondur.
- Imidazol 17 g (ağırlık M = 68,077 g mol-1), 20 mM NaH 2 PO 4 ve 0.5 M NaCl tampon 500 ml içinde çözülür. Bu IMAC arıtma için elüsyon tamponu olduğunu.
- 1 M NaOH veya HCI kullanılarak pH 7'ye Her iki tampon maddesi pH ayarlama, ve FPLC kullanılmadan önce 0.22 um rejenere selüloz membranlar yoluyla filtre.
- Satın alınan IMAC sütun col yüklenen herhangi bir metal iyonları olmadan sevk edilir olarakUMN, ultra saf su 3 ultra saf su ml, 100 mM nikel asetat çözeltisi, 3 ml ve 6 ml ile yıkanması ile Ni2 + merkezli saflaştırılması için kolon hazırlanmıştır. Kolon hemen kullanılmak üzere değilse% 20 3 ml etanol ile yıkama ve bakteri büyümesini engellemek üzere buzdolabı içinde sütun saklayın.
- Bir Ni 2+ enjeksiyon döngü ve UV-Vis dedektör arasındaki FPLC 1 ml IMAC sütunu -yüklü takın.
- 20 mM fosfat, 3 kolon hacminde, 0.5 ml / dakika bir akış oranı ile 0.5 M NaCl tampon madde ile sütundan dengelenmesi.
- Yük Ni2 + IMAC kolonu (0.22 um'lik bir şırınga filtreden filtre) ham tepkime karışımından 100 ul. Rutenyum bisterpyridine-sitokrom C biokonjugatlannı elüte etmek için 125 mM 3 üzerinde sütun hacim 0 ilâ bir imidazol gradyanı, ardından reaksiyona girmemiş Cyt c elüt edilmesi için çalışan tampon, 3 kolon hacminde ile kolon yıkaması (Ru (II) '-cyt c) .
- C yıkamaTüm ham Bioconjugate saflaştırılmıştır kadar olumn 5 kolon hacmi için 250 mM imidazol tampon maddesi ile, daha sonra 20 mM fosfat, 0.5 M NaCl ve adımı tekrar 3.7 ile kolon yeniden dengeye.
- Bioconjugate kesirler havuzu ve 3.000 x g santrifüj, 3.5 kDa MWCO döndürme filtresi kullanarak konsantre.
- 3.5 kDa MWCO diyaliz kasetleri içine konsantre biokonjugatlannı yükleyin ve su 2 değişikliklerle, ultra saf su bir gecede karşı dialyze.
- Izo-1 sitokrom c ile aynı molar absorptivitesi değerini kullanarak, UV-Vis saf, konsantre edildi Bioconjugate çözeltisinin konsantrasyonu belirlemek (97.6 mm-1 cm-1) 410 nm'de. 100 mcM - Tipik olarak, Bioconjugate konsantrasyonu 50 mertebesinde olduğunu.
- 25 ul kısma biokonjugatlannı bölün ve ihtiyaç duyulan kadar -20 ° C'de dondurulmuş tutun.
Sitokrom c Bioconjugatlar 4. Karakterizasyonu
- caydırmak-TOF MS tarafından Bioconjugate kütlesinin ermesi
- bir asetonitril / su / trifloroasetik asit çözeltisi, 1 ml kafeik asit, 10 mg çözülür (80: 20: 0.1, v / v / v).
- kafeik asit çözeltisi 5 ul derişik protein çözeltisi 5 ul seyreltilir.
- Nokta 0.5 MALDI hedef plaka üzerine kafeik asit çözeltisi ul ve çözüm kurumasını bekleyin.
- Nokta 0.5 Bu kafeik asit yerinde üstündeki numune / matris çözümü ul, spot kurumasını bekleyin. "Sandviç" matris katmanları arasındaki numunenin bu üstündeki numune matris başka 0.5 ul nokta ve kurumasını bekleyin.
- Proteinlerin 16 için uygun olan alet ayarları kullanılarak lineer şekilde kütle spektrumları elde edin.
- Jel elektroforezi ile biyokonjugatlar incelenmesi
- Her protein örneğinin 10 ul önceden karıştırılmış lityum dodesil sülfat (LDS, pH 8.4) tamponu (4x) t ile protein örneklerinin seyreltilmesi tarafından çalıştırılacak hazırlayıned oyuk başına yaklaşık 20 ug nihai konsantrasyon. indirgeyici koşullar gerektiren kuyuları, 500 mM ditiyotreitol (DTT) madde (10x) azaltmak için 1 ul ekle.
- 10 dakika boyunca 70 ° C'de ısı örnekleri.
- Jel Yürütme tamponu hazırlamak için önceden karıştırılmış, 50 ml, 1 M MES, 1 M Tris baz,% 2 SDS, 20 mM EDTA (pH 7.7), ultra saf su 950 ml ticari bir kaynaktan tampon karışımı (20x) çalıştıran ekleyin.
- jelden plastik tarak çıkarın ve jel çalışan tankında jel yerleştirin. Kuyular tamponu ile kaplıdır, böylece jel çalışan tampon tankı doldurun.
- Numuneleri dikkatli bir şekilde prefabrik% 12 Bis-Tris üzerine, 1 mm boyunda, pipet uçları kullanılarak 10 oyuklu jel yükleme yardımcı olmak için. analiz yardım etmek için jel orta kuyuya prestained 10 protein moleküler ağırlık markerine (3-188 kDa) yükleyin.
- 35 dakika için 200 V sabit gerilimde jel üzerinde çalıştırıldı.
- 2 saat süre ile, ticari bir Coomassie mavisi solüsyonu ile jel leke ve ultrap yıkayın48 saat boyunca ure su.
- UV-Vis spektroskopisi yoluyla Bioconjugate saflık tayini
- Ru (II) (TPY) 2 -maleimid, izo-1 Cyt C ve Ru (II) '-cyt Cı 5 uM çözeltilerinin 120 ul hazırlayın.
- 250 nm 650 nm, tek ultra saf su içeren kuvars küvette bazal spektrumunu ölçün.
- Küvet durulandı ve her bir ölçüm arasında kurutulur sağlanması her bir bileşenin spektrumunu ölçün.
- Dalga boyunun bir fonksiyonu olarak her bir bileşenin absorbans Konu ve 1 belirlemek için nihai ürün ile başlangıç malzemelerinin lineer bir miktar karşılaştırın Ru (II), (TPY) Cyt c 2 -maleimid 1 oranında reaksiyona.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biyokonjugatlar sentezi, üç ana yöntem ile teyit edilir: flight kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS), poliakrilamid jel elektroforezi Matris destekli lazer dezorpsiyon iyonizasyon süresi ve ultraviyole-Görünür (UV-Vis) spektroskopisi, Şekil 2'de gösterildiği gibi, 3, 4. Ekteki küçük molekülün kütlesine karşılık gelen bir kütle artışı, ve reaksiyona girmemiş protein eksikliği Ru (II), başarılı bir şekilde kovalent bir bağ (TPY) Cyt c ve Bioconjugate sonraki saflaştırma 2 -maleimid gösterir. Bioconjugate bileşimi anlaşılabilir başlangıç malzemelerinin 1 ilaveli spektrumu: Bioconjugate UV-Vis spektrumu verimi 410 nm'de ve tahmin edilen 1 ila spektrumunun absorbans hesaplanmıştır sağlar. Yukarıdaki örnekte, verim FPLC arıtma için sonra% 15-27 arasında genel olarak toplu-parti farklılık gösterir, ancaktion 15.
Buna ek olarak, saflaştırma sırasında kromatogramda yeni tepe görünümü yeni bir türün sentezini teyit etmektedir. Bu, farklı UV-Vis izlerinin analiz türleri Ru (II) (TPY) 2 -maleimid bileşeni içerip içermediği gösterebilir Şekil 5'te örneklenmektedir.
Şekil 2. Proteinlerin MALDI-TOF kütle spektrumu. Saf izo-1 sitokrom c (siyah) ve Ru (II) -cyt C (kırmızı) kütle spektrumları. Tepeler 179 Da görünür bir kafeik asit katılma ürünü ile izo-1 Cyt c (12.706 Da), ve Ru (II) -cyt C (13,559 Da), hesaplanan kitlelere uygun görülmektedir. Bu adükt tepkimemiş Cyt C s yüksek miktarlarda görülürbağlı kafeik asit α, β-doymamış karbonil ve yüksek enerjili MALDI koşulları altında proteinin serbest tiol arasında bir reaksiyona pectra. Matris adüktleri yaygın MALDI-MS görülür ve kovalent ve doğada kovalent olmayan her ikisi de olabilir. Spectra temel düzeltilmiş, gürültü süzüldü ve karşılaştırma için normalize edilirler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. SDS-PAGE Proteinleri. Indirgenir ve indirgenmemiş Cyt c ve Ru (II) '-cyt C% 12 Bis-Tris jeli. Şerit 3 Her bant (kDa) sağında açıklamalı polipeptit kütleye sahip bir ön-lekeli protein standardı içerir. Daha büyük bir versio görmek için buraya tıklayınızBu rakamın n.
Şekil 4. UV-Vis Proteinlerin Spektrumu: Ru absorbans spektrumu (II) -cyt C (yeşil), saf, reaksiyona girmemiş Cyt c (kırmızı) ve reaksiyona girmemiş Ru doğrusal olarak (mavi kesik) yakından da (II) ( tpy) 2 -maleimid (siyah). Bu Bioconjugate 1 oluştuğunu göstermektedir. Proteine maleimid 1 eki bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Biyokonjugatlar Ni-IMAC arıtma Şekil 5. kromatogramı: Ru (II) -cyt c saflaştırılması IMAC iz. UV-Vis izleri: cy Soret bandına tekabül nm 410cyt c ve Ru (II) rutenyum (II) kompleksinin metal-ligand yük transfer bandına tekabül nm (tpy) 2 -maleimid ve 475 hem karşılık nm t c, 280. Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir bioconjugation önce başlangıç malzemelerinin saflaştırılması büyük önem taşımaktadır. Ticari rekombinan kaynaklardan elde edilen proteinler, sıklıkla farklı yüzey kimya ve reaktiviteye sahip, ilgilenilen protein, diğer izoformları içerir. Örneğin, tarif edilen bioconjugation olarak, ticari olarak temin edilebilir Cyt Cı iki izo-1 ve izo-2 Cyt C 12,14,17 oluşan bir karışımı içerir. İzo-2 ve izo-1 sitokrom c formları temel fark, izo-1 sitokrom c C-terminali yakınındaki bir serbest sistein kalıntısının varlığı olmak homolog ölçüde bulunmaktadır. Buradaki örnekte, saflaştırma güçlü bir sulu ile elde edilir katyon-değiştirme FPLC, ancak, bu anyon değişimi, afinite, hidrofobik ya da boyut-dışlama kromatografisi gibi FPLC diğer formları daha uygun olabilir. Protein aynı zamanda ilgili protein ile ilgili sistein artık (burada sitokrom c) fu olduğundan emin olmak için bu basamakta azalırlly maleimid-bağlanmış hedef bioconjugation önce indirgenmiş. Buna ek olarak, maleimid ekli küçük moleküllü protein ihtiva eden bir sistein saf ve maleimid depolama bir reaksiyon görmemiş olduğu kullanılacak ise maleimidler, ışık ve ısıya duyarlı olarak, tespit etmek için yararlıdır. Dokunulmamış maleimid vinil protonlar 6-6.5 ppm'de tekli olarak görünür şekilde bu hızlı ve kolay bir yukarı alana kayacak açık maleimid proton ise, 1H NMR ile kontrol edilebilir; ve açık maleimid halka ile de kütle spektrometrisi, 18 Da kütle artışına karşılık gelir.
Tampon seçimi, pH ve deterjanlar, organik çözücüler gibi adjuvan eklenmesi ve indirgeyici ajanlar bioconjugation verimleri 5,15 üzerinde büyük bir etkiye sahip olacaktır. Bir maleimid ve bir tiol bir Michael ekleme durumunda, pH değeri meydana için hızlı, belirli bir reaksiyon için 6 yapılmamış 8 düşük olması gerekir. pH 6'nın altında, özgüllüğünün kadar yüksektirmaleimid bir aminlerle reaksiyona mümkün değildir, ancak tiol protonlanmış olduğu ve bu nedenle yavaş reaksiyona gelen Michael eklenmesi için kötü bir nükleofildir. pH 8'in üzerinde, yüzey lisin tortuları deprotone olabilir ve proteine maleimid bileşenin spesifik olmayan bir kovalent eklenmesi yol mevcuttur maleimidleri ile reaksiyona girmektedir. Bu pH aralığında güçlü tampondur ve reaktiflerin bir etkileşim nedeniyle Fosfat tamponu Bu bioconjugation kullanılır. Tris (hidroksimetil) aminometan (TRIS) tamponu, örneğin, potansiyel olarak düşük verimlere yol açacak maleimid ile reaksiyona olabilir, bu tampon içinde bir amin grubu gibi kötü bir seçim olacaktır. Tüm bileşenlerin çözünürlükleri, aynı zamanda, yüksek verim için bir anahtardır. Küçük miktarlarda eklenmesi (<% 10 h / h) doğru pH ve tuz konsantrasyonu, çözelti içinde proteinleri tutmak için gerekli olan ve 12 katlanmış iken, polar olmayan bileşenlerin çözünmesine yardımcı organik çözücü. büyük membran protein, içinNS önemli hidrofobik yüzey kalıntıları ile, bir yüzey aktif 18 çökeltme proteini önlemek için gerekli olacaktır.
Bioconjugation protein oksidasyon ve dimerizasyonu eğilimli, bu tür TCEP gibi bir indirgeme maddesinin eklenmesi bioconjugation verim 15 geliştirmek için gösterilmiştir. Monomerik, serbest tiol biçiminde protein in situ indirgenmesi ile aktif tiyol sitelerinin daha büyük bir oranı maleimid ile erişilmesine izin verir. Bununla birlikte, toplama ve stokiyometri sırası da maleimid ile reaksiyona girecek TCEP olarak elde başarılı bir artış önemlidir. TCEP sonra maleimid ekleyerek, TCEP ilk protein azaltarak tüketilen edilecektir. Bu aşırı TCEP bilgilerini maleimid ile olumsuz reaksiyona mevcut değildir, böylece protein TCEP yarısı eşdeğer, aynı nedenle kullanılır. proteinin iç yapısal disülfit köprüleri TCEP eklenerek etkilenme olasılığı değildirörneğin DTT gibi diğer indirgeme maddeleri, protein, yüksek sıcaklık veya üre yüksek konsantrasyonu olarak denatüre edici koşullar altında gerçekleştirilen kaydıyla. Örneğin, DTT çok fazla bir miktarına ilave saflaştırma işleminden sonra geri kazanılan protein miktarı üzerinde önemli bir etkiye sahip değildir önce FPLC saflaştırma Cı Cyt için. TCEP yapısal sistein köprülerin indirgenmesi şüphelenilen, bu nativ, denatüre edici olmayan koşullar altında bir protein jeli yürütülerek doğrulanabilir.
Bu yöntemde sentezlendi Ru (ll) bisterpyridine etiketli sitokrom C Ni2 + Hareketsizleştirilmiş Metal Eğilim Kromatografi 14 ile saflaştırılır. Diğer saflaştırma yöntemleri, bir antikor durağan faz olarak, boyut dışlama kromatografisi, anyon / katyon değiştirme kromatografi ve spesifik afinite kromatografisi gibi, mevcuttur. Genel olarak, yöntem, konsantrasyonu ve diyaliz adımları izlemeye ile yukarıda tarif edildiği gibi aynı kalırg kromatografik saflaştırma depolama için müsait bir tampon Bioconjugate ürünü geri dönün.
Bir bioconjugation başarılı olup olmadığını belirlerken birincil yöntem, MALDI-TOF MS aracılığı ile bir. Bu kovalent küçük bir molekülün, bir fark genellikle en az 1000 Da ile etiketlenmiş, doğal proteinin, protein arasındaki kütle küçük bir farklılık tespit etmek için en doğru bir yöntemdir. Bir -TOF MS deneyi çalışan en zor kısmı matris seçimi ve teknik lekelenme olduğu; Bununla birlikte, kafeik asit, bu çalışmada kullanılan proteinlere ve biyokonjugatlar analizi için güvenilir, çok amaçlı bir matris olduğu tespit edilmiştir. potansiyel bir seçenek olarak, sinapinik asit proteinlerinin analizi için yaygın olarak kullanılan başka MALDI matristir. MALDI-TOF MS verileri analizi nispeten basittir. 2 hem saf izo-1 Cyt c tipik MALDI-TOF MS spektrumunu göstermektedir ve saf Ru (ll) -cyt C (M (M = 12.706 Da W)yakın hesaplanan molekül kütlesine karşılık her ikisi de = 13,559 Da), a. Saflık, reaksiyona girmemiş spektrumda bir izo-2 sitokrom C tepe eksikliği (ağırlık M = 12.532 Da) ve Bioconjugate spektrumda bir izo-1 sitokrom C tepe başarısızlık gibi durumları kaydetmeye, gözlemlenebilir. Bioconjugate kütlesi de, 3% 12 Bis-Tris protein jel Şekil. Jel elektroforezi kullanılarak tahmin bioconjugation delil iki adet sağlar edilebilir. İlk olarak, Ru (II) için, indirgeyici olmayan koşullar altında bir dimer bandının olmayışı -cyt Cı artık serbest sistein olduğunu göstermektedir, ve ikinci olarak, Bioconjugate bandının küçük bir vites değiştirme yukarı doğru molekül ağırlığında bir artış anlamına gelir. Protein jelleri çok değerli ve kesin küçük molekül ekleri için değil, aynı zamanda protein dimerleri 5 veya protein-polimer biyokonjugatlar 9 sentezi için değil sadece başarılı bioconjugation kanıtı sağlayabilir.
proteinler içinBu yeşil fluoresan protein ya da hem içeren sitokromlar, UV-Vis spektroskopisi gibi ihtiva kromoforlar Bioconjugate bileşimini ve verimi belirlemek için kullanılır. 1: Şekil 4'te gösterildiği gibi, başlangıç malzemeleri spektrumları 1 doğrusal olarak, Bioconjugate varsayımsal bir UV-Vis spektrumu inşasına olanak sağlar, bu 1 gerçek Bioconjugate spektrumunun. 1 ilaveli spektrumu bileşim, türetilmiş olabilir . Örneğin, iki veya daha fazla Ru (II), (TPY) 2 -maleimides spesifik olmayan protein bağlı olsaydı, Bioconjugate 480 nm bant tahmin spektrum daha yüksek olacaktır. Buna ek olarak Bioconjugate konsantrasyonu 97.6 cm -1 mM -1 410 nm molar absorptivite değeri kullanılarak yaklaşık olarak hesaplanabilir. Bu Ru (II) (TPY) 2 -maleimid bu bölgede az absorbansa sahiptir, çünkü Bioconjugate aynı olduğu varsayılır.
Bu Tha unutulmamalıdırsistein-maleimid kimyası yoluyla t bioconjugation çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, ilgilenilen proteinin tek erişilebilir sistein kalıntısı veya protein mühendisliği, bir tanıtmak için gerçekleştirilmelidir olmalıdır. İkinci olarak, sistein maleimid bağı plazma uygulama 19 bağlamında albümin ve glutatiyon gibi diğer serbest tioller, değiş tokuş karşı hassastır. Bu gibi kuru proteinin yüzeyi çözücü erişilebilirlik ve yerel şarj son derece bağlıdır. Maleimid tiol bağlantılar de plazma uygulamalar için uygun olabilir, ancak, uzun süreli stabilite kütle spektrometrisi ve jel elektroforezi kullanılarak kontrol edilmelidir.
Buna rağmen, bu sistein maleimid kimya yoluyla proteinlere floresan boyalar, redoks merkezleri, polimerler ve diğer proteinler gibi yeni moleküller oldukça özel ve yüksek verimli ek bir olduğu ilginç bir makro moleküler yapıların bir dizi sağlayan güçlü bir tekniktirerişilemeyen. kimyasal olarak iyi tanımlanmış bir protein biyokonjugatlar büyük miktarlarda sahip bağlayıcı proteinin, kendini düzenlemesi, enzim kinetiği ve protein lokalizasyonu içeren gelecek çalışmalara bir anahtardır. Malzeme arıtma, reaksiyon ortamının seçimi, ve indirgeyici ajanlar gibi ek reaktifler ilave başlayarak Yukarıda gösterildiği veya yüzey aktif maddeler gibi, tüm bioconjugation verimi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Saflaştırma en kolay proteini uyumlu kromatografisi ile elde edilmektedir, ve karakterizasyonu, MALDI-TOF MS, jel elektroforezi bir kombinasyonu kullanılarak elde edilir ve UV-Vis spektroskopisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Elsevier: Oxford. (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
