Protocol
Alle dyr eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med Animal retningslinjer for Yokohama City University Beskyttelse.
1. Generering af akut leverskade, musemodel
- Der tilsættes 1 ml fenol 0,85% NaCl-opløsning (0,6 g phenol i 100 ml 0,85% NaCl-opløsning) til 1 mg difteritoksin (DT) for at gøre en 1 mg / ml DT stamopløsning. Bemærk: DT i en koncentration på 1 mg / ml kan opbevares i ca. 2 år ved 3 ° C til 8 ° C.
- Serielt fortynde 1 mg / ml DT stamopløsning til 0,3 ug / ml DT i fenol 0,85% NaCl-opløsning og forberede en portion af 0,3 ug / ml DT opløsning som en brugsopløsning. Bemærk: Denne arbejdsgruppe opløsning skal være frisklavet.
- At gennemføre forsøg med en subletal dosis (~ 50% letalitet), administrere 8 uger gamle mus en dosis 1,5 ug / kg af DT.
- Udfør en intraperitoneal injektion af DT ved at holde musen liggende på ryggen og indsæt needle under bøjningen af knæene, til venstre eller til højre for midterlinjen. Undgå midterlinjen for at forhindre indtrængning af blæren. Vinkel nålen i cirka 45 ° i forhold til kroppen.
- Ved anvendelse af en insulinsprøjte, injiceres musene med 100 pi frisk fremstillet 0,3 ug / ml DT pr 20 g mus vægt. For eksempel bør en 18-g mus modtager 90 pi af 0,3 pg / ml DT-opløsning.
- Ved 48 timer efter DT injektion, indsamle blod fra halevenen ved at placere musen i en fastholdelsesanlæg og opvarmning musen halen i et 37 ° C vandbad i ca. 10 min til udvide blodkarrene. Derefter lave en 1-mm nick i halen 2 cm fra spidsen med en skarp skalpel og indsamle blodet med en mikrokapillær rør.
- Centrifugeres mikrokapillær røret med blod ved 1500 xg i 5 min og indsamle serummet ved at adskille supernatanten og cellepelleten.
- Pipette 50 pi 1:20 fortyndet mus serum onto GOT / AST-PIII glider. Mål absorbansen af reaktionsproduktet (blåt farvestof) ved 650 nm under anvendelse af en multi-purpose automatisk tør-kemi analysator ifølge producentens protokol.
BEMÆRK: udlæsning af aspartataminotransferase (AST) / alaninaminotransferase (GOT) aktivitet vises automatisk. 2 dage efter DT injektion, ca. 60% af musene udviste AST-værdier mellem 12.000 - 16.000 IU / L og blev anset for at være ramt af akut leverskade. Disse mus blev overført til et nyt bur og bruges som celle transplanterede patienter.
2. Fremstilling af humane hepatiske stamceller
- Isoler humane hepatiske stamceller fra humane primære føtale leverceller med en cellesorterer hjælp af CDCP1, CD90, og CD66-antigener til opnåelse af en CDCP1 + CD90 + CD66- subpopulationen, derefter frø den isolerede cellepopulation på collagen IV-coatede dyrkningsskåle, som tidligere rapporteret 15. Bruge humane primære føtale leverceller af et embryoniskalder mellem uge 14 og 18.
- Saml humane lever stamceller dyrket til 80% - 90% sammenløb på 100 mm petriskåle, aspireres dyrkningsmediet, vaske cellerne med 10 ml PBS, og derefter fjerne PBS. Trypsinisér cellerne med 2 ml 0,05% trypsin / EDTA-opløsning i 5 minutter ved 37 ° C. Bemærk: Celler på mere end 90% konfluens er ikke egnede til celletransplantation siden celledifferentiering kan påvirke deres proliferative evne hos mus.
- Overvåge status for cellen dispersion under et mikroskop. Når cellerne synes at være flydende eller flyder frit, stoppe den enzymatiske fordøjelse ved tilsætning af 8 ml DMEM / F12 indeholdende 10% FBS.
- Suspendere cellerne langsomt anvendelse af en 10-ml serologisk pipette og overføres cellerne til et 15 ml konisk rør. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 100 xg og 4 ° C.
- resuspender forsigtigt cellepelleten i 10 ml DMEM / F12 indeholdende 10% FBS og bestemme celleantal under anvendelse af et mikroskop tællekammer.
- Opdel celler i 1,0 x 10 6 celler pr 50 pi PBS portioner for hver individuel mus og gemme på is indtil transplantation.
3. milten transplantation af humane lever Stamceller
- Placer en ren bur på en 37 ° C elvarme pad.
- Bedøver musen med isofluran inhalation (1 - 1,5% (vol / vol) i 2 I oxygen pr min) ved at placere den under dysen. Alternativt kan du bruge rør indeholdende gaze vædet med isofluran.
- Sørg for, at musen er bedøvet ved let klemme den bageste trædepude. Hvis en knæ jerk fremkaldes, skal du placere musen tilbage i kammeret. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
- Barbere operationsstedet ved hjælp elektriske klippere og anvende 70% (vol / vol) ethanol og povidon-iod at sterilisere. Derefter foretage en 1-cm incision i huden i den venstre flanke lige under ribben grænsen af ribberne, efterfulgt af et indsnit påbugvæggen, samt peritoneum.
- eksponere omhyggeligt milten. Brug en 100-pi mikroinjektion sprøjte med en 32-G 1/2-inch nål til direkte at injicere 1,0 x 10 6 humane hepatiske stamceller i 50 pi PBS i milten på hver mus. Vip nålen på en 5 ° vinkel til injektion.
- Sikre, at dybden af injektionen er mindre end halvdelen af tykkelsen af milten. Nålen skal indtaste milten i den ene ende (hovedet) og deponere cellerne i den anden ende (halen).
- For at forhindre lækage af cellerne efter injektion, forsigtigt lægge pres ved hjælp af en finger i 2 min og derefter fjernes kanylen.
- Placer milt tilbage i musen kroppen og lukke hulrummet med en normal drift sutur for muskulatur og huden.
- Overfør musene i en 37 ° C forvarmet bur umiddelbart efter transplantation. For at sikre at musen er i stand til at trække vejret komfortabelt, placeres musen på siden i buret, entømme kontakt mellem buret strøelse og stedet for kirurgi.
- Overvåg musene indtil bedøvelsen aftager at sikre suturerne forblive lukket og musene vende tilbage til før-kirurgi betingelser.
- Sørg musene er forsynet med normal drikkevand og mad. Efter 1 time returnere buret til musen rum af dyret centrum og overvåge musene dagligt.
4. Påvisning af transplanterede humane lever stamcelle-Afledt Hepatocytter i Mouse Lever
Bemærk: I de følgende procedurer, aflive alle dyr bruger en overdosis af ketamin og xylazin efterfulgt af cervikal dislokation.
- Ved 4 - 6 uger efter transplantation, aflive musene og åbne bughulen ved samtidigt at skære cutis og fascia anvendelse af kirurgiske sakse.
- Dissekere bindevæv over peritoneum, ved hjælp af saks som en spreder, og skære peritoneum langs linea alba at åbne peritonealehul.
- Løft brystbenet med pincet, punktere membranen og skære gennem hver side af brystbenet op gennem den cervikale bælte.
- Sever vena cava på thorax side af leveren og træk spiserøret gennem leveren i anterior retning. Fjern membranen for at fjerne leveren.
Bemærk: Vær omhyggelig med at holde spidsen af saksen pegede opad for at forhindre eventuelle skader på thorax organer nedenunder. Den thymus har en tendens til lejlighedsvis klamre sig til den dorsale side af brystbenet, og det skal omhyggeligt undgås. - Brug af membranen som håndtag, begynde at trække leveren ud af bughulen. Interiøret vena cava vil holde leveren på plads. Skær den indvendige vena cava; Pas på ikke at tidligt befri den rigtige binyre.
Bemærk: Mus har en fire-fliget lever bestående af en median lobe, venstre lap, højre lap, og den spiegelske lap. Galdeblæren suspenderes i den lille tvedeling afmedianen lap. - Adskil lapper fra hinanden ved forbindelserne og indlejre dem i optimal skæring temperatur (OCT) forbindelse ifølge fabrikantens protokol. Frys OLT indeholder leveren væv i metalgitre på kryostaten.
- Skær 5-um-tykke prøve sektioner under anvendelse af en kryostat ved -18 ° C og montere dem på RT mikroskopobjektglas. Opbevar lager ved -80 ° C. Forbered dias for hematoxylin og eosin (H & E) og immunfluorescensfarvning ifølge tidligere rapporterede procedurer 16.
5. Påvisning af human albumin Sekretion og Beregning af kimære Rate
- For at måle human lever rekonstitution udføre humant albumin ELISA anvendelse af serum og et humant albumin ELISA-kit ifølge producentens instruktioner.
- Beregn det humaniserede leveren kimære sats ved real-time PCR-analyse af ekspressionsniveauer i hele-humaniserede leveren. Bestem den relative expression niveauforhold af human-specifik actin til human-muse cross actin (forhold 1), og forholdet af muse-specifik actin til human-muse cross actin (forhold 2). Den kimære beregnes som forholdet 1 / (forholdet 1 + forholdet 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alb-treck / SCID-mus hepatocytter udtrykker den humane DT receptor HB-EGF-genet under kontrol af en albuminpromotoren og udviser cytotoksiske virkninger efter DT administration 12. For at vurdere virkningerne af DT behandling på leverskade, blev DT doser på 1,5 ug / kg injiceret i 8 uger gamle Alb-treck / SCID-mus og de patologiske forandringer i timer efter DT administration lever 48 blev histologisk vurderet. Sammenlignet med kontrol mus (ikke behandlet med DT), DT-behandlede mus udviste en uorganiseret hepatisk arkitektur viser en korrektion for overbelastning med øget serum AST aktivitet. Desuden hepatocytterne af DT-behandlede mus havde flere, dybt farvede acidofile cytoplasmatiske inklusioner sammen med mørk nuclei (Sandsynligvis apoptotiske hepatocytter); nogle andre hepatocytter optrådte konserverede eller udviste en vakuolefyldt cytoplasma med mørke kerner med ringe eller ingen portåren inflammation (figur 1 12.
Humane HpSCs kan bruges til langsigtet in vitro dyrkning og udviser ensartet cellemorfologi med nogle ALB og færre CK19-positive celler. Ved 6 uger efter transplantation ind i muselevere blev de menneskelige HpSCs udsat for grundlæggende undersøgelse under et mikroskop og evalueret histologisk; blev observeret humane HpSCs at have rekonstituerede leveren struktur ved at udskifte de oprindelige muse hepatocytter (figur 2). Makroskopisk, 4 dage efter human HpSC transplantation, små humane hepatiske klynger, der blev fordelt ensartet omkring leveren blev detekteret; 45 dage efter transplantationen, havde disse spredt i store klynger (figur 3). Hvemle muselevere rekonstitueret med humane hepatocytter blev betegnet "humaniseret lever." Disse resultater viser, at mus med dødelig fulminant leversvigt, der undergår human HpSC transplantation kan udvise lever strukturer ligner dem observeret i normale mus lever.
Før afprøvning, om de umodne humane hepatocytter transplanteret ind mus havde potentiale til differentiering og kunne fungere in vivo, blev tilstedeværelsen af humane hepatocytter i muselevere først bekræftet ved immunohistokemisk analyse på ca. 6 uger efter human HpSC transplantation. Lever afsnit fra mus med 60% human cellerepopulation der specifikt og positivt samarbejde farves med menneskelige kerner og den menneskelige cytokeratin 8/18 (Ck8 / 18) antistoffer viste sig at indeholde donor celle-afledte humane hepatocytter, mens de oprindelige kontrol mus lever var negativ for disse markører (figur 4).
in vivo, blev ekspression af humant albumin (ALB) og human cytokeratin 19 (CK19) vurderede immunhistokemisk. Humane HpSC-afledte humane hepatocytter blev godt differentieret i muselevere og udstillet opreguleret human ALB udtryk. Humane ALB-positive og CK19-negative hepatocytter lignede funktionelle hepatocytter, mens celler, der positivt co-farvet med human ALB og CK19 udstillet bipotential evne til at differentiere i hepatocytter og cholangiocytes (Figur 5). En storstilet scanning metode til at analysere alle menneskelige HpSC-afledte humaniseret lever lapper afslørede tilstedeværelsen af flere runde og koloni-lignende klynger omkring leveren lapper med klare menneskelige kerner og Ck8 / 18 udtryk (figur 6), hvilket viser koloni dannende evne af humane HpSCs i de humaniserede lever. Genoprettelse nået op til 90%en måned efter transplantationen (figur 7A) og human albumin sekretion blev påvist i den genopbyggede mus lever (Figur 7B), hvilket indikerer, at de menneskelige HpSCs held kunne rekonstruere Alb-treck / SCID mus lever. Disse resultater viser, at humane HpSCs har stort potentiale for differentiering i funktionelle hepatocytter in vivo som reaktion på redningen af defekte mus leverfunktionen.
Figur 1. leverskader Optræder i Alb-treck / SCID (Toxin Receptor medieret Cell knockout) mus efter Difteri Toxin (DT) Injection. Histologi (hæmatoxylin-eosin farvning) af muselevere uden og med DT administration efter 48 timer. DT dosis: 1,5 ug / kg, serum AST aktivitet af normal lever (venstre panel): 30 IU / l; serum AST aktivitet af DT-behandlede lever (højre panel): 15000IU / L. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. transplantation af humane hepatiske stamceller til Alb-treck / SCID-mus med fulminant leversvigt. Makroskopisk visning (venstre felt) og histologisk analyse (hæmatoxylin-eosin-farvning, højre panel) af humaniserede lever med humane HpSCs 6 uger efter transplantation . m, muselever region; h, human donor celleafledt human region. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
<br /> Figur 3. Makroskopisk Analyse af humaniserede Lever fra humant Nedsat stamceller mærket med grønt fluorescerende protein. Høj forstørrelse billeder af leveren struktur 4 dage (venstre panel) og 45 dage (højre panel) efter transplantation med human hepatiske stilk celler (HpSCs). Humane hepatiske stamceller (HpSCs) blev mærket med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) med en lentivirus vektor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Karakterisering af humane hepatiske Stem celleafledt humane hepatocytter i Alb-treck / SCID-mus. Immunhistokemisk analyse skelne mellem humane hepatocytter farvet med anti-humant Ck8 / 18 (grøn) antigen og anti-h uman nuklear antigen (aqua blå) i humane hepatiske stamcelle-afledte humaniserede lever på 6 uger efter transplantation. m, muselever region; h, human donor celleafledt human lever region. Hvid stiplet linie: muselever region vs. human lever region. Kerner blev modfarvet med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (blå). Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. humane lever Stamceller Differentiering i Humaniserede lever fra Alb-treck / SCID-mus. Immunhistokemisk analyse af humant albumin og humane CK19 i HpSC-afledte lever 6 uger efter transplantation. Kerner blev modfarvet med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (blå). Scale barer = 100 um.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Flere Klynger af menneskelig Nedsat Stem Cell-afledte celler er til stede i Alb-treck / SCID mus med humaniserede Lever. Flere store klynger afledt af humane hepatiske stamceller blev identificeret i leveren lapper 6 uger efter transplantation af immunhistokemisk analyse for human Ck8 / 18 (grøn) og human nuclei (aqua blå). Scale barer = 1000 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. HumaniseredeLever Genbefolkning Vurder og human albumin Sekretion i Alb-treck / SCID mus. (A) Kimære sats i Alb-treck / SCID-mus 1 måned efter human hepatiske stamcelletransplantation; Dataene er angivet som middelværdi ± SEM (n = 12). Mann-Whitney-test: P <0,0005 for Sham og menneskelige HpSCs (B) Påvisning af humant albumin i mus sera en måned efter donor celle transplantation.. Data = middel ± SEM (n = 5). Mann-Whitney-test: P = 0,0313 for Sham og menneskelige HpSCs. ND: ikke påviselig; Sham: mus transplanteret med PBS; HpSCTx:. Mus transplanteret med humane HpSCs Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nylige undersøgelser har vist, at muse leveren kan genopbyggede med humane hepatocytter, herunder voksne hepatocytter og proliferative hepatiske stamceller 17. Disse repopulerede lever er blevet brugt som prækliniske eksperimentelle modeller for lægemiddelmetabolisme test og lægemiddelforskning og -udvikling 18; desuden har de givet en in vivo miljø for celle modning og differentiering 19. Den største mål med den foreliggende undersøgelse var at generere en ny leversygdom musemodel, der tillod menneskelige umodne hepatocytproliferation, modning og differentiering, til køb af narkotika stofskifte aktiviteter.
Forløbet af milten transplantation er blevet omfattende undersøgt. Celler transplanteret ind i milten hos rotter og mus overlever hele deres gennemsnitlige levetid. Den milten transplantation protokol har vist sig at være meget nyttigt i at undersøge specifikke forskningsspørgsmål;mange laboratorier verden over har forsøgt at udnytte denne protokol som en meget reproducerbar og pålidelig model for hepatisk celle transplantation på grund af den forbedrede mus overlevelse og lever regenerering. Men implantere celler i milten pulp udgør en risiko, da de fleste implanterede celler vil translokere til leveren, hvor de kan okkludere portal grene. Selvom denne okklusion kan være midlertidig, og måske ikke påvirke en sund lever miljø i tilfælde af allerede eksisterende leverskader, kunne denne procedure yderligere reducere leverfunktion og øge portal hypertension og måske også negativt påvirke celle transplantation. Selvom vi med succes har anvendt hepatocyttransplantation hjælp milten transplantation, flere spørgsmål berettige til yderligere undersøgelse, især genstand for potentielle nye celle kilder. Desuden, når du udfører milten hepatocyttransplantation, begrænse cellen belastning skal følges nøje for at undgå potentielle forstyrrelser afrest hepatisk mikrocirkulation. DT-receptoren er blevet identificeret som en membran-forankret form af det heparinbindende EGF-lignende vækstfaktor (HB-EGF-precursor) 20. Henviser HB-EGF forstadier afledt toksin-sensitive dyr, såsom mennesker og aber, binder DT og fungere som toksin-receptorer, HB-EGF prækursorer fra mus og rotter ikke binder DT 21. Det transgene Alb-treck / SCID-musemodellen udtrykker humane HB-EGF-lignende receptorer under kontrol af en levercelle-specifikke albuminpromotoren; efter administration af DT, disse mus udvikler fulminant leversvigt skyldes betinget ablation af hepatocytter, der giver plads til donorcelle hjemsted og proliferation. Humane hepatocytter, selv ved et umodent fase, er kendt for at besidde omfattende proliferativ kapacitet in vitro, selv om de mister deres lægemiddelmetabolisme funktioner, begrænse deres prækliniske programmer 22. Histologiske og immunhistokemiske resultater indsamlet på grundlag af transplantation af menneskelige HpSCs i Alb-treck / SCID-mus med dødelig fulminant leversvigt viste, at de menneskelige HpSCs kunne udvide og rekonstruere de beskadigede mus lever strukturer; genoprettelse sats i nogle mus var næsten 100%.
I vores eksperimenter, human HpSC transplantation fremmet mus overlevelse og resulterede i øget sekretion af human ALB i mus sera 16. Disse celler også modnet og differentieret in vivo og udstillet menneskelige lægemiddelmetabolisme aktiviteter, hvilket indikerer, at human HpSC-afledte humaniseret mus lever ligner modne og funktionelle "menneskelige organer", og har potentielle anvendelser i lægemiddeludvikling. Disse resultater bekræfter endvidere, at Alb-treck / SCID mus er en ideel model for humaniseret lever generation. Trods udsigterne og fordele ved Alb-treck / SCID mus som en ideel model for human hepatisk stamcelle-afledt humaniseret lever generation, de besidder en unik ulempe; når menneskelig annonceULT hepatocytter blev transplanteret i tre Alb-treck / SCID-mus behandlet med en enkelt dosis af DT, blev der ikke humaniserede lever genereret, muligvis fordi voksne humane hepatocytter mangler proliferativ kapacitet. Yderligere doser af DT ikke kan indgives efter transplantation af voksent menneske hepatocyt; da DT-receptoren (HB-EGF) i Alb-treck / SCID-mus hepatocytter er under kontrol af den albumin-promotoren, yderligere DT behandling vil ødelægge de transplanterede humane voksne hepatocytter i muselever.
Så vidt vi ved, er dette den første model til at generere et humaniseret leveren fra umodne humane celler. Cell dækningsgrad efter transplantationen er påvirket af modtageren mikro-miljø (f.eks hepatisk niche) og donor celle egenskaber, såsom moden vs. umodne og proliferativ og differentieret kapacitet. Kombinere Alb-treck / SCID med stamcelletransplantation vil give optimerede betingelser og fordele for generering af menneskeligeized lever. Dette udgør også et kraftfuldt værktøj til transplantation af føtale leverceller og potentielt samt iPS eller ES-afledte leverceller siden før DT behandling, de Alb-treck / SCID dyr holdes i en sund tilstand, leverskader er inducerbar på ethvert punkt, og musene yngler normalt uden nyreskade. I modsætning hertil uPA / SCID-mus udviser høj neonatal dødelighed og er vanskelige at opdrætte. Endvidere kan overekspression af urokinase i dyrene føre til alvorlig blødning og nyreskade og der er således en begrænsede muligheder for celle transplantation før fravænning; Alb-treck / SCID kan anvendes til celle transplantation på alle alderstrin.
Den vellykkede generation af et humaniseret lever mus kræver følgende kritiske trin: 1) Lever skade bør begrænses til subletale niveauer (som regel ved hjælp af dødelig dosis, 50%); 2) De humane primære føtale leverceller bør opretholdes i en sub-sammenflydende status ikke er større end 90%;3) Cell lækage indlæg milten-transplantation bør forhindres; og 4) bør overvåges Niveauerne af humant albumin i mus sera med jævne mellemrum. En omfattende forståelse af de kritiske faktorer involveret i processen med humaniseret mus lever generation kan bidrage til yderligere ændringer eller nye udviklinger udnytter rotter eller andre dyr. Mulige tilpasninger omfatter: induktion af nyreskade for behandlingen udvikling og reparation med menneskelige nefroner, deres forfædre og indsamle kanal celler og selv-samling af humane nefroner i tredimensionelle strukturer i musen krop; studere reparation af holmen skader i bugspytkirtlen ved brug pancreas stamceller / stamceller stammer fra direkte omprogrammeres IPS eller ES-celler. Eksempler på procesmodifikationer omfatter: kontrollerende væv eller organ skade med giftstoffer eller kemikalier såsom retrorsine, streptozotocin eller cisplatin at lette konkurrencen af donor celler med bopæl celler; undgådifferential eller faldende proliferation for at øge den proliferative evne af donorcellerne og dermed fremme udskiftningen af recipientceller, såsom ES- eller iPS- afledte celler; Valg af en passende transplantation sites og kontrollerende celle infusion for at sikre en effektiv transplantation, for eksempel ved anvendelse portalen eller halevenen for entopic transplantation og mesenterium og renal kapsel til ektopisk transplantation; overvågning udskiftningsstatus via ekspressionen af væv eller organ secernerede proteiner repræsenterer stamceller / progenitor eller umodne celler transplantation og cancer celle opsporing, såsom Alfaføtoprotein eller transferrin.
Sammenfattende Alb-treck / SCID-mus udgør en egnet model for human hepatiske stamcelletransplantation, da de giver en gavnlig miljø, der giver mulighed for differentiering til modne hepatocytter. Denne hidtil ukendte model har enormt applikativ potentiale, ikke alene til ex vivo-ekspansion af humane hepatocytter but også for narkotika skærme og afprøvning kandidat terapeutiske lægemidler til levertoksicitet og metabolisme. Desuden vil disse resultater hjælpe med udviklingen af fremtidige undersøgelser undersøge den kliniske anvendelse af denne teknik til human hepatisk celle transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
- Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
- Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
- Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
- Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
- Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
- Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
- Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
- Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
- Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
- Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
- Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
- Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
- Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
- Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
- Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
- Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).
