Protocol
Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida protezione degli animali di Yokohama City University.
1. generazione del modello Acute Liver Injury mouse
- Aggiungere 1 ml di soluzione di NaCl 0,85% fenicato (0,6 g di fenolo in 100 ml di soluzione 0,85% di NaCl) a 1 mg tossina difterica (DT) per fare un / ml di soluzione DT 1 mg. Nota: DT ad una concentrazione di 1 mg / ml può essere conservato per circa 2 anni 3 ° C e 8 ° C.
- In serie diluire la soluzione 1 mg / ml DT stock da 0,3 mg / ml in DT 0,85% soluzione fenicato NaCl e preparare una aliquota della soluzione DT / ml 0,3 mg come soluzione di lavoro. Nota: Questa soluzione di lavoro deve essere preparata.
- Per condurre esperimenti utilizzando una dose subletale (~ 50% di mortalità), amministrare 8 settimane di età topi una dose / kg 1,5 mg di DT.
- Eseguire un'iniezione intraperitoneale di DT Tenendo premuto il mouse in decubito dorsale e inserire il needle sotto la curva del ginocchio, a sinistra oa destra della linea mediana. Evitare la linea mediana per impedire la penetrazione della vescica. Angolo l'ago di circa 45 ° rispetto al corpo.
- Utilizzando una siringa da insulina, iniettare i topi con 100 ml di appena preparato 0,3 mcg / ml DT per 20 g di peso mouse. Ad esempio, un 18-g mouse dovrebbe ricevere 90 microlitri della soluzione DT / ml 0,3 mg.
- A iniezione alberino DT 48 hr, raccogliere il sangue dalla vena della coda posizionando il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e riscaldando la coda di topo in un bagno d'acqua a 37 ° C per circa 10 minuti per dilatare i vasi sanguigni. Poi, fare un 1 mm nick nella coda due centimetri dalla punta con una lama di bisturi tagliente e raccogliere il sangue con un microcapillare.
- Centrifugare la microcapillare contenente il sangue a 1500 xg per 5 minuti e raccogliere il siero separando il surnatante e cellule pellet.
- Pipettare 50 ml di siero di topo 1:20 diluito Onto GOT / AST-PIII scivola. Misurare l'assorbanza del prodotto di reazione (colorante blu) a 650 nm utilizzando un multi-purpose analizzatore automatico di chimica a secco secondo il protocollo del produttore.
NOTA: Il read-out di aspartato aminotransferasi (AST) / glutammico attività transaminasi ossalacetica (GOT) viene visualizzato automaticamente. 2 giorni dopo l'iniezione DT, circa il 60% dei topi esposti valori AST tra 12.000 - 16.000 IU / L e sono stati considerati di essere affetti da danni al fegato acuto. Questi topi sono stati trasferiti ad una nuova gabbia e utilizzati come trapianto di cellule.
2. Preparazione di epatici umani cellule staminali
- Isolare le cellule staminali epatiche umane da cellule di fegato umano primario fetale con un cell sorter utilizzando gli antigeni cellulari CDCP1, CD90, CD66 e di ottenere una sottopopolazione CDCP1 + CD90 + CD66-, poi seminare la popolazione di cellule isolato su piatti della cultura collagene IV-rivestiti, come riportato in precedenza 15. Uso primario cellule epatiche fetali umane di un embrioneetà tra le settimane 14 e 18.
- Raccogliere le cellule staminali epatiche umane in coltura al 80% - 90% di confluenza su piastre di coltura da 100 mm, aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule con 10 ml di PBS, e quindi rimuovere il PBS. Trypsinize le cellule con soluzione di tripsina / EDTA 2 ml 0,05% per 5 min a 37 ° C. Nota: Le celle a maggiore del 90% di confluenza non sono adatti per il trapianto di cellule dal differenziamento cellulare può influenzare la loro capacità proliferativa nei topi.
- Monitorare lo stato di dispersione di cellule al microscopio. Quando le cellule sembrano essere flottante o scorre liberamente, fermare la digestione enzimatica aggiungendo 8 ml di DMEM / F12 contenente 10% FBS.
- Sospendere le cellule lentamente utilizzando una pipetta sierologica 10 ml e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare le cellule per 5 min a 100 xg e 4 ° C.
- risospendere delicatamente il pellet cellulare in 10 ml DMEM / F12 contenente il 10% FBS e determinare il numero di cellule utilizzando una camera di conteggio microscopio.
- Dividere le cellule in 1,0 x 10 6 cellule per 50 ml di PBS aliquote per ogni singolo mouse e memorizzare in ghiaccio fino trapianto.
3. intrasplenico Il trapianto di cellule staminali epatiche umane
- Posizionare una gabbia pulita su una C rilievo di riscaldamento elettrico 37 °.
- Anestetizzare il mouse con isoflurano inalazione (1 - 1,5% (vol / vol) in 2 L di ossigeno per min) ponendolo sotto l'ugello. In alternativa, utilizzare provette contenenti garza imbevuta con isoflurano.
- Assicurarsi che il mouse è anestetizzato con una leggera pizzicando la zampa posteriore. Se un coglione ginocchio è suscitato, posizionare il mouse di nuovo nella camera. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Shave il sito chirurgico utilizzando cesoie elettriche e applicare il 70% (/ vol vol) di etanolo e iodopovidone per sterilizzare. Poi fare un 1-cm incisione cutanea nel fianco sinistro appena sotto il bordo costiera delle nervature, seguita da un'incisionela parete addominale, così come il peritoneo.
- esporre con cura la milza. Utilizzare una siringa microiniezione da 100 ml con una 32-ago G 1/2-inch per iniettare direttamente 1,0 x 10 6 cellule staminali epatiche umane in 50 microlitri di PBS nella milza di ogni mouse. Inclinare l'ago con un angolo di 5 ° per l'iniezione.
- Assicurarsi che la profondità di iniezione è inferiore alla metà dello spessore della milza. L'ago deve entrare milza ad una estremità (testa) e depositare le cellule all'altra estremità (coda).
- Per evitare perdite delle cellule dopo l'iniezione, applicare delicatamente pressione con un dito per 2 minuti e poi rimuovere l'ago.
- Posizionare la milza nuovamente dentro il corpo del mouse e chiudere la cavità con un normale sutura continua per la muscolatura e la pelle.
- Trasferire i topi in una gabbia di 37 ° C pre-riscaldato subito dopo il trapianto. Per assicurare il mouse è in grado di respirare comodamente, posizionare il mouse sul lato nella gabbia, uninvalidare contatto tra la biancheria gabbia e il sito chirurgico.
- Monitorare i topi fino a quando l'anestesia svanisce per garantire le suture rimangono chiusi e topi tornare al pre-chirurgia condizioni.
- Assicurarsi che i topi sono dotati di normale acqua potabile e cibo. Dopo 1 ora, tornare la gabbia alla stanza del mouse del centro animale e monitorare i topi al giorno.
4. Individuazione di trapiantati epatici umani staminali epatociti derivati dalle cellule del fegato di topo
Nota: Per le seguenti procedure, eutanasia tutti gli animali che utilizzano una overdose di ketamina e xilazina seguita da dislocazione cervicale.
- A 4 - 6 settimane dopo il trapianto, i topi eutanasia e aprire la cavità addominale, tagliando contemporaneamente la cute e la fascia con le forbici chirurgiche.
- Sezionare il tessuto connettivo sopra il peritoneo, usando le forbici come un diffusore, e tagliare il peritoneo lungo la linea alba per aprire la peritonealecavità.
- Sollevare lo sterno con una pinza, forare la membrana, e tagliare ogni lato dello sterno attraverso la cintura cervicale.
- Sever vena cava sul lato toracica del fegato e tirare l'esofago attraverso il fegato in direzione anteriore. Rimuovere il diaframma per rimuovere il fegato.
Nota: Fare attenzione a tenere le punte delle forbici puntate verso l'alto al fine di prevenire eventuali danni agli organi toracici sotto. Il timo ha la tendenza ad aggrapparsi occasionalmente lato dorsale dello sterno e questo deve essere evitato con attenzione. - Usando il diaframma come maniglia, inizia a tirare il fegato fuori della cavità addominale. La vena cava interno terrà il fegato a posto. Tagliare la vena cava interno; fare attenzione a non liberare prematuramente il surrene destro.
Nota: I topi hanno un fegato quadrilobata costituito da un lobo mediano, lobo sinistro, lobo destro, e il lobo caudato. La cistifellea è sospeso nella piccola biforcazione dilobo mediano. - Separare i lobi gli uni dagli altri alle giunzioni e incorporarli in mescola ottimale temperatura di taglio (OCT) secondo il protocollo del produttore. Congelare personalizzazione di Office che contiene il tessuto epatico nelle griglie metalliche sulla criostato.
- Tagliare le sezioni di esempio 5-micron di spessore con un criostato a -18 ° C e montarli su vetrini da microscopio RT. Conservare lo stock a -80 ° C. Preparare i vetrini per ematossilina e eosina (H & E) e immunofluorescenza secondo le procedure precedentemente riportati 16.
5. Individuazione di Human Albumina secrezione e il calcolo del tasso chimerico
- Per misurare la ricostituzione fegato umano, eseguire albumina umana ELISA utilizzando siero e albumina umana kit ELISA secondo le istruzioni del produttore.
- Calcolare il fegato tasso chimerico umanizzato da analisi in tempo reale PCR dei livelli di espressione di tutta-umanizzato fegato. Determinare il relativo exrapporto del livello di pressione di actina specifico umano a umano-topo croce actina (rapporto 1) e il rapporto di actina specifiche mouse umano-topo croce actina (rapporto 2). Il tasso chimerico viene calcolato come rapporto 1 / (rapporto 1 + rapporto 2).
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Representative Results
Alb-treck / epatociti topi SCID esprimono il recettore DT HB-EGF gene umano sotto il controllo di un promotore di albumina e mostrano effetti citotossici in seguito alla somministrazione DT 12. Per valutare gli effetti del trattamento DT sul danno epatico, DT dosi di 1,5 mcg / kg sono state iniettate in 8 settimane di età Alb-Treck / topi SCID e le alterazioni patologiche nel hr postale amministrazione DT fegato 48 sono stati valutati istologicamente. Rispetto ai topi di controllo (non trattati con DT), i topi trattati hanno mostrato DT-un'architettura epatica disorganizzato che mostra una correzione per la congestione con un aumento dell'attività del siero di AST. Inoltre, gli epatociti di topi DT-trattati hanno avuto molteplici, profondamente colorato inclusioni citoplasmatiche acidofile insieme con i nuclei scuro (molto probabilmente epatociti apoptotici); alcuni altri epatociti apparivano conservati o esposti un citoplasma vacuolato con i nuclei scuri con poca o nessuna vena infiammazione (Figura 1 12.
HpSCs umani possono essere utilizzati a lungo termine in coltura in vitro e mostrano la morfologia delle cellule uniforme con qualche ALB e un minor numero di cellule CK19-positivi. A 6 settimane dopo il trapianto di fegato nei topi, i HpSCs umani sono stati sottoposti ad esame di base sotto un microscopio e istologicamente valutati; sono stati osservati HpSCs umani aver ricostituito la struttura fegato sostituendo epatociti di topo originali (Figura 2). Macroscopicamente, a 4 giorni dopo il trapianto su esseri umani HPSC, piccoli grappoli epatiche umane che sono stati distribuiti in modo uniforme in tutto il fegato sono stati rilevati; a 45 giorni dopo il trapianto, questi avevano proliferato in grandi gruppi (Figura 3). Chifegato di topo le ricostituiti con epatociti umani sono stati designati "fegato umanizzati". Questi risultati indicano che i topi con letale insufficienza epatica fulminante che subiscono il trapianto HPSC umano possono presentare strutture fegato simili a quelli osservati nelle normali fegato di topo.
Prima di testare se epatociti umani immaturi trapiantate in topi avevano il potenziale di differenziazione e potrebbe funzionare in vivo, la presenza di epatociti umani in fegati di topo è stato confermato mediante analisi immunoistochimica a circa 6 settimane dopo il trapianto HPSC umana. sezioni di fegato di topi con il 60% ripopolamento cellula umana che specificatamente e positivamente co-macchiato di nuclei umani e citocheratina umana 8/18 (18 / CK8) anticorpi sono stati trovati per contenere donatore di cellule derivate da epatociti umani, mentre il fegato dei topi di controllo originali sono stati negativo per questi marcatori (Figura 4).
in vivo, l'espressione di albumina umana (ALB) e citocheratina umana 19 (CK19) è stata valutata immunoistochimica. Umani epatociti umani HPSC-derivati erano ben differenziate nel fegato di topo ed esposto upregulated espressione ALB umana. Epatociti umani ALB-positivi e negativi CK19-assomigliavano epatociti funzionali, mentre le cellule che positivamente co-colorate con ALB umana e CK19 espone capacità bipotente per differenziare in epatociti e colangiociti (Figura 5). Un metodo di scansione su larga scala utilizzata per analizzare tutti HPSC-derivati lobi del fegato umanizzati umani ha rivelato la presenza di turno multipla e cluster colonie come circondano i lobi del fegato con nuclei umani chiari e CK8 / 18 espressione (Figura 6), a dimostrazione della Formanti Colonie la formazione di capacità di HpSCs umani nel fegato umanizzato. Il livello ripopolamento raggiunto fino al 90%un mese dopo il trapianto (Figura 7A) e la secrezione di albumina umana è stata rilevata nel fegato di topi ripopolati (Figura 7b), indicando che HpSCs umane potrebbero ricostituire con successo il fegato di topo Alb-TRECK / SCID. Questi risultati dimostrano che HpSCs umani hanno un alto potenziale di differenziazione in epatociti funzionali in vivo in risposta al salvataggio di funzioni del fegato del mouse difettosi.
Figura 1. danni al fegato si verifica in Alb-TRECK / SCID (Tossina Receptor Mediated cellulare Knockout) Mouse Dopo la tossina difterica (DT) di iniezione. Istologia (ematossilina-eosina) di fegato di topo senza e con l'amministrazione DT dopo 48 ore. DT Dosi: 1,5 mg / kg, il siero attività AST di fegato normale (pannello di sinistra): 30 IU / L; siero attività dell'AST di fegato DT-trattati (pannello di destra): 15000IU / L. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Il trapianto di cellule staminali epatiche umane in Alb-TRECK Mice / SCID con insufficienza epatica fulminante. Visione macroscopica (pannello di sinistra) e l'analisi istologica (ematossilina-eosina, pannello di destra) di fegato umanizzati con HpSCs umani a 6 settimane dopo il trapianto . m, regione fegato di topo; h, donatore di cellule umane di derivazione umana regione. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
<br /> Figura 3. Analisi macroscopica di umanizzati Livers derivate da epatici umani cellule staminali etichettati con proteina fluorescente verde. Le immagini ad alta ingrandimento della struttura del fegato 4 giorni (pannello di sinistra) e 45 giorni (pannello di destra) dopo il trapianto con cellule staminali epatiche umane cellule (HpSCs). Le cellule staminali epatiche umane (HpSCs) sono stati etichettati con maggiore proteina fluorescente verde (EGFP) utilizzando un vettore lentivirus. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Caratterizzazione di epatica umana staminali L'analisi immunoistochimica derivato dalle cellule epatociti umani in Alb-TRECK / topi SCID. Distinguendo tra epatociti umani colorati con 18 (verde) l'antigene anti-umano CK8 / e anti-h antigene nucleare Uman (Aqua Blue) in umani staminali epatiche derivati dalle cellule fegato umanizzati a 6 settimane dopo il trapianto. m, regione fegato di topo; h, donatore di cellule umane di derivazione regione del fegato umano. Bianco linea tratteggiata: regione fegato di topo vs. regione fegato umano. I nuclei sono stati di contrasto con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (blu). Barre di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. epatica umana cellule staminali Differenziazione in umanizzati Livers di Alb-TRECK / topi SCID. Immunoistochimica analisi di albumina umana e CK19 umana nel fegato HPSC derivati a 6 settimane dopo il trapianto. I nuclei sono stati di contrasto con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (blu). Barre di scala = 100 micron.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. più cluster di epatica umana Cellule Staminali derivato dalle cellule sono presenti in Alb-TRECK / topi SCID con umanizzati Livers. Più grandi cluster derivate da cellule staminali epatiche umane sono state identificate nei lobi del fegato a 6 settimane dopo il trapianto da analisi immunoistochimica per umano CK8 / 18 (verde) e nuclei umani (Aqua blue). Barre di scala = 1.000 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. umanizzatoFegato Ripopolamento Rate e umana albumina secrezione in Alb-TRECK / topi SCID. (A) tasso chimerico in Alb-TRECK / SCID topi 1 mese dopo trapianto di cellule staminali epatiche umane; dati sono presentati come media ± SEM (n = 12). Test di Mann-Whitney: P <0.0005 per Sham e HpSCs umani (B) Individuazione di albumina umana nel siero del mouse il mese successivo trapianto di cellule del donatore.. Dati = media ± SEM (n = 5). test di Mann-Whitney: P = 0,0313 per Sham e HpSCs umani. ND: non rilevabile; Sham: topi trapiantati con PBS; HpSCTx:. Topi trapiantati con HpSCs umani Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Recenti studi hanno dimostrato che il fegato del mouse può essere ripopolata con epatociti umani, tra cui epatociti adulte e cellule staminali epatiche proliferative 17. Questi fegati ripopolati sono stati utilizzati come modelli sperimentali preclinici per i test metabolismo dei farmaci e scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo 18; Inoltre, essi hanno fornito un ambiente in vivo per la maturazione delle cellule e differenziazione 19. Il principale obiettivo di questo studio è stato quello di generare un modello di topo malattia del fegato romanzo che ha permesso la proliferazione umana immatura degli epatociti, la maturazione e la differenziazione, per l'acquisizione delle attività di metabolismo dei farmaci.
Il corso di trapianto di intrasplenico è stata ampiamente studiata. Le cellule trapiantate nella milza di topi e ratti sopravvivono per tutta la loro vita media. Il protocollo di trapianto intrasplenico ha dimostrato di essere molto utile nelle indagini domande di ricerca specifiche;molti laboratori di tutto il mondo hanno cercato di utilizzare questo protocollo come un modello altamente riproducibile e affidabile per il trapianto di cellule epatiche a causa della rigenerazione di sopravvivenza topi e del fegato migliorata. Tuttavia, impiantando cellule nella polpa splenica pone un rischio, poiché la maggior parte delle cellule impiantate sarà traslocare al fegato dove possono occludere rami portali. Anche se questo occlusione può essere temporanea e potrebbe non interessare un ambiente fegato sano, nei casi di preesistente danni al fegato, questa procedura potrebbe ridurre ulteriormente la funzionalità epatica e aumentare ipertensione portale e potrebbe anche influenzare negativamente l'attecchimento delle cellule. Anche se abbiamo applicato con successo il trapianto di epatociti con il trapianto intrasplenico, diverse questioni meritano ulteriori studi, in particolare oggetto di potenziali nuove fonti di cellule. Inoltre, quando si esegue il trapianto di epatociti intrasplenico, il limite di carico cella deve essere rigorosamente rispettata al fine di evitare potenziali disturbi damicrocircolazione epatica residuo. Il recettore DT è stato identificato come una forma membrana ancorata del fattore eparina-binding EGF-like growth (HB-EGF precursore) 20. Mentre precursori HB-EGF derivati da animali tossina-sensibili, come gli esseri umani e scimmie, legano DT e funzionano come recettori della tossina, precursori HB-EGF da topi e ratti non si legano DT 21. Il / modello di topo transgenico SCID Alb-TRECK esprime recettori HB-EGF-come l'essere umano sotto il controllo di una specifica cellula promotore dell'albumina fegato; dopo la somministrazione di DT, questi topi sviluppano insufficienza epatica fulminante a causa di ablazione condizionale di epatociti, fornendo spazio per la residenza cellula donatrice e la proliferazione. Epatociti umani, anche in una fase immatura, sono noti per possedere ampia capacità proliferativa in vitro, anche se perdono le loro funzioni metabolismo dei farmaci, limitando le loro applicazioni precliniche 22. reperti istologici e immunoistochimici ottenuti in seguito Transplantation di HpSCs umani in Alb-TRECK topi / SCID con letale insufficienza epatica fulminante ha indicato che i HpSCs umani potrebbero espandersi e ricostituire le strutture del fegato del mouse danneggiate; il tasso di ripopolamento in alcuni topi era quasi al 100%.
Nei nostri esperimenti, il trapianto HPSC umano promosso la sopravvivenza del mouse e ha provocato un aumento della secrezione di ALB umano in siero del mouse 16. Queste cellule anche maturati e differenziata in vivo ed esposte le attività umane metabolismo dei farmaci, indicando che il fegato di topi umanizzati HPSC-derivati umani sono simili a maturare e funzionali "organi umani" e hanno potenziali applicazioni in fase di sviluppo dei farmaci. Questi risultati confermano inoltre che l'Alb-TRECK / SCID mouse è un modello ideale per la generazione del fegato umanizzato. Nonostante le prospettive e vantaggi di Alb-TRECK / topi SCID come un modello ideale per la generazione di fegato umano staminali epatiche derivato dalle cellule umanizzato, che possiedono uno svantaggio unico; quando ad umanoepatociti ULT sono stati trapiantati in tre Alb-Treck / topi SCID trattati con una singola dose di DT, non fegati umanizzati sono stati generati, forse perché gli epatociti adulti umani mancano di capacità proliferativa. Ulteriori dosi di DT non possono essere somministrati trapianto carica di epatociti umano adulto; poiché il recettore DT (HB-EGF) in Alb-treck / epatociti topi SCID è sotto il controllo del promotore dell'albumina, trattamento supplementare DT distruggerà epatociti umani adulti trapiantate nel fegato di topo.
Per quanto a nostra conoscenza, questo è il primo modello per generare un fegato umanizzato da cellule umane immature. Tasso di sostituzione cellulare post-trapianto è influenzata dal beneficiario micro-ambiente (ad esempio, nicchia epatica) e le proprietà delle cellule del donatore, come maturo vs. immaturi e proliferativa e capacità differenziale. La combinazione di Alb-TRECK / SCID con trapianto di cellule staminali fornirà condizioni ottimizzate e vantaggi per la generazione di umanafegati ized. Ciò costituisce anche un potente strumento per il trapianto di cellule fetali del fegato e potenzialmente così come iPS o ES-derivati cellule epatiche da prima del trattamento DT, i / animali SCID Alb-Treck sono mantenuti in uno stato sano, danni al fegato è inducibile in qualsiasi punto, ei topi si riproducono normalmente senza danno renale. Al contrario, uPA / topi SCID mostrano elevata mortalità neonatale e sono difficili da allevare. Inoltre, la sovraespressione di urochinasi negli animali può portare a gravi emorragie e danni renali, e quindi vi è una limitata finestra di opportunità per il trapianto di cellule prima di svezzamento; Alb-TRECK / SCID può essere utilizzato per il trapianto di cellule a qualsiasi età.
La generazione di successo di un topo umanizzato fegato richiede i seguenti passaggi critici: 1) lesione epatica deve essere limitato ai livelli sub-letali (di solito usando la dose letale, 50%); 2) Le cellule epatiche fetali umani primari devono essere mantenuti in uno stato sub-confluenti non superiore al 90%;3) Perdita cellula post-trapianto intrasplenico dovrebbe essere evitato; e 4) I livelli di albumina umana nel siero del mouse deve essere monitorata ad intervalli regolari. Una comprensione completa dei fattori critici coinvolti nel processo di generazione di fegato umanizzato mouse potrebbe contribuire a ulteriori modifiche o nuovi sviluppi che utilizzano topi o altri animali. Possibili adattamenti includono: l'induzione di danno renale per l'esame lo sviluppo e la riparazione con nefroni umani, i loro progenitori, e la raccolta di cellule del dotto e l'auto-assemblaggio di nefroni umani in strutture tridimensionali nel corpo del mouse; studiare la riparazione di danni isolotto nel pancreas utilizzando cellule staminali / progenitrici pancreatiche derivate da, IPS, o cellule ES direttamente riprogrammate. Esempi di modifiche di processo sono: il controllo dei tessuti o lesioni organo con tossine o sostanze chimiche come retrorsine, streptozotocina, o cisplatino per facilitare la concorrenza di cellule del donatore con le cellule residenti; evitandodifferenziale o la proliferazione in diminuzione, al fine di accrescere la capacità proliferativa delle cellule del donatore, promuovendo in tal modo la sostituzione delle cellule riceventi, come ES o iPS- cellule derivate; selezionando un adeguato siti trapianto e controllare l'infusione delle cellule al fine di garantire il trapianto efficiente, ad esempio, utilizzando la vena porta o la coda per il trapianto entopic e il mesentere e la capsula renale per il trapianto ectopica; monitoraggio dello stato di sostituzione tramite l'espressione di tessuto o organo secreto proteine rappresentante staminali / progenitrici immature o cellule trapianto e cellula tumorale tracing, come ad esempio fetoproteina alfa o transferrina.
In sintesi, Alb-TRECK / topi SCID costituiscono un modello adatto per il trapianto di cellule staminali epatiche umane, in quanto forniscono un ambiente favorevole che permette di differenziare in epatociti maturi. Questo romanzo modello ha un enorme potenziale applicativo, non solo per l'espansione ex vivo di epatociti umani But anche per schermi di droga e farmaci terapeutici test candidati per tossicità epatica e il metabolismo. Inoltre, questi risultati aiuteranno nella promozione di studi futuri che esaminano l'applicazione clinica di questa tecnica per trapianto di cellule epatiche umane.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
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