Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

جيل من كبد الفأر أنسنة طريق كبد الإنسان خلايا الجذعية

Published: August 29, 2016 doi: 10.3791/54167
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 1
1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital
* These authors contributed equally

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية للحماية الحيوان من جامعة مدينة يوكوهاما.

1. توليد نموذج الحاد الكبد إصابة ماوس

  1. إضافة 1 مل من phenolized حل كلوريد الصوديوم 0.85٪ (0.6 غرام الفينول في 100 مل من 0.85٪ من محلول كلوريد الصوديوم) إلى 1 ملغ ذيفان الخناق (DT) لجعل 1 ملغ / مل DT حل الأسهم. ملاحظة: DT بتركيز 1 ملغ / مل ويمكن تخزين ما يقرب من 2 سنوات في 3 ° C إلى 8 درجات مئوية.
  2. متسلسل تمييع الحل 1 ملغ / مل الأسهم DT إلى 0.3 ميكروغرام / مل DT في phenolized 0.85٪ محلول كلوريد الصوديوم وإعداد قسامة من 0.3 ميكروغرام / مل من محلول DT كحل العمل. ملاحظة: هذا الحل العمل يجب الطازجة.
  3. لإجراء التجارب باستخدام جرعة دون المميتة (~ 50٪ الفتك)، إدارة الفئران من العمر 8 أسابيع 1.5 ميكروغرام / كغ جرعة من DT.
    1. إجراء حقن داخل الصفاق من DT من خلال عقد الماوس في الاستلقاء على ظهري وإدراج needlه تحت منحنى الركبتين، إلى اليمين أو اليسار من خط الوسط. تجنب خط الوسط لمنع تغلغل المثانة. زاوية الإبرة في ما يقرب من 45 درجة الى الجسم.
    2. باستخدام حقنة الأنسولين، حقن الفئران مع 100 ميكرولتر من الطازجة 0.3 ميكروغرام / مل DT في 20 غرام من وزن الفأر. على سبيل المثال، يجب أن يحتوي على 18 غرام الماوس يتلقى 90 ميكرولتر من / مل من محلول DT 0.3 ميكروغرام.
  4. في 48 ساعة حقن آخر DT، وجمع الدم من الوريد الذيل عن طريق وضع الماوس في رادع وارتفاع درجة حرارة ذيل الماوس في 37 ° C حمام الماء لحوالي 10 دقيقة لتمدد الأوعية الدموية. ثم، وجعل 1 ملم نيك في سم الذيل 2 من طرف بشفرة مشرط حاد وجمع الدم مع أنبوب microcapillary.
    1. أجهزة الطرد المركزي أنبوب microcapillary التي تحتوي على الدم في 1500 x ج لمدة 5 دقائق وجمع الدم عن طريق فصل طاف والخلايا بيليه.
  5. ماصة 50 ميكرولتر من 1:20 مصل الفأر المخفف على GOT / AST-PIII الشرائح. قياس الامتصاصية للناتج التفاعل (صبغة زرقاء) في 650 نانومتر باستخدام متعددة الأغراض التلقائي محلل الجاف الكيمياء وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: قراءة من الألانين اسبارتاتي (AST) / يتم عرض الجلوتاميك ناقلة oxaloacetic (GOT) النشاط تلقائيا. 2 آخر أيام DT حقن، ما يقرب من 60٪ من الفئران أظهرت القيم AST بين 12،000 - 16،000 وحدة دولية / لتر واعتبرت أنه يعاني من تلف الكبد الحاد. تم نقل هذه الفئران إلى قفص جديد وتستخدم كمتلقين زرع الخلايا.

2. إعداد الخلايا الجذعية كبدي الإنسان

  1. عزل الخلايا الجذعية الكبدية الإنسان من خلايا الجنين الإنسان الأساسية الكبد مع فارز الخلية باستخدام المضادات خلية CDCP1، CD90، CD66 والحصول على جزء من السكان CDCP1 + CD90 + CD66-، ثم البذور السكان خلية معزولة على أطباق ثقافة الكولاجين الرابع المغلفة، كما ذكرت سابقا 15. استخدام الخلايا الجنينية الأولية الإنسان الكبد من الخلايا الجنينيةالعمر بين الأسابيع 14 و 18.
  2. جمع الخلايا الجذعية الكبدية البشرية المستزرعة إلى 80٪ - 90٪ التقاء على أطباق ثقافة 100 ملم، ونضح مستنبت، وغسل الخلايا مع 10 مل PBS، ثم قم بإزالة برنامج تلفزيوني. يعرض للتريبسين الخلايا مع 2 مل 0.05٪ حل التربسين / EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: خلايا في أكثر من 90٪ التقاء ليست مناسبة لزرع الخلايا منذ تمايز الخلايا قد تؤثر على القدرة التكاثري في الفئران.
  3. رصد حالة تشتت الخلايا تحت المجهر. عندما تظهر الخلايا لتكون عائمة أو تتدفق بحرية، ووقف عملية الهضم الأنزيمي بإضافة 8 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS.
  4. تعليق الخلايا ببطء باستخدام ماصة المصلية 10 مل ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 100 x ج و 4 درجات مئوية.
  5. بعناية resuspend الكرية خلية في 10 مل DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS وتحديد أعداد الخلايا باستخدام غرفة المجهر الفرز.
  6. تقسيم الخلايا إلى 1.0 × 10 6 خلايا في 50 ميكرولتر من قسامات برنامج تلفزيوني عن كل فأر الفردية وتخزينها على الجليد حتى الزرع.

3. داخل الطحال زرع الخلايا الجذعية كبدي الإنسان

  1. ضع قفص نظيف على 37 درجة مئوية وسادة التدفئة الكهربائية.
  2. تخدير الماوس باستخدام الأيزوفلورين استنشاق (1-1،5٪ (المجلد / المجلد) في 2 لتر من الأكسجين لكل دقيقة) عن طريق وضعها تحت فوهة. بدلا من ذلك، استخدام أنابيب تحتوي على الشاش غارقة مع isoflurane.
    1. تأكد من أن الفأر هو تخدير عن طريق معسر طفيفة قاطع الطريق الخلفي. إذا تم استخلاصها النطر الركبة، ضع الماوس مرة أخرى في الغرفة. استخدام البيطري مرهم على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  3. حلق موقع الجراحة باستخدام كليبرز الكهربائية وتطبيق 70٪ (المجلد / المجلد) الايثانول وبوفيدون اليود لتعقيم. ثم جعل شق الجلد 1 سم في الجهة اليسرى أسفل الحدود الساحلية من أضلاعه، تليها شق علىجدار البطن، وكذلك الصفاق.
  4. بعناية فضح الطحال. استخدام حقنة حقن مكروي 100 ميكرولتر مع 32-G 1/2 بوصة إبرة لحقن مباشر 1.0 × 10 6 خلايا الجذعية الكبدية الإنسان في 50 ميكرولتر PBS في الطحال من كل فأر. إمالة الإبرة بزاوية 5 درجات للحقن.
    1. تأكد من أن عمق حقن أقل من نصف سمك الطحال. الإبرة لا بد أن يدخل الطحال في نهاية واحدة (الرأس) وإيداع الخلايا في الطرف الآخر (الذيل).
  5. لمنع تسرب الخلايا بعد الحقن، وتطبيق الضغط بلطف باستخدام الإصبع لمدة 2 دقيقة ثم قم بإزالة الإبرة.
  6. وضع الطحال مرة أخرى في جسم الفأر وإغلاق تجويف مع خياطة تشغيل طبيعية للعضلات والجلد.
  7. نقل الفئران إلى 37 درجة مئوية القفص قبل تحسنت مباشرة بعد الزرع. لضمان الماوس غير قادرة على التنفس بشكل مريح، ضع الماوس على جانبها في القفص، ليفرغ الاتصال بين الفراش القفص وموقع الجراحة.
  8. مراقبة الفئران حتى ترتدي التخدير خارج لضمان بقاء الغرز مغلقة والفئران تعود إلى ما قبل الجراحة الظروف.
  9. ضمان الفئران وتقدم مع مياه الشرب العادية والغذاء. بعد 1 ساعة، والعودة القفص إلى غرفة الماوس المركز الحيوانية ومراقبة الفئران يوميا.

4. الكشف عن زرع كبد الإنسان الجذعية خلايا الكبد المستمدة الخلايا في الكبد ماوس

ملاحظة: للحصول على الإجراءات التالية، الموت ببطء كل ​​الحيوانات باستخدام جرعة زائدة من الكيتامين وزيلازين تليها خلع عنق الرحم.

  1. في 4-6 أسابيع الرد على زرع، الموت ببطء الفئران وفتح تجويف البطن عن طريق خفض في وقت واحد ترهل والعريضة باستخدام مقص جراحي.
  2. تشريح النسيج الضام فوق الغشاء البريتوني، وذلك باستخدام مقص بمثابة رش، وقطع الصفاق على طول الخط ألبا لفتح البريتونيتجويف.
  3. رفع القص مع ملقط، ثقب الحجاب الحاجز، وقطع طريق جانبي القص حتى من خلال حزام عنق الرحم.
  4. قطع الوريد الأجوف على الجانب الصدري من الكبد وسحب المريء من خلال الكبد في الاتجاه الأمامي. إزالة الحجاب الحاجز من أجل إزالة الكبد.
    ملاحظة: كن حذرا للحفاظ على أشارت نصائح من مقص أعلى من أجل منع أي ضرر لأجهزة الصدري تحتها. الغدة الصعترية لديه ميل إلى التشبث في بعض الأحيان إلى الجانب الظهري من القص وهذا يجب تجنب بعناية.
  5. استخدام الحجاب الحاجز كمقبض، بدء سحب الكبد من تجويف البطن. سيتم الوريد الأجوف الداخلية تحتجز الكبد في المكان. قطع الوريد الأجوف الداخلية. يجب الحرص على عدم تحرير قبل الأوان الكظرية اليمنى.
    ملاحظة: الفئران لديها الكبد أربعة فصوص يتألف من الفص المتوسط، الفص الأيسر، الفص الأيمن، والفص المذنب. وعلقت المرارة في التشعب صغيرة منالفص المتوسط.
  6. فصل الفصوص عن بعضها البعض في التقاطعات وتضمينها في الأمثل مجمع درجة حرارة القطع (أكتوبر) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تجميد أكتوبر تحتوي على أنسجة الكبد في شبكات معدنية على ناظم البرد.
  7. قطع عينة أقسام 5 ميكرون سميكة باستخدام ناظم البرد في -18 درجة مئوية، وجبل لهم على شرائح المجهر RT. تخزين المخزون في -80 درجة مئوية. إعداد الشرائح لمدة الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E)، وتلطيخ المناعي وفقا للإجراءات ذكرت سابقا 16.

5. الكشف عن الزلال إفراز الإنسان وحساب معدل همي

  1. لقياس إعادة الكبد الإنسان، نفذ الإنسان الزلال ELISA باستخدام المصل والزلال عدة ELISA الإنسان وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. حساب معدل خيالية الكبد أنسنة بواسطة الوقت الحقيقي تحليل PCR من مستويات التعبير في الكبد كامل أنسنة. تحديد السابق النسبينسبة مستوى الضغط ومن الأكتين الإنسان محددة لالبشري الفأر عبر الأكتين (نسبة 1) ونسبة من الأكتين الفأر محددة لالبشري الفأر عبر الأكتين (نسبة 2). يتم حساب معدل خيالية كما نسبة 1 / (نسبة 1 + نسبة 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الرداء-TRECK / خلايا الكبد الفئران SCID تعبر عن وDT مستقبلات HB-EGF الجينات البشرية تحت سيطرة المروج الزلال ويحمل آثار السامة للخلايا التالية إدارة DT 12. لتقييم آثار العلاج DT على اصابة الكبد، تم حقن جرعات DT 1.5 ميكروغرام / كغ في عمره 8 أسابيع الرداء-TRECK / الفئران SCID والتغيرات المرضية في آخر ساعة إدارة DT الكبد 48 تم تقييمها تشريحيا. مقارنة مع السيطرة على الفئران (لا تعامل مع DT)، أظهرت أن الفئران التي عولجت DT-بنية الكبدية غير منظمة مما يدل على التصحيح لاحتقان مع زيادة النشاط AST في مصل الدم. وبالإضافة إلى ذلك، كانت خلايا الكبد من الفئران التي عولجت DT-متعددة، ملطخة بشدة الادراج السيتوبلازمية الحمضة مع نوى الظلام (على الأرجح خلايا الكبد أفكارك)؛ بعض خلايا الكبد أخرى بدا الحفاظ أو عرضت على ظهور تجاويف في السيتوبلازم مع نوى مظلمة مع ضئيلة أو معدومة التهاب الوريد البابي (الشكل 1 12.

HpSCs الإنسان يمكن استخدامها على المدى الطويل في زراعة المختبر وتظهر مورفولوجيا الخلايا موحد مع بعض ALB وعدد أقل من خلايا CK19 إيجابية. في مشاركة 6 أسابيع زرع في الكبد الماوس، تعرضوا للHpSCs الإنسان للفحص الأساسي تحت المجهر وتقييمها تشريحيا. وقد لوحظت HpSCs الإنسان أن إعادة تشكيل هيكل الكبد عن طريق استبدال خلايا الكبد الماوس الأصلية (الشكل 2). ظاهريا، في 4 أيام الرد على زرع HpSC البشري، مجموعات الكبدية البشرية الصغيرة التي وزعت بشكل موحد في جميع أنحاء الكبد والكشف. في 45 يوما بعد زراعة الأعضاء، وهذه قد انتشرت في مجموعات كبيرة (الشكل 3). من الذى وقد تم تعيين كبد لو الماوس تشكيلها مع خلايا الكبد البشرية "كبد أنسنة". وتشير هذه النتائج أن الفئران مع قاتلة فشل كبدي مداهم التي تخضع لزرع HpSC البشري قد يحمل الهياكل الكبد مشابهة لتلك التي لوحظت في كبد الفأر العادي.

قبل الاختبار ما إذا كانت خلايا الكبد البشرية غير الناضجة المزروعة في الفئران كانت إمكانية التمايز، ويمكن أن تعمل في الجسم الحي، وجود خلايا الكبد الإنسان في كبد الفأر وأكد لأول مرة عن طريق التحليل المناعى في حوالي 6 أسابيع زرع HpSC آخر البشري. بأجزاء من الكبد من الفئران مع 60٪ إعادة تعمير الخلايا البشرية التي على وجه التحديد وبشكل إيجابي المشارك ملطخة نوى الإنسان وcytokeratin البشري 18/8 تم العثور على (CK8 / 18) الأجسام المضادة لاحتواء المانحة المشتقة من الخلايا خلايا الكبد البشرية، في حين كانت كبد الفئران التحكم الأصلي السلبي لهذه العلامات (الشكل 4).

الحمار = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> لتقييم درجة تمايز الخلايا في الجسم الحي، وجرى تقييم التعبير عن الألبومين البشري (ALB) وcytokeratin البشري 19 (CK19) immunohistochemically. والإنسان خلايا الكبد البشرية المستمدة HpSC-التفريق جيدا في كبد الفأر وعرضت upregulated التعبير ALB البشري. تشبه خلايا الكبد البشرية ALB إيجابية وسلبية CK19 خلايا الكبد الوظيفية، في حين أن الخلايا التي إيجابيا شارك الملون مع ALB البشري وCK19 عرضت القدرة ثنائي المكنة للتمييز في خلايا الكبد وcholangiocytes (الشكل 5). وهناك طريقة المسح على نطاق واسع تستخدم لتحليل كل المستمدة HpSC-فصوص الكبد أنسنة الإنسان وكشف وجود جولة متعددة وتجمعات تشبه مستعمرة المحيطة فصوص الكبد مع نوى الإنسان واضحة وCK8 / 18 التعبير (الشكل 6)، مما يدل على colony- تشكيل قدرة HpSCs الإنسان في كبد أنسنة. مستوى إعادة تعمير وصلت إلى 90٪تم الكشف عن شهر واحد بعد زرع (الشكل 7A) وإفراز الألبومين البشري في كبد الفئران إسكانها (7B الشكل)، مشيرا إلى أن HpSCs الإنسان يمكن إعادة تكوين بنجاح الرداء-TRECK / SCID كبد الفأر. هذه النتائج تثبت أن HpSCs البشرية لديها قدرة عالية على التمايز إلى خلايا الكبد وظيفية في الجسم الحي في استجابة لإنقاذ وظائف الماوس الكبد التالفة.

شكل 1
يحدث الشكل 1. تلف الكبد في الرداء-TRECK / SCID (السمية مستقبلات الخلية بوساطة خروج المغلوب) الفئران بعد الخناق السمية (DT) حقن. الأنسجة (الهيماتوكسيلين يوزين تلطيخ) من كبد الفأر دون ومع إدارة DT بعد 48 ساعة. DT الجرعة: 1.5 ميكروغرام / كغ، مصل النشاط AST الكبد الطبيعي (يسار لوحة): 30 وحدة دولية / لتر. النشاط المصل AST الكبد تعامل DT (اللوحة اليمنى): 15000وحدة دولية / لتر. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. زرع الخلايا الجذعية كبدي الإنسان في الرداء-TRECK الفئران / SCID مع الفشل الكبدي مداهم. عرض العيانية (اللوحة اليسرى)، وتحليل النسيجي (الهيماتوكسيلين يوزين تلطيخ، اللوحة اليمنى) من كبد أنسنة مع HpSCs الإنسان في 6 أسابيع بعد زرع . م، والماوس منطقة الكبد. ح والجهات المانحة البشري الخلايا المستمدة المنطقة الإنسان. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3) <ر /> الشكل 3. تحليل عياني من الأكباد أنسنة المشتقة من الخلايا الجذعية كبدي الإنسان إعتبر مع البروتين الفلوري الأخضر. صور عالية التكبير للبنية الكبد 4 أيام (اللوحة اليسرى) و 45 يوما (اللوحة اليمنى) بعد زرع مع الجذعية الكبد البشري الخلايا (HpSCs). وصفت الخلايا الجذعية الكبدية البشرية (HpSCs) مع تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) باستخدام ناقلات الفيروسة البطيئة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. توصيف كبدي الإنسان الجذعية تحليل المناعى خلايا الكبد البشرية في الرداء-TRECK / SCID الفئران. المستمدة خلية التمييز بين خلايا الكبد البشرية ملطخة مكافحة الإنسان CK8 / 18 (الأخضر) المستضد ومعاداة ح مستضد النووي أومان (أكوا الأزرق) في الجذعية كبدي المستمدة من خلية كبد أنسنة الإنسان في 6 أسابيع بعد الزرع. م، والماوس منطقة الكبد. ح والجهات المانحة البشري الخلايا المشتقة من منطقة كبد الإنسان. أبيض متقطع السطر: الماوس منطقة الكبد مقابل منطقة كبد الإنسان. تم counterstained نوى مع 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (الأزرق). الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. كبدي الإنسان الخلايا الجذعية التمايز في أنسنة الأكباد من الرداء-TRECK / SCID الفئران. المناعى يحلل من الألبومين البشري وCK19 الإنسان في كبد المستمدة HpSC-في 6 أسابيع بعد الزرع. تم counterstained نوى مع 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (الأزرق). الحانات النطاق = 100 ميكرون.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. مجموعات متعددة من كبدي الإنسان الخلايا الجذعية المستمدة خلية موجودة في الرداء-TRECK / الفئران SCID مع أنسنة الأكباد. وقد تم تحديد مجموعات كبيرة متعددة المشتقة من الخلايا الجذعية الكبدية الإنسان في فصوص الكبد في 6 أسابيع بعد زرع عن طريق التحليل المناعى لل البشري CK8 / 18 (الخضراء) ونوى الإنسان (أكوا الزرقاء). الحانات النطاق = 1000 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. انسانيالكبد أسعار إعادة تعمير والزلال إفراز الإنسان في الرداء-TRECK / الفئران SCID. (أ) معدل خيالية في الرداء-TRECK / SCID الفئران 1 الشهر التالي الكبد زرع الخلايا الجذعية البشرية؛ يتم تقديم البيانات كما يعني ± SEM (ن = 12). مان ويتني الاختبار: P <0.0005 للالشام وHpSCs الإنسان (ب) كشف الألبومين البشري في الأمصال الماوس شهر واحد بعد زرع الخلايا المانحة. البيانات = يعني ± SEM (ن = 5). مان ويتني الاختبار: P = 0.0313 للالشام وHpSCs الإنسان. ND: غير قابلة للكشف. الشام: الفئران المزروعة مع برنامج تلفزيوني. HpSCTx: الفئران المزروعة مع HpSCs الإنسان الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الكبد الماوس يمكن إسكانها مع خلايا الكبد البشرية، بما في ذلك خلايا الكبد الكبار والتكاثري الخلايا الجذعية الكبدية 17. وقد استخدمت هذه كبد إسكانها كنماذج تجريبية قبل السريرية لاختبار استقلاب الدواء واكتشاف المخدرات والتنمية 18. بالإضافة إلى ذلك، فقد قدمت البيئة في الجسم الحي للخلية النضج والتمايز 19. وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة لتوليد وأمراض الكبد نموذج الفأر الرواية التي سمح البشري انتشار غير ناضج الكبدية، والنضج، والتمايز، لشراء أنشطة استقلاب الدواء.

وقد تمت دراسة مسار زرع داخل الطحال على نطاق واسع. الخلايا المزروعة في الطحال من الفئران والجرذان البقاء على قيد الحياة طوال متوسط ​​فترة حياتها. وقد ثبت أن بروتوكول زرع داخل الطحال أن تكون مفيدة جدا في التحقيق الأسئلة البحثية محددة؛وقد حاول العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم للاستفادة من هذا البروتوكول كنموذج تكرار للغاية ويمكن الاعتماد عليها لزرع الخلايا الكبدية بسبب زيادة معدل بقاء الفئران والكبد تجديد. ومع ذلك، زرع الخلايا في لب الطحال يشكل خطرا، لأن غالبية الخلايا المزروعة ونقل من الى الكبد حيث يمكن أن تسد فروع بوابة. على الرغم من هذا الانسداد يمكن أن يكون مؤقتا، وربما لا تؤثر على البيئة الكبد السليمة، في حالات تلف الكبد قبل الإيجاد، يمكن هذا الإجراء زيادة خفض وظائف الكبد وزيادة ارتفاع ضغط الدم البابي، وربما أيضا تؤثر سلبا engraftment الخلية. على الرغم من أننا قد طبقت بنجاح زرع خلايا الكبد باستخدام زرع داخل الطحال، تستدعي العديد من القضايا مزيد من الدراسة، وخاصة موضوع مصادر خلية جديدة محتملة. وعلاوة على ذلك، عند تنفيذ زرع الكبدية داخل الطحال، والحد من خلية تحميل يجب اتباعها بدقة لمنع اضطراب محتمل من قبلدوران الأوعية الدقيقة الكبدي بقايا. وقد تم التعرف على مستقبلات DT كشكل الراسية غشاء عامل ملزم الهيبارين EGF مثل النمو (HB-EGF السلائف) 20. في حين السلائف HB-EGF المشتقة من الحيوانات الحساسة للسموم، مثل البشر والقرود، DT ربط وظيفة ومستقبلات السموم والسلائف HB-EGF من الفئران والجرذان لا تلزم DT 21. والرداء-TRECK / SCID نموذج الفأر وراثيا يعبر HB-EGF مثل مستقبلات الإنسان تحت سيطرة الكبد خلية محددة الزلال المروج. بعد إدارة DT، هذه الفئران تطوير فشل الكبد مداهم بسبب الاجتثاث المشروط للخلايا الكبد، وتوفير مساحة لإقامة خلية المانحة والانتشار. ومن المعروف أن خلايا الكبد البشرية، حتى في مرحلة غير ناضجة، لامتلاك قدرة كبيرة التكاثري في المختبر، على الرغم من أنها تفقد وظائف الأيض المخدرات، والحد من التطبيقات قبل السريرية من 22. النتائج النسيجية والمناعية التي تم الحصول عليها في أعقاب هيئة تنظيم الاتصالاتوأشار nsplantation من HpSCs الإنسان في الرداء-TRECK الفئران / SCID مع قاتلة فشل كبدي مداهم أن HpSCs الإنسان يمكن أن يتوسع وإعادة تشكيل التالفة الهياكل الماوس الكبد. كان معدل إعادة تعمير بعض الفئران في ما يقرب من 100٪.

في تجاربنا، الترويج زرع HpSC البشري البقاء على قيد الحياة الماوس وأدت إلى زيادة إفراز ALB البشري في الماوس الأمصال 16. نضجت هذه الخلايا أيضا ومتباينة في الجسم الحي وعرضت الأنشطة استقلاب الدواء الإنسان، مشيرا إلى أن تستمد HpSC الأكباد الفئران أنسنة الإنسان متشابهة حتى تنضج وظيفية "الأعضاء البشرية" ولها تطبيقات محتملة في تطوير العقاقير. هذه النتائج تؤكد كذلك أن الرداء-TRECK / SCID الماوس هو النموذج المثالي للجيل الكبد أنسنة. وعلى الرغم من التوقعات ومزايا الرداء-TRECK / الفئران SCID نموذجا مثاليا للالجذعية الكبد الجيل الكبد أنسنة المشتقة من الخلايا البشرية، لديهم عيب احدة فريدة من نوعها. عندما إعلان البشريتم زرع خلايا الكبد الموج إلى ثلاث الرداء-TRECK / الفئران SCID تعامل مع جرعة واحدة من DT، تم إنشاء أي كبد أنسنة، ربما لأن خلايا الكبد الكبار الإنسان تفتقر إلى القدرة التكاثري. جرعات إضافية من DT لا يمكن أن تدار آخر زرع خلايا الكبد الكبار الإنسان؛ منذ مستقبلات DT (HB-EGF) في الرداء-TRECK / خلايا الكبد الفئران SCID تحت سيطرة المروج الزلال، إلى مزيد من المعالجة DT سوف يدمر خلايا الكبد الكبار البشرية المزروعة في كبد الفأر.

إلى حد علمنا، هذا هو النموذج الأول لتوليد الكبد أنسنة من الخلايا البشرية غير ناضجة. ويتأثر خلية معدل الإحلال بعد زرع من قبل المتلقي الصغير للبيئة (على سبيل المثال، المتخصصة الكبدية) وخصائص الخلية المانحة، مثل ناضجة مقابل غير ناضجة والتكاثري والقدرة التفاضلية. والجمع بين الرداء-TRECK / SCID مع زرع الخلايا الجذعية توفر الشروط والمزايا الأمثل لتوليد البشريةكبد أوتوماتيكية. وهذا يشكل أيضا أداة قوية لزرع الخلايا الجنينية الكبد ويحتمل أن تكون كذلك الجذع أو وفاق المستمدة الخلايا الكبدية منذ قبل العلاج DT، يتم الاحتفاظ الرداء-TRECK / حيوانات SCID في حالة صحية، تلف الكبد هو محرض في أي نقطة، والفئران تتكاثر بشكل طبيعي دون تلف الكلى. في المقابل، ميكرو / الفئران SCID يحمل فيات الولدان عالية ويصعب تكاثرها. وعلاوة على ذلك، يمكن أن overexpression من يوروكيناز في الحيوانات يؤدي إلى نزيف حاد وتلف الكلى، وبالتالي هناك نافذة محدودة من فرصة لزرع الخلايا قبل الفطام. الرداء-TRECK / SCID يمكن استخدامها لزرع الخلايا في أي سن.

الجيل الناجح على فأرة الحاسوب الكبد أنسنة يتطلب الخطوات الهامة التالية: 1) يجب أن يقتصر إصابة الكبد إلى مستويات شبه قاتلة (عادة باستخدام جرعة قاتلة، 50٪)؛ 2) يجب المحافظة على خلايا الكبد الجنين الإنسان الأساسية في وضع شبه متموجة لا يزيد عن 90٪.3) يجب أن يمنع آخر تسرب خلية زرع داخل الطحال. و4) يجب رصد مستويات الألبومين البشري في الأمصال الماوس على فترات منتظمة. فهم شامل للعوامل حاسمة تشارك في عملية أنسنة الجيل كبد الفأر قد تسهم في مزيد من التعديلات أو تطورات جديدة باستخدام الفئران أو غيرها من الحيوانات. وتشمل التعديلات المحتملة: تحريض إصابة الكلى لفحص التنمية والإصلاح مع النيفرون الإنسان، الأسلاف، ووجمع خلايا القناة والتجميع الذاتي للالنيفرون الإنسان إلى ثلاثة هياكل ثلاثية الأبعاد في جسم الفأر. دراسة إصلاح الضرر جزيرة في البنكرياس باستخدام الخلايا الجذعية / السلف البنكرياس المستمدة من برمجتها مباشرة، الجذع، أو خلايا ES. ومن الأمثلة على إدخال تعديلات على العملية تشمل: السيطرة على الأنسجة أو إصابة الجهاز مع السموم أو المواد الكيميائية مثل ريترورسين، بالستربتوزوتوسين، أو سيسبلاتين لتسهيل المنافسة من الخلايا المانحة مع خلايا المقيمين؛ تجنبالتفاضلية أو تقليل انتشار من أجل تعزيز قدرة التكاثري من الخلايا المانحة، مما يعزز من استبدال خلايا المتلقي، مثل وفاق أو iPS- الخلايا المشتقة. اختيار مواقع مناسبة لزراعة والسيطرة على ضخ خلية لضمان زرع كفاءة، على سبيل المثال، وذلك باستخدام البوابة أو الوريد الذيل لزرع نظامي التوضع ومساريق وكبسولة الكلى لزرعها خارج الرحم. رصد حالة الاستبدال عن طريق التعبير عن النسيج أو العضو يفرز البروتينات ممثل الجذعية / السلف أو غير ناضجة زرع الخلايا والخلايا السرطانية تتبع، مثل فيتوبروتين ألفا أو ترانسفيرين.

وباختصار، الرداء-TRECK / الفئران SCID تشكل نموذج مناسب لالكبدي زرع الخلايا الجذعية البشرية، كما أنها توفر بيئة المفيدة التي تسمح للتمايز في خلايا الكبد ناضجة. هذا نموذج رواية لديها امكانات هائلة تطبيقية، ليس فقط لخارج الحي التوسع في خلايا الكبد ب الإنسانالتحرير أيضا لشاشات المخدرات والعقاقير العلاجية اختبار المرشح لسمية الكبد والتمثيل الغذائي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه النتائج تساعد في النهوض بالدراسات المستقبلية دراسة التطبيق السريري لهذه التقنية لزرع الخلايا الكبدية البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human albumin Sigma A6684 Mouse
Human CK19 Dako M088801 Mouse
Human nuclei Millipore MAB1281 Mouse
Human CK8/18 Progen GP11 Guinea pig
CDCP1 Biolegend 324006 Mouse
CD90 BD 559869 Mouse
CD66 BD 551479 Mouse
GOT/AST-PIII Fujifilm 14A2X10004000009
DMEM/F-12 Gibco 11320-033
FBS Biowest S1520
0.05% Trypsin-EDTA  Gibco 25300-054
Diphtheria Toxin Sigma D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit Bethyl Laboratories E88-129
Syringe (1 ml) Terumo SS-01T
32G 1/2" needle TSK PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml) Sakura Finetek Japan 4583
MoFlo high-speed cell sorter Beckman Coulter B25982
DRI-CHEM 7000 Fujifilm 14B2X10002000046

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
  2. Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
  3. Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
  4. Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
  5. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
  6. Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
  7. Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
  8. Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
  9. Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
  10. Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
  11. Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
  12. Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
  13. Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
  14. Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
  15. Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
  16. Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
  17. Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
  18. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
  19. Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
  20. Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
  21. Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
  22. Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).

Tags

الطب، العدد 114، فشل الكبد مداهم، زرع، ذيفان الخناق، الكبد أنسنة، الفئران TRECK / SCID، زرع داخل الطحال، خلايا الكبد البشرية، غير ناضجة، وخلايا الكبد الجنين، والخلايا الجذعية الكبدية، بيولوجيا الخلايا الجذعية، الزلال
جيل من كبد الفأر أنسنة طريق كبد الإنسان خلايا الجذعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, R. R., Zheng, Y. W.,… More

Zhang, R. R., Zheng, Y. W., Taniguchi, H. Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells. J. Vis. Exp. (114), e54167, doi:10.3791/54167 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter