Protocol
全ての動物実験手順は、横浜市立大学の動物保護ガイドラインに従って行いました。
急性肝障害モデルマウスの1世代
- 1mg / mlのDTストック溶液を作製するために1mgのジフテリア毒素（DT）から（0.85％のNaCl溶液100 mlの0.6グラムフェノール）フェノール化0.85％のNaCl溶液1mlを加えます。注：1ミリグラムの濃度のDT / mlで8℃に3℃で約2年間保存することができます。
- シリアルフェノール化0.85％NaCl溶液中0.3 / mlのDTに1mg / mlのDTストック溶液を希釈し、作業溶液として0.3 / mlのDT溶液のアリコートを準備します。注：この作業溶液を新たに準備する必要があります。
- 致死未満量（〜50％の致死率）を使用して実験を行うために、8週齢のマウスにDT1.5μgの/ kgの用量を投与します。
- 背側横臥位でマウスを保持することによって、DTの腹腔内注射を行い、needlを挿入膝の曲げ下のeは、左または正中線の右側。膀胱の浸透を防止するために、正中線を避けてください。角度身体への針は約45°です。
- インスリン注射器を用いて、マウス体重20gのあたり新たに調製した0.3 / mlのDTを100μlをマウスに注射します。例えば、18-グラムのマウスには、0.3 / mlのDTの溶液を90μLを受けるべきです。
- 48時間後DT注射で、血管を拡張するために、約10分間37℃の水浴中でマウスの尾の拘束にマウスを置き、温めて尾静脈から血液を収集します。そして、鋭いメスの刃で先端から尾2センチメートルに1ミリニックを行い、マイクロキャピラリーチューブに血液を収集します。
- 5分間1500×gで血液を含むマイクロキャピラリーチューブを遠心し、上清および細胞ペレットを分離することにより血清を収集します。
- GOT / AST-上に1：20希釈したマウス血清のピペットを50μlPIIIはスライドします。製造業者のプロトコルに従って多目的自動乾式化学分析装置を用いて650nmで反応生成物（青色色素）の吸光度を測定します。
注：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）の読み出しは、/グルタミン酸オキサロトランスアミナーゼ（GOT）活性が自動的に表示されます。 2日は、DTの注射後、マウスの約60％は12,000の間でAST値を示した - 16,000 IU / Lと急性肝障害を患っていると考えられました。これらのマウスは、新しいケージに移し、細胞移植のレシピエントとして使用しました。
ヒト肝幹細胞の調製
- CDCP1 + CD90 + CD66-の亜集団を得ることがCDCP1、CD90、およびCD66細胞抗原を使用して、セルソーターでヒト初代胎児肝細胞からのヒト肝幹細胞を分離し、その後、コラーゲンIVでコーティングした培養皿上で単離された細胞集団をシード、以前に15を報告しました 。胚性のヒト初代胎児肝細胞を使用してください週14と18の間の年齢。
- 、100 mmの培養皿上で90％コンフルエンス培地を吸引、10mlのPBSで細胞を洗浄し、その後PBSを削除 - 80％まで培養したヒト肝幹細胞を収集します。 37℃で5分間2mlの0.05％トリプシン/ EDTA溶液で細胞をトリプシン処理。注：細胞分化マウスにおけるそれらの増殖能に影響を与えることができるので、90％以上のコンフルエンスの細胞を、細胞移植に適していません。
- 顕微鏡下で細胞分散の状態を監視します。細胞が浮遊または自由に流れるように見える場合には、10％FBSを含むDMEM / F12を8mlを添加することにより酵素消化を停止します。
- ゆっくりと10-mlの血清学的ピペットを用いて細胞を懸濁し、15 mLコニカルチューブに細胞を移します。 100×gで5分間、4℃のための細胞を遠心します。
- 慎重に10％FBSを含む10 mlのDMEM / F12中で細胞ペレットを再懸濁し、顕微鏡計数チャンバーを用いて細胞数を決定します。
- 各個々のマウスのためのPBSのアリコート50μlのあたり1.0×10 6細胞に細胞を分割し、移植まで氷上で保存します。
ヒト肝幹細胞の3脾臓内移植
- 37°C電気加熱パッドの上にきれいなケージを置きます。
- ノズルの下に置くことによって - （分当たりの酸素の2 Lで1.5％（体積/体積）1）イソフルラン吸入を用いてマウスを麻酔。また、イソフルランに浸したガーゼを含むチューブを使用します。
- マウスは軽くリアフットパッドをつまんで麻酔されていることを確認してください。膝ジャークが誘発されている場合は、バックチャンバー内にマウスを置きます。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
- 電気バリカンを使用して手術部位を剃るし、滅菌するために70％（体積/体積）エタノール及びポビドンヨードを適用します。その後、切開に続いてちょうど肋骨の肋骨境界線下の左脇腹に1 cmの皮膚切開を作ります腹壁、ならびに腹膜。
- 慎重に脾臓を露出させます。直接各マウスの脾臓に50μlのPBS中に1.0×10 6個のヒト肝幹細胞を注入するために32-G、1/2インチの針で100μlのマイクロインジェクションのシリンジを使用してください。注射のための5°の角度で針を傾けます。
- 注入の深さは脾臓の半分以下の厚さであることを確認してください。針は、一方の端部（ヘッド）で脾臓を入力し、もう一方の端（テール）で細胞を付着させる必要があります。
- 注射後の細胞の漏れを防止するために、穏やかに2分間の指を使って圧力を適用し、針を取り除きます。
- バックマウス本体に脾臓を置き、筋肉組織や皮膚のための通常走行縫合糸で空洞を閉じます。
- すぐに移植後37℃で予熱したケージにマウスを転送します。マウスを確保するために、快適に息をケージにその側にマウスを配置することができ、ケージ寝具、手術の部位との間の接触が無効になります。
- 麻酔は、縫合糸は閉じたままとマウスは、手術前の状態に戻り確実にするために切れるまでマウスを監視します。
- マウスを確認し、通常の飲料水と食料が設けられています。 1時間後、動物中央のマウスの部屋にケージを返し、毎日マウスを監視します。
移植されたヒト肝4.検出は、マウス肝臓における細胞由来肝細胞を幹
注：以下の手順については、頸椎脱臼が続くケタミンとキシラジンの過剰摂取を使用して、すべての動物を安楽死させます。
- 4時 - 6週間、移植後、マウスを安楽死させると同時に、手術用はさみを使用して真皮と筋膜を切断して腹腔を開きます。
- スプレッダーとしてハサミを使用して、腹膜上記の結合組織を解剖し、腹膜を開くには、白線に沿って腹膜をカット空洞。
- 鉗子で胸骨を持ち上げ、横隔膜に穴を開け、最大子宮頸ガードルを介して胸骨の両側を切断。
- 肝臓の胸部側の大静脈を切断し、前方方向に肝臓を通って食道を引っ張ります。肝臓を除去するために、振動板を取り外します。
注：はさみのヒントを出さないように注意してください下に胸部臓器の損傷を防止するために、上向きに指摘しました。胸腺は時折胸骨の背側にしがみつく傾向があり、これは慎重に避けなければなりません。 - ハンドルとしてダイヤフラムを使用して、腹腔から肝臓を引っ張って開始します。インテリア大静脈は、所定の位置に肝臓を開催します。インテリア大静脈をカット。途中で右副腎を解放しないように注意してください。
注：マウスは中葉、左葉、右葉、および尾状葉からなる4ローブ肝臓を持っています。胆嚢はの小さな分岐に懸濁されます中葉。 - 接合部で互いにローブを分離し、製造業者のプロトコルに応じて最適な切削温度（OCT）化合物でそれらを埋め込みます。クライオスタット上の金属グリッドでの肝臓組織を含む10月をフリーズします。
- -18℃でクライオスタットを用いて5μmの厚さのサンプルのセクションをカットし、RT顕微鏡スライド上にマウントします。 -80℃での在庫を保管してください。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）と以前に報告された手順16に従って、免疫蛍光染色のためのスライドを準備します。
5.ヒトアルブミンの分泌の検出とキメラ率の計算
- ヒト肝臓の再構成を測定するために、製造業者の指示に従って血清およびヒトアルブミンELISAキットを用いてヒトアルブミンELISAを行います。
- 全ヒト肝臓における発現レベルのリアルタイムPCR分析によりヒト肝キメラ率を計算します。相対元を決定しますヒト - マウスクロスアクチンに対するヒト特異的アクチンのPRESSIONレベル比（比1）、ヒト - マウスクロスアクチンに対するマウス特異的アクチンの比率（比率2）。キメラ率は、比1 /ように（比1 +比2）で算出されます。
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Representative Results
ALB-トレック/ SCIDマウスの肝細胞は、アルブミンプロモーターの制御下で、ヒトDT受容体HB-EGF遺伝子を発現し、DT投与12以下の細胞毒性効果を発揮します。肝障害に対するDT処置の効果を評価するために、1.5μgの/キロのDT投与量は、8週齢のアルプ・トレック/ SCIDマウスに注射し、肝臓48時間後のDT投与の病理学的変化を組織学的に評価しました。 （いないDTで処理された）コントロールマウスと比較して、DT処置マウスは、増大した血清AST活性を有する輻輳の補正を示す無秩序な肝臓のアーキテクチャを示しました。また、DT-処置したマウスの肝細胞は暗い核（おそらくアポトーシス肝細胞）と一緒に、複数の、濃染好酸性細胞質封入体を持っていました。他のいくつかの肝細胞は、保存や、ほとんど門脈炎症と暗い核を有する空胞化細胞質（ 図1を示し登場します12を用いて生成することができることを示した以前の研究のものと一致しています。
人間HpSCsは、in vitro培養で長期的に使用すると、いくつかのALB少ないCK19陽性細胞で均一な細胞形態を呈することができます。 6週でマウスの肝臓に移植後、人間HpSCsは、顕微鏡下での基本的な検査を受け、組織学的に評価しました。ヒトHpSCsは、元のマウス肝細胞（ 図2）を置換することによって肝臓の構造を再構成していることが観察されました。肉眼、4日後のヒトHPSC移植で、均一に肝臓の周りに分布した小さな人間の肝臓のクラスターが検出されました。 45日後の移植で、これらは大規模なクラスタ（ 図3）に増殖していました。誰ヒト肝細胞を用いて再構成ルマウスの肝臓は、「ヒト化肝臓を。」と命名しましたこれらの結果は、ヒトHPSC移植を受ける致命的劇症肝不全を有するマウスは、正常マウスの肝臓で観察されたものと類似の肝臓構造を示すことができることを示しています。
マウスに移植された未成熟ヒト肝細胞の分化の可能性を有し、 インビボで機能することができるかどうかを試験の前に、マウスの肝臓におけるヒト肝細胞の存在は、第一の免疫組織化学的分析では、約6週間後、ヒトHPSC移植によって確認しました。オリジナルの対照マウスの肝臓であったのに対し、具体的かつ積極的に人間の核と人間のサイトケラチンと共染色された8月18日（CK8 / 18）抗体は、ドナー細胞由来のヒト肝細胞を含んでいることが判明した60％のヒト細胞の再増殖を有するマウスからの肝臓切片これらのマーカーのための負（ 図4）。
in vivoでの細胞の分化の程度を評価するためには、ヒトアルブミン（ALB）およびヒトサイトケラチン19（CK19）の発現は、免疫組織化学的に評価しました。ヒトHPSC由来ヒト肝細胞は、マウスの肝臓で十分に分化しており、上方制御された人間のALB発現を示しました。正に人間ALBとCK19で共染色された細胞は、肝細胞および胆管（ 図5）に分化するために二分化能能力を示したのに対し、人間ALB陽性及びCK19陰性肝細胞は、機能的な肝細胞に似ていました。全てのヒトHPSC由来のヒト肝葉を分析するために使用される大規模な走査方法は、コロニーを示す、明確な人間の核及びCK8 / 18発現（ 図6）を有する肝葉の周囲の複数の丸いコロニー様クラスターの存在を明らかにしましたヒト化肝臓における人間HpSCsの能力を形成します。再増殖のレベルは90％にまで達しました1ヶ月移植後（ 図7A）およびヒトアルブミンの分泌は、人間HpSCsが正常アルプ・トレック/ SCIDマウスの肝臓を再構成できることを示し、再増殖したマウスの肝臓（ 図7B）で検出されました。これらの結果は、ヒトHpSCsに欠陥マウス肝臓機能の救出に応答してin vivoでの機能的な肝細胞への分化のための高い可能性を有することを示しています。
図1. 肝障害は。ジフテリア毒素（DT）注射後アルプ・トレック/ SCID（毒素受容体媒介細胞ノックアウト）マウスにおける発生がなく、48時間後のDT投与したマウスの肝臓の組織学（ヘマトキシリン-エオシン染色）。 DT用量：1.5μgの/キロ、正常な肝臓（左パネル）の血清ASTの活動：30 IU / L; DT-処理された肝臓の血清AST活性（右のパネル）：15000IU / L。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. 劇症肝障害とのアルプ・トレック/ SCIDマウスにヒト肝幹細胞の移植。6週での人間HpSCsを有するヒト化肝臓の肉眼ビュー（左パネル）および組織学的解析（ヘマトキシリン-エオシン染色、右のパネル）は移植後。 M、マウス肝臓領域と時間、人間のドナー細胞由来の人物領域。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
<BR /> 図3. 緑色蛍光タンパク質で標識したヒト肝幹細胞由来のヒト肝臓の肉眼分析。肝構造4日（左パネル）および45日の高倍率画像（右パネル）は、ヒト肝幹と、次の移植細胞（HpSCs）。ヒト肝幹細胞（HpSCs）はレンチウイルスベクターを用いて増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）で標識した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ヒト肝の 図4. キャラクタリゼーションはアルプ・トレック/ SCIDマウスにおける細胞由来ヒト肝細胞を幹。免疫組織化学的分析は、抗ヒトCK8 / 18（緑）、抗原と抗Hで染色したヒト肝細胞を区別します UMAN核抗原（アクアブルー）は、ヒト肝幹細胞由来のヒト化肝臓における6週で移植後。 M、マウス肝臓領域と時間、人間のドナー細胞由来のヒト肝臓領域。人間の肝臓領域対マウスの肝臓領域：ホワイト破線。核を4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（青）で対比染色しました。スケールバー=100μmでは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
アルプ・トレック/ SCIDマウスのヒト化肝臓における図5.ヒト肝幹細胞の分化。免疫組織化学は、6週間後の移植でHPSC由来の肝臓におけるヒトアルブミンおよびヒトCK19の分析。核を4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（青）で対比染色しました。スケールバー=100μmです。jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
人間の肝幹細胞由来の複数の大規模なクラスタは6週で肝葉で同定された細胞由来細胞は、アルプ・トレックにヒト化肝臓と/ SCIDマウスに存在する幹ヒト肝の 図6. 複数のクラスタは、のための免疫組織化学的解析により、移植を投稿します人間CK8 / 18（緑）およびヒト核（アクアブルー）。スケールバー=1000μmでは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7. ヒト化アルプ・トレック/ SCIDマウスにおける肝臓再増殖率およびヒトアルブミンの分泌。人間の肝幹細胞移植後のアルプ・トレック/ SCIDマウスにおいて、（A）キメラ率1ヶ月。データは（N = 12）の平均値±SEMとして提示されます。マンホイットニー検定：P <シャムと人間HpSCsのための0.0005（B）ヒトアルブミンの検出マウス血清中のドナー細胞移植後1ヶ月。データ=は、平均±SEM（n = 5）でした。マンホイットニー検定：P =シャムと人間HpSCsのための0.0313。 ND：検出不能。シャム：PBSを移植したマウス。 HpSCTx：人間HpSCsを移植したマウスは、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
最近の研究は、マウスの肝臓は、成人肝細胞および増殖性肝幹細胞17を含むヒト肝細胞で再増殖することができることを示しています。これらの再増殖した肝臓は薬物代謝試験および薬物の発見と開発18のための前臨床実験モデルとして使用されています。加えて、それらは、細胞成熟および分化19のためのインビボ環境を提供しています。本研究の主要な目的は、薬物の代謝活動を取得するため、ヒト未熟肝細胞の増殖、成熟、および分化を可能新規な肝疾患のマウスモデルを生成することでした。
脾臓内移植の過程は、広範囲に研究されています。ラットおよびマウスの脾臓に移植された細胞は、彼らの平均寿命を通して生き残ります。脾臓内移植プロトコルは、特定の研究課題を調査するのに非常に有用であることが証明されています。多くの研究室は、世界中のために改良されたマウスの生存と肝再生の肝細胞移植のための高度に再現可能で信頼性の高いモデルとしてこのプロトコルを利用することを試みてきました。移植された細胞の大部分は、彼らがポータル枝を閉塞することができ、肝臓に移行しますので、脾臓パルプに細胞を移植することは、リスクをもたらします。この閉塞が一時的にすることができ、肝臓の損傷を、既存の例では、健康な肝臓の環境に影響を与えない場合もありますが、この手順は、さらに肝機能を低下させ、門脈圧亢進症を増加させ、また、負の細胞移植に影響を与える可能性がある可能性があります。我々が正常に脾臓内移植を用いた肝細胞移植を適用しているが、いくつかの問題は、今後の検討課題、潜在的な新しい細胞源の特に主題を保証するものとします。脾臓内肝細胞移植を行う際にまた、セル負荷の制限が厳しくによって潜在的な妨害を防ぐために従わなければなりませんレムナント肝臓の微小循環。 DT受容体は、ヘパリン結合EGF様成長因子（HB-EGF前駆体）20の膜アンカー型として同定されています。このような毒素受容体としてヒトやサル、バインドDTおよび関数として毒素感受性動物由来HB-EGF前駆体に対し、マウスおよびラットからのHB-EGF前駆体は、DT 21に結合しません 。トランスジェニックアルプ・トレック/ SCIDマウスモデルは、肝細胞特異的アルブミンプロモーターの制御下にヒトHB-EGF様受容体を発現します。 DTの投与後、これらのマウスは、ドナー細胞の居住および増殖のためのスペースを提供し、肝細胞の条件付きアブレーションによる劇症肝不全を発症します。彼らは薬物代謝の機能を失うことがあっても、未成熟段階でのヒト肝細胞は、それらの前臨床アプリケーション22を制限する、 インビトロで広範な増殖能を有することが知られています。トラの後に得られる組織学的および免疫組織化学的所見致死劇症肝不全とアルプ・トレック/ SCIDマウスへのヒトHpSCsのnsplantationは人間HpSCsが拡大し、損傷したマウスの肝臓の構造を再構成できることを示しました。一部のマウスでの再増殖率はほぼ100％でした。
我々の実験では、ヒトHPSC移植マウスの生存を促進し、マウス血清16へのヒトALBの分泌増加をもたらしました。これらの細胞は成熟し、in vivoでの差別化と人間HPSC由来のヒト化マウスの肝臓が成熟し、機能的な「人間の臓器」と類似しており、医薬品開発における潜在的なアプリケーションを持っていることを示す、ヒトの薬物代謝活性を示しました。これらの結果は、アルプ・トレック/ SCIDマウスはヒト化肝臓生成のための理想的なモデルであることを確認してください。人間の肝幹細胞由来のヒト化肝臓生成のための理想的なモデルとして、アルプ・トレック/ SCIDマウスの展望と利点にもかかわらず、彼らは1ユニークな欠点を有しています。ときに人間の広告ULT肝細胞は、DTの単回投与で処置した3アルプ・トレック/ SCIDマウスに移植した、全くヒト化肝臓をヒト成体肝細胞は増殖能力を欠いている可能性があるため、生成されませんでした。 DTの追加の用量は、ヒト成人肝細胞の移植後に投与することはできません。アルプ・トレック/ SCIDマウス肝細胞におけるDT受容体（HB-EGF）はアルブミンプロモーターの制御下にあるので、追加のDT治療は、マウスの肝臓における移植されたヒト成人肝細胞を破壊します。
我々の知る限り、これは、未成熟ヒト細胞からのヒト肝臓を生成するための最初のモデルです。セル置換率移植後は、未成熟および増殖および差動能力対成熟したように、受信者の微小環境（ 例えば、肝ニッチ）とドナー細胞の性質によって影響されます。幹細胞移植でアルプ・トレック/ SCIDを組み合わせることにより、人間の世代のために最適化された条件と利点を提供します化された肝臓。これはまた、前DTの治療に、アルプ・トレック/ SCID動物が健全な状態で維持されているので、肝臓の損傷は、任意の時に誘導される強力な胎児肝細胞の移植のためのツールや、潜在的に同様のiPSやES由来の肝細胞を構成しますポイントし、マウスは、腎臓の損傷を与えることなく、正常に繁殖します。対照的に、のuPA / SCIDマウスは、高い新生児の死亡率を示し、繁殖することが困難です。さらに、動物におけるウロキナーゼの過剰発現は、重度の出血や腎障害につながることができ、したがって、前離乳への細胞移植のための機会の限られたウィンドウがあります。 ALB-トレック/ SCIDは、どの年齢でも細胞移植のために使用することができます。
ヒト肝臓、マウスが正常に生成さは、以下の重要なステップが必要です：1）肝損傷は、通常、致死量、50％）を使用して、（サブ致死レベルに制限されるべきです。 2）ヒト初代胎児肝細胞は、90％を超えないサブ集密状態で維持されるべきです。3）細胞漏洩後の脾臓内移植を防止する必要があります。 4）マウス血清中のヒトアルブミンのレベルを定期的に監視されるべきです。ヒト化マウス肝臓生成のプロセスに関与する重要な要素を総合的に理解することは、さらなる修正またはラットまたは他の動物を活用した新たな発展に貢献する可能性があります。可能な適応が含まれます：マウス本体内の3次元構造に人間のネフロン、それらの前駆細胞、および集合管細胞およびヒトネフロンの自己組織化と開発し、修復を検査するための腎臓損傷の誘導を。直接再プログラミング、IPS、またはES細胞由来の膵臓幹/前駆細胞を用いた膵臓における膵島損傷の修復を研究します。プロセス修正としては、例えば、常在細胞とドナー細胞の競争を促進するretrorsine、ストレプトゾトシン、またはシスプラチンのような毒素または化学物質との組織または臓器の損傷を制御します。回避従って、このようなESまたはiPS-由来の細胞のようなレシピエント細胞の交換を促進し、ドナー細胞の増殖能力を高めるために、増殖し、差動または減少します。適切な移植部位を選択し、正常位置の移植や異所性移植のための腸間膜および腎カプセルのポータルまたは尾静脈を使用して、例えば、効率的な移植を確保するために、細胞注入を制御します。このようなα-フェトプロテインまたはトランスフェリンなどの幹細胞/前駆または未成熟細胞移植および癌細胞の追跡の組織または器官分泌タンパク質の代表、の発現により置換状態を監視します。
それらは、成熟肝細胞への分化を可能にする有益な環境を提供するように要約すると、アルプ・トレック/ SCIDマウスは、ヒト肝幹細胞移植のために適切なモデルを構成しています。この新規モデルは、驚異的な応用的可能性を持っているだけでなく、ヒト肝細胞bのex vivoでの拡大のためUTまた肝臓毒性及び代謝のための薬物スクリーニングおよびテスト候補治療薬のため。さらに、これらの結果は、ヒト肝細胞移植にこの技術の臨床応用を検討将来の研究の発展に役立ちます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
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