Protocol
所有的动物实验过程是按照横滨市立大学的动物保护准则进行的。
1.代急性肝损伤小鼠模型
- 加入1 ml phenolized 0.85％NaCl溶液（0.6克苯酚在100毫升0.85％NaCl溶液），以1毫克白喉毒素（DT），制成1毫克/毫升DT原液。注：DT以1mg / ml的浓度可在3℃至8℃储存约2年。
- 连续稀释phenolized 0.85％的NaCl溶液中的1mg / ml的DT原液至0.3微克/毫升DT和制备0.3微克/毫升DT溶液作为工作溶液的等分试样。注：该工作液应新鲜配制。
- 进行使用亚致死剂量（〜50％致死）实验，辖8周龄小鼠DT的1.5微克/千克的剂量。
- 通过按住鼠标背卧执行DT腹腔注射，并插入业务承包商Ë膝盖的弯曲下面，左面或中线的权利。避免中线以防止膀胱的渗透。角针在约45°到主体。
- 使用胰岛素注射器，注射的老鼠用100微升每个20 G鼠标重量的新鲜0.3微克/毫升的DT。例如，18-G鼠标应该接受90微升0.3微克/毫升DT解决方案。
- 在48小时后DT注射，通过将鼠标在一个限制器和温热小鼠尾部在37℃水浴中约10分钟，以扩张血管收集从尾静脉血液。然后，制成1毫米切口，从用锋利的手术刀刀片尖端的尾2厘米并用微毛细管收集血液。
- 离心含有血液的微毛细管在1500×g离心5分钟，并通过分离上清液和细胞沉淀收集血清。
- 1:20稀释的小鼠血清中吸取50微升到GOT / AST-PIII幻灯片。使用根据制造商的协议的多功能自动干化学分析仪在650nm测定反应产物（蓝色染料）的吸光度。
注：读出谷草转氨酶（AST）的/自动显示谷草转氨酶（GOT）的活性。后2天DT注射，将小鼠的约60％12,000表现AST值 - 16000 IU / L，被认为是从急性肝损伤痛苦。这些小鼠被转移至新笼子并用作细胞移植。
2.人力肝干细胞的制备
- 隔离从人初级胎儿肝细胞与使用CDCP1，CD90和CD66细胞抗原以获得CDCP1 + CD90 + CD66-亚群细胞分选仪人肝干细胞，然后接种于涂覆IV型胶原的培养皿的分离的细胞群，如先前报道15。使用胚胎的人类首要胎肝细胞周14至18岁之间的年龄。
- 收集培养至80％的人类肝干细胞 - 90％汇合于100毫米的培养皿，吸出培养基，用10毫升的PBS洗涤细胞，然后取出PBS。 Trypsinize用2ml的0.05％胰蛋白酶/ EDTA溶液中的细胞5分钟，在37℃下。注意：在大于90％汇合的细胞不适合于细胞移植自细胞分化可能在小鼠中影响其增殖能力。
- 监测细胞分散液的显微镜下的状态。当细胞似乎漂浮或自由流动，通过加入8毫升含有10％FBS的DMEM / F12的停止酶消化。
- 悬浮细胞慢慢使用10毫升血清吸管将细胞转移到15mL的锥形管中。离心细胞，在100 xg离心5分钟，4℃。
- 小心重悬细胞沉淀在含有10％FBS的10的10ml DMEM / F12，并确定使用显微镜计数室的细胞数。
- 划分细胞向每50μl的PBS等份为每个单独的小鼠的1.0×10 6个细胞，并在冰上储存直至移植。
3.人肝脏干细胞内移植
- 将干净的笼子里37℃的电热垫。
- 通过将它放置在喷嘴的下面 - （在2L每分钟的氧气的1.5％（体积/体积）1）麻醉小鼠用异氟醚吸入。另外，使用含有用纱布浸湿异氟醚管。
- 确保鼠标轻轻捏后足垫麻醉。如果膝反射是引出，将鼠标回到室内。使用对眼睛兽医药膏，以防止干燥时的麻醉下。
- 使用电动推剪剃手术部位，并应用70％（体积/体积）乙醇和聚维酮碘消毒。然后使在左侧面只是肋的肋缘下方1厘米的皮肤切口，接着在切口腹壁，以及腹膜。
- 小心露出脾脏。用100微升注射注射器带32 G1 / 2英寸的针直接注入1.0×10 6人肝干细胞在50μlPBS中进入各小鼠的脾脏。倾斜以5°角的注射针头。
- 确保注入的深度为脾脏不到一半的厚度。针应在一端（头部）进入脾脏，并在另一端（尾）沉积的细胞。
- 为了防止注射后的细胞泄漏，用手指2分钟轻轻地施加压力，然后取出针。
- 放置脾放回鼠标主体和与正常运行缝合的肌肉和皮肤关闭腔。
- 转移的小鼠成37℃预热的笼立即移植以下。为了保证鼠标能够舒适地呼吸，将鼠标在其一侧的笼子里，一排尿笼床上用品和手术部位之间的接触。
- 监测小鼠直到麻醉消退确保缝线保持关闭并且小鼠返回到手术前的条件。
- 确保将小鼠具有正常的饮用水和食品。 1小时后，返回笼动物中心的鼠标间，每日监测小鼠。
4.移植的检测人肝干在小鼠肝细胞衍生肝细胞
注：对于以下步骤，使用安乐死颈椎脱位氯胺酮和甲苯噻嗪过量的所有动物。
- 在4 - 第6周后移植，安乐死的小鼠和通过同时切割表皮和使用手术剪筋膜打开腹腔。
- 解剖结缔组织腹膜以上，使用剪刀作为吊具，并切断腹膜沿白线，打开腹腔腔。
- 解除胸骨用镊子，穿刺隔膜，并通过胸骨的每一侧穿过宫颈腰带切开。
- 断绝对肝脏的胸侧的腔静脉，并通过在向前方向肝脏拉食道。为了除去肝脏去除隔膜。
注意：请小心保持剪刀提示，以防止下胸器官的损害向上指出。胸腺有偶尔紧贴胸骨背侧的趋势，这一点必须小心避免。 - 使用隔膜作为手柄，启动拉动肝脏出腹腔。内部腔静脉将举行到位肝脏。切内部腔静脉;要小心，不要过早解放右肾上腺。
注：老鼠有四裂肝脏包括中叶，左叶，右叶和尾状叶。胆悬浮在小分叉中叶。 - 在路口彼此分开的瓣，并根据制造商的方案在最佳切割温度（OCT）化合物嵌入其中。冻结包含在低温恒温器的金属网格肝组织的十月
- 用切低温恒温器5微米厚的切片样本在-18°C和安装它们RT显微镜载玻片。在-80℃保存的股票。制备用于苏木精和曙红（H＆E）和根据先前报道的方法16免疫荧光染色的幻灯片。
5.人力分泌白蛋白的检测和嵌合率的计算
- 来测量人体肝重构，执行人白蛋白ELISA使用血清，并根据制造商的说明一个人白蛋白ELISA试剂盒。
- 通过实时计算人源化肝脏的嵌合率表达水平的PCR分析在整个-人源化肝脏。确定相对前人特异性肌动蛋白的人类 - 小鼠横动蛋白PRESSION水平比率（比率1）和小鼠 - 特异性肌动蛋白的人类 - 小鼠横肌动蛋白的比率（比例为2）。嵌合率计算为比率1 /（比1+比率2）。
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Representative Results
ALB-Treck技术/ SCID小鼠的肝细胞表达的白蛋白启动子的控制下的人类DT受体HB-EGF的基因并显示出下列DT给药12细胞毒性作用。为了评估DT处理对肝损伤的影响，DT剂量为1.5微克/公斤，分别注入8周龄ALB-Treck技术/ SCID小鼠和在肝脏中48小时后DT给药的病理改变进行组织学评估。与对照组（不与DT处理）相比，DT-治疗的小鼠表现出与血清AST活性升高拥堵修正杂乱无章的肝架构。此外，DT-治疗的小鼠的肝细胞有多种，深染嗜酸细胞胞浆内有深色的细胞核（最有可能凋亡的肝）在一起;一些其他的肝细胞出现保留或表现出与具有很少或没有门静脉炎症暗细胞核空泡细胞质（ 图1 12产生。
人类HpSCs可以在体外培养被用于长期并表现出与一些ALB和更少CK19阳性细胞均一细胞形态。 6周后移植到小鼠肝，人类HpSCs在显微镜下进行碱性检查和评价组织学;观察人类HpSCs由替换原始小鼠肝细胞（ 图2）已重建肝脏结构。宏观上，在4天后的人类HPSC移植，即均匀肝脏周围分布进行检测小的人肝集群; 45天移植后，这些已经进入增殖大型集群（ 图3）。谁与人肝细胞复原乐小鼠肝脏被指定为“人性化的肝脏。”这些结果表明，与致死暴发性肝衰竭是进行人类HPSC移植小鼠可以表现出类似于在正常小鼠肝脏观察肝结构。
在测试之前移植到小鼠未成熟的人肝细胞是否有潜力分化和体内能发挥作用，人肝细胞在小鼠肝脏中存在通过免疫组化分析约后6周的人HPSC移植首先被证实。从用60％的人细胞再增殖的小鼠肝切片特异性和阳性共染色与人细胞核和人细胞角蛋白8/18被发现（CK8 / 18）的抗体，以含有供体细胞衍生的人肝细胞，而原始对照小鼠肝脏分别负这些标记（ 图4）。
在体内的细胞分化的程度，人血白蛋白（ALB）和人细胞角蛋白19（CK19）的表达，免疫组化评估。人类HPSC衍生人类肝细胞分化以及在小鼠肝脏并表现出上调人ALB表达。人ALB阳性和CK19阴性肝细胞相似功能的肝细胞，而这正共同染色人ALB和CK19表现出双电位能力分化成肝细胞和胆管（ 图5）的细胞。用于分析所有人类HPSC衍生化肝叶一个大型扫描方法显示多个圆形和围绕具有明确的人类核和CK8 / 18表达（ 图6）的肝叶菌落状簇的存在，这表明该细胞集落形成在人源化肝脏的人类HpSCs的能力。复育水平达到了90％在重新填充小鼠肝脏（ 图7B）检测后一个月移植（ 图7A）和人白蛋白的分泌，这表明人类HpSCs可以成功地重新构成ALB-Treck技术/ SCID小鼠的肝脏。这些结果表明，人类HpSCs具有分化高电位到体内功能肝细胞响应于缺陷的小鼠肝功能救援。
图1. 肝损伤小鼠肝脏组织学（苏木精-伊红染色），而与48小时后DT管理中出现ALB-Treck技术/ SCID（毒素受体 介导的细胞基因敲除）小鼠继白喉毒素（DT）注射。 DT剂量：1.5微克/公斤，正常肝脏（左图）的血清AST活性：30 IU / L; DT-治疗肝癌血清AST活性（右图）：15000IU / L。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 人肝干细胞移植ALB-Treck技术暴发性肝衰竭/ SCID小鼠。在第6周与人类HpSCs人性化肝脏宏观（左图）和组织学分析（苏木精-伊红染色，右图）移植后。男，小鼠肝脏区域;小时，人供体细胞衍生的人的区域。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
<BR /> 图 3. 绿色荧光蛋白标记的人肝干细胞衍生的人性化肝脏的宏观分析，肝脏结构4天（左图）零45天的高倍率图像（右图）以下移植人类肝干细胞（HpSCs）。人类肝脏干细胞（HpSCs）的标记用慢病毒载体增强绿色荧光蛋白（EGFP）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4 的表征人肝干细胞衍生的人肝细胞中的白蛋白- Treck技术/ SCID小鼠。免疫组织化学分析用抗人CK8 / 18（绿色）抗原和抗H染色的人肝细胞之间进行区分在6周的人肝干细胞衍生的人源化肝脏UMAN细胞核抗原（水蓝色）移植后。男，小鼠肝脏区域;小时，人供体细胞衍生的人肝区域。白虚线：小鼠肝脏区域与人类肝脏区域。细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基（蓝色）复染色。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
在HPSC源性肝人血白蛋白和人CK19 图5.人类肝脏干细胞的ALB-Treck技术/ SCID小鼠。免疫组化的人性化肝脏分化的研究在6个星期后移植。细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基（蓝色）复染色。比例尺= 100微米。jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
干细胞衍生的细胞存在于白蛋白-Treck技术/ SCID小鼠人源化肝脏。来自人肝干细胞衍生的多个大簇在肝叶6周鉴定人肝癌的 图6. 多个群集由免疫组织化学分析移植后人类CK8 / 18（绿色）和人的细胞核（水蓝色）。比例尺= 1000微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7. 人性化在ALB-Treck技术/ SCID小鼠肝复育率和人血白蛋白分泌。 （一）ALB-Treck技术/ SCID小鼠1个月以下人肝干细胞移植嵌合率;数据被表示为平均值±SEM（N = 12）。 Mann-Whitney检验：P <0.0005深水和人类HpSCs（B）的人白蛋白的检测小鼠血清后一个月施主细胞移植。数据=平均值±SEM（N = 5）。 Mann-Whitney检验：P = 0.0313深水和人类HpSCs。 ND：检测不到;假：用PBS移植小鼠; HpSCTx：与人HpSCs移植小鼠请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
最近的研究已经表明，在小鼠肝脏可以与人肝细胞，包括成人肝细胞和增殖性肝干细胞17被重新填充。这些重新填充肝脏已被用作临床前试验模型的药物代谢试验和药物发现和开发18;此外，他们提供了用于细胞的成熟和分化19 的体内环境。本研究的主要目的是要产生，允许人未成熟肝细胞增殖，成熟和分化，对采集的药物代谢活动的新颖性肝病的小鼠模型。
内移植的过程中已被广泛研究。移植到大鼠和小鼠的脾细胞生存其整个平均寿命。该内移植的协议已被证明是调查具体的研究问题非常有用的;许多实验室全世界已尝试使用此协议为因为改进的小鼠存活和肝再生的肝细胞移植一个高度可再生的和可靠的模型。然而，植入细胞进入脾纸浆带来危险，因为大多数植入细胞的将转位到肝脏在那里他们可以阻塞门分支。尽管这可以闭塞是暂时的，可能不会影响肝脏健康的环境，在先前存在的肝损害的情况下，这个过程可以进一步降低肝功能，增加门静脉高压症，而且还可能产生负面影响细胞植入。虽然我们使用内移植成功地应用于肝细胞移植，有几个问题值得进一步研究，特别是潜在的新细胞来源的问题。此外，在执行脾内肝细胞移植时，小区负载限制必须严格遵循，以防止潜在的由干扰残余肝脏微循环。对DT受体已被鉴定为肝素结合EGF样生长因子（HB-EGF前体）20的膜锚定的形式。而来自毒素敏感的动物衍生的HB-EGF的前体，如人，猴，绑定DT和功能毒素受体 ，HB-EGF的前体从小鼠和大鼠不结合DT 21。转基因ALB-Treck技术/ SCID小鼠模型表达了肝脏细胞特异性白蛋白启动子的控制下，人HB-EGF样受体; DT的给药后，这些小鼠发展暴发性肝衰竭，由于肝细胞的有条件的消融，提供用于施主小区居住和增殖的空间。人肝细胞，甚至在一个不成熟的阶段，已知在体外具有广泛的增殖能力，尽管它们失去其药物代谢的功能，限制了它们的临床前应用22。所得组织和免疫组化结果的TRA以下人类HpSCs成ALB-Treck技术/ SCID小鼠用致死暴发性肝衰竭的nsplantation表明人类HpSCs可扩大和重建受损小鼠肝结构;在一些小鼠中的再增殖率接近100％。
在我们的实验中，人类HPSC移植促进小鼠存活和导致增加人ALB分泌到小鼠血清16。这些细胞也成熟和体内分化并表现出人类的药物代谢活动，这表明人类HPSC衍生人性化的小鼠肝脏类似于成熟和功能的“人体器官”，并在药物开发应用潜力。这些结果进一步证实，ALB-Treck技术/ SCID小鼠是人源化肝脏产生的理想模型。尽管作为用于人肝干细胞衍生的人源化肝脏产生的理想模型ALB-Treck技术/ SCID小鼠的前景和优点，它们具有一个唯一的缺点;当人体广告ULT肝细胞被移植到与DT的单剂量处理3 ALB-Treck技术/ SCID小鼠，未产生人源化肝脏，这可能是因为人成年肝细胞缺乏增殖能力。 DT的附加剂量不能给予成人肝细胞移植后;由于在ALB-Treck技术/ SCID小鼠的肝细胞对DT受体（HB-EGF）是白蛋白启动子的控制下，附加DT治疗会破坏移植的人成年肝细胞在小鼠肝。
据我们所知，这是产生由未成熟的人类细胞的人源化肝脏的第一模型。细胞替代速率移植后由收件人微环境（ 如，肝小生）和供体细胞性质，如成熟与未成熟的和增殖性和差的能力的影响。造血干细胞移植结合ALB-Treck技术/ SCID将为人类的生成优化的条件和优势美化版肝脏。由于DT处理之前，这也构成了胎儿肝细胞和潜在以及能干或移植的强大工具ES衍生的肝细胞中，ALB-Treck技术/ SCID动物被保持在正常状态，肝损伤是可诱导在任何点，并且小鼠正常繁殖无肾损害。与此相反，uPA的/ SCID小鼠表现出高的新生儿死亡，并且难以繁殖。另外，在动物尿激酶的过表达可导致严重出血和肾功能损害，因而存在用于细胞移植的机会有限窗口之前断奶; ALB-Treck技术/ SCID可以在任何年龄可以用于细胞移植。
成功代人源化肝脏的鼠标需要以下关键步骤：1）肝损伤应限于亚致死水平（通常通过使用致死剂量，50％）; 2）人初级胎儿肝细胞应在不高于90％的亚铺满状态被保持;3）细胞泄漏后脾内移植应当防止; 4）人白蛋白在小鼠血清中的水平应定期进行监测。所涉及的人源化小鼠肝脏产生的过程中的关键因素全面了解可能有助于进一步修饰或利用鼠或其他动物的新发展。可能的修改包括：肾损伤的诱导审查发展和修复与人类肾，其祖细胞，和集合管细胞和人肾的自组装成在小鼠体内的三维结构;使用来自直接重新编程，IPS，或ES细胞衍生的胰腺干/祖细胞研究中的胰岛损伤的修复。过程修饰的实例包括：控制与毒素或化学品如retrorsine，菌素，或顺铂以促进供体细胞与驻地细胞竞争组织或器官损伤;避免差或减少增殖，以提高供体细胞的增殖能力，从而促进更换受体细胞，如胚胎干或IPS-的衍生细胞;选择一个合适的移植位点和控制细胞输注以确保有效的移植，例如，使用用于entopic移植和肠系膜和肾包膜异位移植的门户或尾静脉;通过组织或器官中分泌的蛋白质代表的干/祖细胞或未成熟细胞移植和癌症细胞示踪的，诸如甲胎蛋白或转的表达监测替代状态。
总之，ALB-Treck技术/ SCID小鼠构成用于人肝干细胞移植的合适的型号，因为它们提供了一个有利的环境，可以分化成成熟肝细胞。这种新颖的模式有着巨大的应用性的潜力，不仅对人肝细胞b 体外扩增UT还用于药物屏幕和测试候选治疗药肝毒性和代谢。此外，这些结果将在未来的研究中研究这项技术对人类肝细胞移植的临床应用的发展提供帮助。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
- Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
- Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
- Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
- Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
- Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
- Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
- Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
- Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
- Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
- Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
- Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
- Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
- Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
- Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
- Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
- Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).
