Protocol
Toutes les procédures expérimentales animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices de protection des animaux de l'Université de Yokohama City.
1. Génération du modèle hépatique aiguë blessures souris
- Ajouter 1 ml de solution phéniqué 0,85% NaCl (0,6 g de phénol dans 100 ml d'une solution de NaCl à 0,85%) à 1 mg de la toxine diphtérique (DT) pour faire un / ml DT solution mère 1 mg. Remarque: DT à une concentration de 1 mg / ml peut être stocké pendant environ 2 ans à 3 ° C à 8 ° C.
- Série diluer la solution 1 mg / ml de bouillon DT à 0,3 pg / ml de DT dans phéniqué une solution de NaCl à 0,85% et de préparer une aliquote de la solution DT / ml 0,3 pg comme solution de travail. Remarque: Cette solution de travail doit être fraîchement préparée.
- Pour effectuer des expériences en utilisant une dose sublétale (~ 50% de létalité), administrer les souris 8 semaines, âgé d'une dose / kg de 1,5 ug de DT.
- Effectuer une injection intrapéritonéale de DT en maintenant la souris en décubitus dorsal et insérez le needle ci-dessous le pli des genoux, à gauche ou à droite de la ligne médiane. Éviter la ligne médiane pour empêcher la pénétration de la vessie. Angle l'aiguille à environ 45 ° par rapport au corps.
- À l'aide d'une seringue à insuline, l'injection des souris avec 100 pi de fraîchement préparée de 0,3 pg / ml DT par 20 g de poids de souris. Par exemple, une souris de 18 g doit recevoir 90 ul de la solution DT / ml 0,3 ug.
- À post-injection de DT de 48 heures, un prélèvement de sang de la veine caudale en plaçant la souris dans un dispositif de retenue et en chauffant la queue de la souris dans un bain d'eau à 37 ° C pendant environ 10 minutes pour dilater les vaisseaux sanguins. Ensuite, faire un 1 mm nick dans la queue 2 cm de la pointe avec une lame de scalpel et de recueillir le sang avec un tube microcapillaire.
- Centrifuger le tube microcapillaire contenant le sang à 1500 g pendant 5 min et recueillir le sérum en séparant le surnageant et culot cellulaire.
- Pipette 50 ul de 01h20 sérum de souris diluée sur GOT / AST-PIII glisse. Mesurer l'absorbance du produit de réaction (colorant bleu) à 650 nm en utilisant un analyseur automatique de chimie sèche multi-usages selon le protocole du fabricant.
NOTE: La température lue de l'aspartate aminotransférase (AST) / activité transaminase glutamique oxaloacétique (GOT) est affiché automatiquement. 2 jours après l'injection DT, environ 60% des souris présentait des valeurs AST entre 12.000 - 16.000 UI / L et ont été considérés comme souffrant de lésions hépatiques aiguës. Ces souris ont été transférées dans une nouvelle cage et utilisés comme receveurs de greffes de cellules.
2. Préparation des hépatiques humains Cellules souches
- Isoler les cellules souches hépatiques humaines à partir de cellules hépatiques primaires humaines foetales avec un trieur de cellules en utilisant les antigènes cellulaires CDCP1, CD90 et CD66 pour obtenir une sous-population CDCP1 + CD90 + CD66-, puis ensemencer la population de cellules isolées sur des boîtes de culture de collagène IV-enrobés, comme indiqué précédemment 15. Utiliser des cellules primaires fœtales hépatiques humains d'un embryonâge entre les semaines 14 et 18.
- Recueillir les cellules souches hépatiques humaines cultivées à 80% - 90% de confluence sur des boîtes de culture de 100 mm, aspirer le milieu de culture, laver les cellules avec 10 ml de PBS, puis retirez le PBS. Trypsiniser les cellules avec une solution de trypsine / EDTA 2 ml 0,05% pendant 5 min à 37 ° C. Note: Les cellules à plus de 90% de la confluence ne conviennent pas pour une transplantation de cellules depuis la différenciation cellulaire peut influencer leur capacité proliférative chez la souris.
- Surveiller l'état de dispersion des cellules sous un microscope. Lorsque les cellules semblent flotter librement ou coulant, arrêter la digestion enzymatique par addition de 8 ml de DMEM / F12 contenant 10% de FBS.
- Les cellules en suspension lentement à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml et transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 100 xg et 4 ° C.
- remise en suspension avec précaution le culot cellulaire dans 10 ml de DMEM / F12 contenant 10% de FBS et déterminer le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage au microscope.
- Diviser les cellules dans 1,0 x 10 6 cellules par 50 pi de PBS aliquotes pour chaque souris individuelle et de stocker sur la glace jusqu'à la transplantation.
3. intraspléniques transplantation d'hépatiques humains Cellules souches
- Placez une cage propre sur un 37 ° C coussin chauffant électrique.
- Anesthésier la souris à l'aide d'isoflurane inhalation (1 - 1,5% (volume / volume) dans 2 litres d'oxygène par minute) en le plaçant au-dessous de la buse. Vous pouvez également utiliser des tubes contenant de la gaze imbibée d'isoflurane.
- Assurez-vous que la souris est anesthésiée par pincement légèrement la patte arrière. Si un réflexe est déclenchée, placez la souris en arrière dans la chambre. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Raser le site chirurgical en utilisant une tondeuse électrique et d'appliquer 70% (volume / volume) d'éthanol et de povidone-iode à stériliser. Ensuite, faire une 1 cm incision cutanée dans le flanc gauche juste au-dessous de la frontière costal des côtes, suivie par une incisionla paroi abdominale, ainsi que le péritoine.
- exposer soigneusement la rate. Utiliser une seringue de microinjection à 100 ul avec une aiguille 32 G 02/01 pouces pour injecter directement 1,0 x 10 6 cellules souches hépatiques humaines dans 50 ul de PBS dans la rate de chaque souris. Inclinez l'aiguille à un angle de 5 ° pour l'injection.
- Faire en sorte que la profondeur d'injection est inférieure à la moitié de l'épaisseur de la rate. L'aiguille doit entrer dans la rate à une extrémité (la tête) et déposer les cellules à l'autre extrémité (la queue).
- Pour éviter les fuites des cellules après l'injection, appliquer doucement la pression avec un doigt pendant 2 minutes puis retirer l'aiguille.
- Placez la rate dans le corps de la souris et fermer la cavité avec une suture de fonctionnement normal pour la musculature et de la peau.
- Transférer les souris dans une cage préchauffé à 37 ° C immédiatement après la transplantation. Pour assurer la souris est capable de respirer confortablement, placez la souris sur le côté dans la cage, unannuler le contact entre le lit de la cage et le site de l'intervention chirurgicale.
- Surveiller les souris jusqu'à ce que l'anesthésie se dissipe pour assurer les sutures restent fermées et les souris retour à des conditions de chirurgie pré.
- Veiller à la souris sont fournis avec de l'eau potable normale et de la nourriture. Au bout de 1 h, le retour de la cage dans la chambre de souris du centre de l'animal et de suivre les souris quotidiennement.
4. Détection de transplanté hépatique humaine souches hépatocytes cellulaires dérivées dans le foie de souris
Remarque: Pour les procédures suivantes, euthanasier tous les animaux à l'aide d'une surdose de kétamine et de xylazine suivie par dislocation cervicale.
- A 4 - 6 semaines après la transplantation, euthanasier les souris et ouvrir la cavité abdominale en coupant simultanément le derme et le fascia en utilisant des ciseaux chirurgicaux.
- Disséquer le tissu conjonctif au-dessus du péritoine, en utilisant les ciseaux comme un épandeur, et couper le péritoine le long de la ligne blanche pour ouvrir le péritonéalecavité.
- Soulevez le sternum avec une pince, percer le diaphragme, et couper à travers chaque côté du sternum à travers la ceinture cervicale.
- Sectionner la veine cave inférieure sur la face dorsale du foie et de tirer l'oesophage par le foie dans la direction antérieure. Retirer le diaphragme afin d'éliminer le foie.
Remarque: Veillez à garder les pointes des ciseaux étaient à la hausse afin d'éviter tout dommage aux organes thoraciques dessous. Le thymus a une tendance à se cramponner de temps en temps à la face dorsale du sternum et ceci doit être soigneusement évité. - Utiliser le diaphragme comme une poignée, commencer à tirer le foie hors de la cavité abdominale. La veine cave intérieure tiendra le foie en place. Couper la veine cave intérieure; veillez à ne pas libérer prématurément le droit surrénale.
Remarque: Les souris ont un foie à quatre lobes constitué d'un lobe médian, lobe gauche, lobe droit et le lobe caudé. La vésicule biliaire est suspendue dans la petite bifurcationle lobe médian. - Séparer les lobes de l'autre au niveau des jonctions et les incorporer dans la température optimale de coupe (OCT) Composé selon le protocole du fabricant. Congeler les PTOM contenant le tissu hépatique dans les grilles métalliques sur le cryostat.
- Couper des échantillons de sections 5 um d'épaisseur à l'aide d'un cryostat à -18 ° C et les monter sur des lames de microscope RT. Conserver le stock à -80 ° C. Préparer les lames de l' hématoxyline et de l' éosine (H & E) et coloration par immunofluorescence selon des procédés rapportés précédemment 16.
5. Détection de Human Albumine Sécrétion et calcul du taux chimériques
- Pour mesurer la reconstitution du foie humain, effectuer l'albumine humaine ELISA en utilisant du sérum et un kit ELISA humain d'albumine selon les instructions du fabricant.
- Calculer le taux chimérique du foie humanisé par analyse en temps réel PCR des niveaux d'expression dans l'ensemble-humanisé foie. Déterminer l'ex relatifpressure ratio de niveau d'actine humain spécifique à l'humain-souris de croix actine (rapport 1) et le rapport de l'actine de la souris spécifique à l'humain-souris de croix actine (rapport de 2). Le taux chimérique est calculé comme le rapport 1 / (rapport 1 + rapport 2).
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Representative Results
Alb-Treck / SCID hépatocytes de souris expriment le récepteur DT gène humain HB-EGF sous le contrôle d'un promoteur de l' albumine et présentent des effets cytotoxiques après l' administration de DT 12. Pour évaluer les effets du traitement DT sur les lésions du foie, des doses DT de 1,5 ug / kg ont été injectées dans des souris SCID 8 semaines vieux Alb-Treck / et les changements pathologiques dans l'h après administration du foie 48 DT ont été histologiquement évalués. Par rapport aux souris témoins (non traités avec DT), les souris traitées avec DT présentaient une architecture désorganisée hépatique présentant une correction pour la congestion à une augmentation de l'activité d'AST sérique. En outre, les hépatocytes de souris DT-traités avaient de multiples inclusions cytoplasmiques acidophiles fortement coloré, avec des noyaux sombres (plus probablement des hépatocytes apoptotiques); d'autres hépatocytes semblaient conservés ou exposés cytoplasme vacuole avec des noyaux sombres avec peu ou pas d' inflammation de la veine porte (Figure 1 12.
HPSCs humains peuvent être utilisés à long terme dans la culture in vitro et présentent une morphologie cellulaire uniforme avec certains ALB et moins de cellules CK19-positive. A 6 semaines après la transplantation dans les foies de souris, les hPSCs humains ont été soumis à un examen de base sous un microscope et histologiquement évalués; hPSCs humains ont été observés pour avoir reconstitué la structure du foie par le remplacement des hépatocytes de souris d' origine (figure 2). Macroscopiquement, à 4 jours après la transplantation HPSC humaine, de petites grappes hépatiques humaines qui ont été réparties uniformément autour du foie ont été détectés; à 45 jours après la transplantation, ceux - ci avaient proliféré dans de grands groupes (figure 3). Quile foie de souris reconstituées avec des hépatocytes humains ont été désignés par «humanisés foies». Ces résultats indiquent que les souris présentant une insuffisance hépatique fulminante mortelle qui subissent une transplantation HPSC humaine peuvent présenter des structures hépatiques similaires à celles observées dans le foie des souris normales.
Avant l'essai , si les hépatocytes humains transplantés chez des souris immatures ont le potentiel de différenciation et pourraient fonctionner in vivo, la présence d'hépatocytes humains dans le foie de souris a été confirmée par une analyse immunohistochimique à environ 6 semaines après la transplantation humaine HPSC. des sections de foie de souris avec 60% repopulation cellulaire humaine spécifiquement et positivement co-colorées avec des noyaux humains et de la cytokératine humaine 18/08 (/ 18 CK8) anticorps se sont révélés contenir des donneurs d'hépatocytes humains dérivés de cellules, tandis que les foies de souris témoins d'origine étaient négatif pour ces marqueurs (figure 4).
in vivo, l'expression de l' albumine humaine (ALB) et la cytokératine humaine 19 (CK19) a été évaluée par immunohistochimie. hépatocytes humains HPSC dérivés humains étaient bien différenciés dans les foies de souris et présentaient surexprimés expression ALB humaine. Les hépatocytes humains ALB-positif et CK19-négatives ressemblaient à des hépatocytes fonctionnels, alors que les cellules qui positivement co-colorées avec ALB humaine et CK19 exposa capacité bipotentiel pour se différencier en hépatocytes et cholangiocytes (figure 5). Une méthode de numérisation à grande échelle utilisée pour analyser tous les lobes de foie humain HPSC dérivés humanisés a révélé la présence de rondes multiples et des grappes de colonies comme entourant les lobes du foie avec des noyaux humains clairs et CK8 / 18 expression (figure 6), ce qui démontre la de colonies capacité de formation des hPSCs humaines dans les foies humanisés. Le niveau de repopulation atteint jusqu'à 90%un mois après la transplantation (figure 7A) et la sécrétion d'albumine humaine a été détectée dans les foies de souris repeuplée (figure 7b), ce qui indique que hPSCs humains pourraient reconstituer le succès Alb-TRECK / foie de souris SCID. Ces résultats démontrent que hPSCs humains ont un fort potentiel de différenciation en hépatocytes fonctionnels in vivo en réponse à la rescousse des fonctions de foie de souris défectueux.
Figure 1. dommages du foie se produit dans Alb-TRECK / SCID (Toxin Receptor Mediated cellulaire Knockout) Souris Après la toxine diphtérique (DT) Injection. Histologie (hématoxyline-éosine) de foies de souris avec et sans administration DT après 48 heures. DT dose: 1,5 ug / kg, activité sérique de l'AST du foie normal (panneau de gauche): 30 UI / L; activité sérique de l'AST du foie DT-traitée (droite): 15,000IU / L. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Transplantation des hépatiques humains des cellules souches dans Alb-TRECK Souris / SCID avec Échec fulminante hépatique. Vue macroscopique (panneau de gauche) et l' analyse histologique (hématoxyline-éosine, panneau de droite) de foies humanisés avec hPSCs humains à 6 semaines après la transplantation . m, dans la région du foie de la souris; h, donneur humain cellule dérivée région humaine. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
<br /> Figure 3. macroscopique Analyse des humanisés Livers dérivés des hépatiques humains Cellules souches Labellisées avec Green Fluorescent Protein. images haute grossissement de la structure du foie 4 jours (panneau de gauche) et 45 jours ( à droite) après la transplantation avec tige hépatique humaine des cellules (hPSCs). Cellules souches hépatiques humaines (hPSCs) ont été marquées avec une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) en utilisant un vecteur lentivirus. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Caractérisation des souches hépatiques humaines L' analyse immunohistochimique dérivé des cellules hépatocytes humains dans Alb-TRECK / souris SCID. Distinction entre les hépatocytes humains colorés avec CK8 / 18 (vert) antigène anti-humain et anti-h antigène nucléaire Uman (bleu aqua) dans souches hépatiques foies humanisés humains dérivés de cellules à 6 semaines après la transplantation. m, dans la région du foie de la souris; h, donneur humain cellule dérivée région du foie humain. Blanc ligne pointillée: région de foie de souris par rapport à la région du foie humain. Les noyaux ont été contre-colorées avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (bleu). Barres d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. hépatique humaine Cellules souches Différenciation dans humanisés Livers de Alb-TRECK / souris SCID. Immunohistochimique analyse de l' albumine humaine et CK19 humaine dans les foies HPSC dérivés à 6 semaines après la transplantation. Les noyaux ont été contre-colorées avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (bleu). Les barres d'échelle = 100 um.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Clusters multiples de Hépatique humain Cellules souches cellulaires dérivées sont présents dans Alb-TRECK / souris SCID avec humanisés Livers. Plusieurs grandes grappes dérivées de cellules souches hépatiques humains ont été identifiés dans les lobes du foie à 6 semaines après la transplantation par analyse immunohistochimique pour humaine CK8 / 18 (vert) et les noyaux humains (bleu aqua). Les barres d'échelle = 1000 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. humaniséFoie Taux de repopulation et Human Albumine Sécrétion dans Alb-TRECK / souris SCID. (A) Taux chimériques dans Alb-TRECK / SCID un mois suivant la transplantation hépatique de cellules souches humaines; les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 12). Mann-Whitney Test: P <0,0005 pour Sham et hPSCs humains (B) Détection de l' albumine humaine dans le sérum de la souris un mois après la transplantation de cellules du donneur.. Données = moyenne ± SEM (n = 5). Mann-Whitney Test: P = 0,0313 pour Sham et hPSCs humains. ND: indétectable; Sham: souris greffées avec du PBS; HpSCTx:. Souris transplantées avec hPSCs humains S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Des études récentes ont montré que le foie de souris peut être repeuplée avec des hépatocytes humains, y compris les hépatocytes adultes et des cellules souches hépatiques proliferatives 17. Ces foies repeuplés ont été utilisés comme modèles expérimentaux précliniques pour les tests de métabolisme des médicaments et de la découverte et le développement 18 médicaments; en outre, ils ont fourni un environnement in vivo pour la maturation et la différenciation cellulaire 19. L'objectif majeur de la présente étude était de générer un modèle de souris de la maladie du foie roman qui a permis la prolifération humaine immature des hépatocytes, la maturation et la différenciation, pour l'acquisition des activités de métabolisme des médicaments.
Le cours de la transplantation intrasplénique a été largement étudié. Les cellules transplantées dans le rate des rats et des souris survivent pendant toute leur durée de vie moyenne. Le protocole de transplantation intrasplénique a prouvé être très utile dans les enquêtes sur les questions de recherche spécifiques;de nombreux laboratoires dans le monde entier ont tenté d'utiliser ce protocole comme un modèle hautement reproductible et fiable pour la transplantation de cellules hépatiques en raison de l'amélioration de la survie des souris et le foie régénération. Cependant, l'implantation de cellules dans la pulpe splénique présente un risque, puisque la majorité des cellules implantées se translocation vers le foie où ils peuvent obstruer les branches du portail. Même si cette occlusion peut être temporaire et pourrait ne pas affecter un environnement de foie sain, dans les cas de lésions hépatiques préexistants, cette procédure pourrait encore réduire la fonction hépatique et augmenter l'hypertension portale et pourrait aussi influer négativement sur la greffe de cellules. Bien que nous ayons appliqué avec succès la transplantation d'hépatocytes en utilisant la transplantation intrasplénique, plusieurs questions méritent une étude plus approfondie, en particulier l'objet de nouvelles sources de cellules potentielles. En outre, lors de l'exécution intrasplénique transplantation d'hépatocytes, la limite cellule de charge doit être strictement respectée afin d'éviter toute perturbation potentielle parmicrocirculation hépatique reste. Le récepteur DT a été identifié comme une forme du facteur de liaison à l' héparine EGF-like growth (précurseur HB-EGF) 20 membrane ancrée. Considérant que les précurseurs HB-EGF provenant d'animaux sensibles à la toxine, tels que les humains et les singes, se lient DT et fonctionnent comme des récepteurs de la toxine, les précurseurs HB-EGF de souris et les rats ne lient pas DT 21. Le / modèle transgénique souris SCID Alb-TRECK exprime des récepteurs HB-EGF humains sous le contrôle d'un foie spécifique à la cellule albumine promoteur; après l'administration de DT, ces souris développent une insuffisance hépatique fulminante due à l'ablation conditionnelle des hépatocytes, offrant un espace de résidence de la cellule donneuse et de la prolifération. Les hépatocytes humains, même à une phase immature, sont connus pour posséder une vaste capacité proliférative in vitro, bien qu'ils perdent leurs fonctions de métabolisme des médicaments, ce qui limite leurs applications précliniques 22. Les résultats histologiques et immunohistochimiques obtenus suite à la transplantation de hPSCs humains dans Alb-TRECK souris / SCID avec insuffisance hépatique fulminante mortelle a indiqué que les hPSCs humaines pourraient se développer et reconstituer les structures de foie de souris endommagées; le taux de repopulation chez certaines souris était presque 100%.
Dans nos expériences, la transplantation humaine HPSC promu la survie des souris a entraîné une augmentation de la sécrétion ALB humaines dans le sérum de souris 16. Ces cellules aussi mûri et différenciée in vivo et présentaient des activités de métabolisme des médicaments humains, ce qui indique que les foies de souris humains HPSC dérivés humanisés sont similaires à mûrir et "organes humains" fonctionnels et ont des applications potentielles dans le développement de médicaments. Ces résultats confirment en outre que le Alb-TRECK / souris SCID est un modèle idéal pour la production de foie humanisé. Malgré les perspectives et les avantages de Alb-TRECK / souris SCID comme un modèle idéal pour la tige hépatique humanisé génération de foie provenant d'une cellule humaine, ils possèdent un inconvénient unique, lorsque l'annonce humainehépatocytes ult ont été transplantées dans trois Alb-Treck / souris SCID traitées avec une dose unique de DT, aucun foies humanisés ont été générés, probablement parce que les hépatocytes adultes humains manquent de capacité proliférative. Des doses supplémentaires de DT ne peuvent être administrés après la transplantation d'hépatocytes humain adulte; puisque le récepteur DT (HB-EGF) dans Alb-TRECK / souris SCID hépatocytes est sous le contrôle du promoteur de l'albumine, le traitement DT supplémentaire va détruire les hépatocytes humains transplantés adultes dans le foie de la souris.
Au meilleur de notre connaissance, ce modèle est le premier à produire un foie humanisé à partir de cellules humaines immatures. Taux de remplacement cellulaire post-transplantation est influencée par le bénéficiaire micro-environnement (par exemple, niche hépatique) et les propriétés des cellules du donneur, comme matures vs immatures et proliférative et la capacité différentielle. La combinaison de Alb-TRECK / SCID avec la transplantation de cellules souches offrira des conditions et avantages optimisés pour la génération de l'hommefoies lisés. Cela constitue également un outil puissant pour la transplantation de cellules fœtales hépatiques et potentiellement, ainsi que iPS ou ES dérivées des cellules hépatiques depuis avant le traitement DT, les / animaux SCID Alb-Treck sont maintenues dans un état de santé, des dommages au foie est inductible à tout point et les souris se reproduisent normalement sans lésions rénales. En revanche, les souris uPA / SCID présentent une mortalité néonatale élevée et sont difficiles à reproduire. En outre, la surexpression de l'urokinase chez les animaux peut conduire à des hémorragies graves et des lésions rénales et donc il y a une fenêtre d'opportunité limitée pour la transplantation cellulaire avant le sevrage; Alb-TRECK / SCID peut être utilisé pour la transplantation de cellules à tout âge.
La génération réussie d'une souris du foie humanisé nécessite les étapes essentielles suivantes: 1) lésion hépatique doit être limitée à des niveaux sub-létaux (généralement en utilisant la dose létale, 50%); 2) Les cellules humaines de foie foetal primaires doivent être maintenus dans un état sous-confluentes pas supérieure à 90%;3) les fuites de cellules après intrasplénique-transplantation doit être évité; et 4) Les taux d'albumine humaine dans le sérum de la souris doivent être surveillés à intervalles réguliers. Une compréhension approfondie des facteurs critiques impliqués dans le processus de génération humanisé de foie de souris pourrait contribuer à d'autres modifications ou de nouveaux développements en utilisant des rats ou d'autres animaux. adaptations possibles: l'induction de lésions rénales pour examiner le développement et la réparation des néphrons humains, leurs progéniteurs, et la collecte de cellules des canaux et l'auto-assemblage des néphrons humains en trois structures tridimensionnelles dans le corps de la souris; l'étude de la réparation des dommages des îlots dans le pancréas en utilisant des cellules souches / progénitrices pancréatiques dérivées de directement reprogrammées, iPS ou cellules ES. Des exemples de modifications de processus comprennent: des tissus ou des blessures d'organes avec des toxines ou des produits chimiques tels que rétrorsine, streptozotocine, ou le cisplatine pour faciliter la concurrence des cellules du donneur avec des cellules résidentes de contrôle; éviterou la prolifération différentielle décroissante afin d'augmenter la capacité proliférative des cellules du donneur, favorisant ainsi le remplacement des cellules réceptrices, telles que des cellules ES ou IPS dérivées; la sélection d'un des sites de transplantation appropriés et en contrôlant la perfusion de cellules pour assurer une transplantation efficace, par exemple, en utilisant le portail ou la veine caudale pour la transplantation entoptiques et le mésentère et la capsule rénale pour la transplantation ectopique; surveillance de l'état de remplacement par l'expression de tissu ou d'organe protéines sécrétées représentatif de souches / progénitrices ou des cellules et la transplantation des cellules cancéreuses traçage immature, comme foetoprotéine alpha ou transferrine.
En résumé, des souris SCID-souabe TRECK / constituent un modèle approprié pour la transplantation hépatique de cellules souches humaines, car ils fournissent un environnement favorable qui permet de se différencier en hépatocytes matures. Ce nouveau modèle dispose d'un potentiel énorme applicative, non seulement pour l' expansion ex vivo des hépatocytes humains but aussi pour les écrans de la drogue et des médicaments candidats pour tester la toxicité hépatique et le métabolisme. En outre, ces résultats aideront à l'avancement des études futures examinant l'application clinique de cette technique pour la transplantation de cellules hépatiques humaines.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
- Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
- Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
- Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
- Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
- Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
- Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
- Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
- Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
- Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
- Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
- Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
- Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
- Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
- Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
- Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
- Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).
