Protocol
Alle dyr eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til dyrevern Retningslinjer av Yokohama City University.
1. generasjon av akutt leverskade Mouse Model
- Tilsett 1 ml phenolized 0,85% NaCl-oppløsning (0,6 g fenol i 100 ml 0,85% NaCl-løsning) til 1 mg difteri-toksin (DT) for å lage en 1 mg / ml stamløsning DT. Merk: DT ved en konsentrasjon på 1 mg / ml kan oppbevares i omtrent 2 år ved 3 ° C til 8 ° C.
- Serielt fortynnes 1 mg / ml stamløsning DT til 0,3 ug / ml i DT phenolized 0,85% NaCl-løsning og fremstille en porsjon av 0,3 ug / ml DT-oppløsning som en arbeidsoppløsning. Merk: Denne arbeidsløsning skal tilberedes.
- For å utføre eksperimenter ved hjelp av en subletal dose (~ 50% letalitet), administrere til 8 uker gamle mus en dose på DT 1,5 ug / kg.
- Utfør en intraperitoneal injeksjon av DT ved å holde musen i ryggleie, og sett needle nedenfor svingen av knærne, venstre eller høyre for midtlinjen. Unngå midtlinjen for å hindre inntrengning av blæren. Angle nålen på ca 45 ° i forhold til kroppen.
- Ved hjelp av en insulinsprøyte, injisere mus med 100 ul nylaget 0,3 mikrogram / ml DT per 20 g mus vekt. For eksempel bør en 18 g mus mottar 90 pl av 0,3 pg / ml DT-løsning.
- Ved 48 timer etter injeksjon DT, samle blod fra halevenen ved å plassere musen i en rainer og oppvarming av musehale i et 37 ° C vannbad i ca 10 min for å utvide blodkarene. Deretter gjør et 1-mm nick i halen 2 cm fra spissen med et skarpt skalpellblad, og samle opp blod med en microcapillary rør.
- Sentrifuger microcapillary røret som inneholder den blod ved 1500 xg i 5 min, og samle serum ved å skille supernatanten og cellepelleten.
- Pipetter 50 mL 01:20 fortynnet musserum bort på GOT / AST-PIII lysbilder. Mål absorbansen av reaksjonsproduktet (blått fargestoff) ved 650 nm ved anvendelse av en multi-purpose automatisk tørr-kjemi-analysator i henhold til produsentens protokoll.
MERK: read-out av aspartataminotransferase (AST) / aspartat aminotransferase (GOT) aktivitet vises automatisk. 2 dager etter DT injeksjon, ca 60% av musene viste ASAT-verdier mellom 12 000 - 16 000 IU / L og ble ansett for å være lider av akutt leverskade. Disse musene ble overført til et nytt bur og brukes som celletransplantasjon mottakere.
2. Utarbeidelse av menneskelig Lever stamceller
- Isoler humane lever stamceller fra humane primære føtale leverceller med en celle sorter hjelp av CDCP1, CD90, og CD66 celleantigener å få en CDCP1 + CD90 + CD66- undergruppe, så frø den isolerte cellepopulasjon på kollagen IV-belagt kultur retter, som tidligere rapportert 15. Bruk humane primære føtale leverceller av en embryoalder mellom uke 14 og 18.
- Samle humane lever stamceller dyrket til 80% - 90% samløpet på 100 mm kultur retter, aspirer dyrkingsmedium, vaske cellene med 10 ml PBS, og deretter fjerne PBS. Trypsineres cellene med 2 ml 0,05% trypsin / EDTA-løsning i 5 minutter ved 37 ° C. Merk: Celler på mer enn 90% konfluens er ikke egnet for celletransplantasjon, siden celledifferensiering kan påvirke deres proliferative evne hos mus.
- Overvåke statusen til cellen dispersjonen under et mikroskop. Når cellene ser ut til å være flytende eller flyter fritt, stoppe den enzymatiske fordøyelsen ved å tilsette 8 ml DMEM / F12 inneholder 10% FBS.
- Suspendere cellene langsomt ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette og overføre cellene til en 15 ml konisk rør. Sentrifuger cellene i 5 min ved 100 xg og 4 ° C.
- resuspender nøye cellepelleten i 10 ml DMEM / F12 inneholdende 10% FBS og bestemme antall celler ved hjelp av et mikroskop tellekammer.
- Dele cellene i 1,0 x 10 6 celler pr 50 ul PBS alikvoter for hver enkelt mus og lagres på is inntil transplantasjon.
3. Intrasplenic Transplantasjon av menneskelige Lever stamceller
- Plasser en ren bur på en 37 ° C elektrisk oppvarming pad.
- Bedøve musen med isofluran inhalering (1 - 1,5% (vol / vol) i 2 liter oksygen pr min) ved å plassere det på undersiden av munnstykket. Alternativt kan du bruke rør som inneholder gasbind fuktet med isofluran.
- Kontroller at musen er bedøvet med et lett klyping bak footpad. Hvis et kne rykk utløses, plasserer du muse tilbake i kammeret. Bruk dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Barbere operasjonsstedet ved hjelp av elektriske klippere og gjelder 70% (vol / vol) etanol og povidon-jod for å sterilisere. Deretter lage en 1-cm hud snitt i venstrekanten like nedenfor kyst grensen av ribbeina, etterfulgt av et snitt påbukveggen, så vel som peritoneum.
- Nøye utsett milten. Bruk en 100-mL mikroinjeksjon sprøyte med en 32 G-1/2-inch nål for direkte å injisere 1,0 x 10 6 humane hepatiske stamceller i 50 ul PBS inn i milten til hver mus. Vipp nål på et 5 ° vinkel for injeksjon.
- Sikre at dybden av injeksjonen er mindre enn halvparten av tykkelsen av milten. Nålen bør gå inn i milten i den ene enden (leder) og sette cellene i den andre enden (halen).
- For å hindre lekkasje av cellene etter injeksjon, press forsiktig ved hjelp av en finger for 2 min og deretter ta ut nålen.
- Plasser milten tilbake i mus legemet og lukker hulrommet med en normal løpe sutur for muskulaturen og huden.
- Overfør musene inn i en 37 ° C forvarmet bur umiddelbart etter transplantasjon. For å sikre at musen er i stand til å puste komfortabelt, plasserer du muse på sin side i buret, enugyldig kontakt mellom buret sengetøy og området av kirurgi.
- Overvåk musene før anestesi slites av å sikre sting forbli lukket og musene tilbake til pre-kirurgi forhold.
- Sikre musene er forsynt med vanlig drikkevann og mat. Etter 1 time, tilbake buret til musen rom til dyret sentrum og overvåke musene daglig.
4. Påvisning av transplanterte humane lever Stem Cell-Avledet hepatocytter in Mouse Liver
Merk: For følgende prosedyrer, avlive alle dyr med en overdose av ketamin og xylazin fulgt ved halshugging.
- På 4 - 6 uker etter transplantasjonen, avlive mus og åpne bukhulen ved samtidig å kutte cutis og fascia hjelp kirurgisk saks.
- Dissekere bindevevet over peritoneum, ved hjelp av saks som en spreder, og kutte bukhinnen langs linea alba å åpne peritonealhulrom.
- Løft sternum med pinsett, punktere membranen, og skjære gjennom hver side av sternum opp gjennom cervical belte.
- Sever vena cava på brystsiden av leveren og trekk spiserøret gjennom leveren i den fremre retningen. Fjerne membranen for å fjerne leveren.
Merk: Vær forsiktig med å holde tuppen av saksen pekte oppover for å forhindre skade på thorax organer under. Thymus har en tendens til å klynge seg til av og til den dorsale side av brystbenet, og dette må unngås nøye. - Bruke membran som håndtak, begynne å trekke leveren ut av bukhulen. Interiøret vena cava skal holde leveren på plass. Skjær interiøret vena cava; være forsiktig med å tidlig frigjøre høyre binyre.
Merk: Mus har en fire-flikete leveren består av en median lapp, venstre lapp, høyre lapp, og caudatus lapp. Galleblæren er opphengt i små delinger avmedian lapp. - Skill lappene fra hverandre på kryss og legge dem i optimal skjæring temperatur (OCT) compound i henhold til produsentens protokoll. Frys oktober inneholder leveren vev i metallnett på cryostat.
- Skjær 5-mikrometer tykke prøvedelene med en cryostat ved -18 ° C og montere dem på RT objektglass. Oppbevar lager ved -80 ° C. Forbered lysbilder for hematoxylin og eosin (H & E) og immunfluorescens farging i henhold til tidligere rapporterte prosedyrer 16.
5. Detection of Human albumin Sekresjon og Beregning av kimære Rate
- For å måle menneskelig lever rekonstituering utføre menneskelig albumin ELISA bruker serum og en menneskelig albumin ELISA kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Beregn humanisert leveren kimære renten med real-time PCR-analyse av uttrykket nivåer i hele-humanisert leveren. Bestem den relative expression nivå forholdet av human-spesifikke actin til human-mus kryss aktin (forhold 1) og forholdet av muse-spesifikke actin til human-mus kryss aktin (forhold 2). Den kimære rente er beregnet som forholdet 1 / (forhold 1 + ratio 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alb-treck / SCID-mus hepatocytter uttrykker den humane DT-reseptor HB-EGF-genet under kontroll av en promoter albumin og oppviser cytotoksiske effekter etter administrering DT 12. For å evaluere effekten av DT behandling på leverskade, ble DT doser på 1,5 mikrogram / kg injisert i åtte uker gamle Alb-treck / SCID-mus og patologiske endringer i leveren 48 timer etter DT administrasjon ble histologisk vurdert. Sammenlignet med kontrollmusene (ikke behandlet med DT), DT-behandlede mus viste en uorganisert lever arkitektur viser en korreksjon for lunger med økt serum ASAT aktivitet. I tillegg hepatocytter av DT-behandlede mus hadde flere, dypt farget acidophilic cytoplasmatiske slutninger sammen med mørke kjerner (mest sannsynligvis apoptotiske hepatocytter); noen andre hepatocytter dukket bevart eller utviste en vacuolated cytoplasma med mørke kjerner med liten eller ingen portvenen betennelse (figur 1 12.
Menneskelige HpSCs kan brukes for langvarig in vitro dyrking og oppviser ensartet cellemorfologi med noen ALB og færre CK19-positive celler. 6 uker etter transplantasjon inn i muselever, ble de menneskelige HpSCs utsatt for grunnleggende undersøkelse under et mikroskop og evalueres histologisk; humane HpSCs ble observert å ha rekonstituert leveren struktur ved å erstatte det originale muse hepatocyttene (figur 2). Makroskopisk, 4 dager etter menneskelig HpSC transplantasjon, små menneskelever klynger som ble jevnt fordelt rundt leveren ble oppdaget; 45 dager etter transplantasjon, hadde disse proliferated i store klynger (figur 3). Hvemle muselever rekonstituert med humane hepatocytter ble utpekt "humanisert lever." Disse resultatene indikerer at mus med dødelig fulminant leversvikt som gjennomgår menneske HpSC transplantasjon kan utvise lever strukturer som ligner de som ble observert i normale mus lever.
Før testing om umodne humane hepatocytter transplantert inn i mus hadde potensial for differensiering og kan virke in vivo, ble tilstedeværelse av humane hepatocytter i muselever først bekreftet ved immunohistokjemisk analyse etter ca. 6 uker etter human HpSC transplantasjon. Leversnitt fra mus med 60% human celle repopulation som spesifikt positivt og ko-farget med humane kjerner og human cytokeratin 8/18 (CK8 / 18) antistoffer ble funnet å inneholde donor celle-avledede humane hepatocytter, mens de opprinnelige kontroll-muse lever var negative for disse markører (figur 4).
in vivo, ble uttrykk for menneskelig albumin (ALB) og menneskelig cytokeratin 19 (CK19) vurderes immunohistochemically. Menneske HpSC-avledet humane hepatocytter ble godt differensiert i muselever og utstilt oppregulert menneskelig ALB uttrykk. Menneske ALB-positive og CK19-negative hepatocytter lignet funksjonelle hepatocytter, mens celler som positivt co-farget med menneskelig ALB og CK19 utstilt bipotential evne til å differensiere til hepatocytter og cholangiocytes (figur 5). En storstilt skanning metoden som brukes til å analysere alle menneskelige HpSC-avledet humanisert leverlappene avslørte tilstedeværelsen av flere runde og kolonilignende klynger rundt leveren lapper med klare menneskelige kjerner og CK8 / 18 uttrykk (figur 6), demonstrere koloni forming evnen til menneskelige HpSCs i humanisert lever. Den repopulation nivået nådd opp til 90%en måned etter transplantasjon (figur 7A) og humant albumin sekresjon ble detektert i mus repopulated lever (figur 7B), som indikerer at humane HpSCs kunne med hell rekonstituere Alb-treck / SCID mus leveren. Disse resultatene viser at menneskelige HpSCs har stort potensial for differensiering i funksjonelle hepatocytter in vivo i respons til redning av defekte museleverfunksjoner.
Figur 1. leverskader oppstår i Alb-treck / SCID (Toxin reseptormediert Cell Knockout) Mus Etter Difteri toksin (DT) Injection. Histologi (hematoxylin-eosin-farging) av muselever uten og med DT administrasjon etter 48 timer. DT dose: 1,5 mikrogram / kg, serum ASAT aktivitet av normal leveren (venstre panel): 30 IU / L; serum ASAT aktivitet av DT-behandlet leveren (panel høyre): 15 000IU / L. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Transplantasjon av menneskelige Lever stamceller inn Alb-treck / SCID mus med Fulminant leversvikt. Makroskopisk view (venstre panel) og histologisk analyse (hematoxylin-eosin farging, panel høyre) av humanisert lever med menneske HpSCs 6 uker etter transplantasjon . m, mus leveren regionen; h, human donor-celleavledet human-regionen. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
<br /> Figur 3. Makroskopisk Analyse av Humaniserte Livers avledet fra humant Lever stamceller merket med grønt fluorescerende protein. Høy forstørrelse bilder av leveren struktur 4 dager (venstre panel) og 45 dager (panel til høyre) etter transplantasjon med menneskelig lever stilk celler (HpSCs). Menneskelever stamceller (HpSCs) ble merket med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) med en lentivirus vektor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Karakterisering av menneskelig lever Stem Cell-avledet humane hepatocytter i Alb-treck / SCID mus. Immunhistokjemisk analyse skille mellom humane hepatocytter farget med anti-human CK8 / 18 (grønn) antigen og anti-h Uman kjernekraft antigen (aqua blå) i humane leverstamcelle-avledet humanisert lever på 6 uker etter transplantasjonen. m, mus leveren regionen; h, human donor-celleavledet human lever region. Hvit stiplet linje: muselever region vs human lever regionen. Kjerner ble motfarget med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (blå). Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Menneskelig Lever stamceller Differensiering i Humaniserte Livers av Alb-treck / SCID mus. Immunhistokjemisk analyser av menneskelig albumin og menneskelig CK19 i HpSC-avledet lever på 6 uker etter transplantasjonen. Kjerner ble motfarget med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (blå). Skala barer = 100 mikrometer.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Flere Klynger av menneskelig lever Stem Cell-avledet celler finnes i Alb-treck / SCID mus med Humaniserte Livers. Flere store klynger avledet fra humane lever stamceller ble identifisert i leveren fliker på 6 uker etter transplantasjonen ved immunhistokjemisk analyse for menneskelig CK8 / 18 (grønn) og menneskelig kjerner (aqua blå). Skala barer = 1000 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. humanisertLever repopulation Rate and Human albumin Utskillelse i Alb-treck / SCID mus. (A) kimære rate i Alb-treck / SCID mus en måned etter menneskelig leverstamcelletransplantasjon; data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 12). Mann-Whitney test: P <0,0005 for Sham og menneske HpSCs (B) Påvisning av menneskelig albumin i musesera en måned etter donor celletransplantasjon.. Data = gjennomsnitt ± SEM (n = 5). Mann-Whitney test: P = 0,0313 for Sham og menneske HpSCs. ND: undetectable; Sham: mus transplantert med PBS; HpSCTx. Mus transplantert med humane HpSCs Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyere studier har vist at mus leveren kan repopulated med humane hepatocytter, inkludert voksne hepatocytter og proliferative lever stamceller 17. Disse repopulated lever har blitt brukt som prekliniske eksperimentelle modeller for legemiddelmetabolisme testing og medisiner og utvikling 18; i tillegg har de gitt et in vivo miljø for celleutvikling og differensiering 19. Den store Målet med denne studien var å generere en ny leversykdom musemodell som tillot menneskelig umoden hepatocytter spredning, modning, og differensiering, for erverv av narkotika metabolisme aktiviteter.
I løpet av intrasplenic transplantasjon har blitt studert inngå. Celler transplantert inn milten av rotter og mus overlever gjennom deres gjennomsnittlige levetid. Den intrasplenic transplantasjon protokollen har vist seg å være svært nyttig i å undersøke konkrete forskningsspørsmål;mange laboratorier over hele verden har forsøkt å utnytte denne protokollen som en svært reproduserbar og pålitelig modell for levercelletransplantasjon på grunn av den forbedrede mus overlevelse og leveren regenerering. Men implantere celler inn i miltmasse utgjør en risiko, siden de fleste av implanterte cellene vil translocate til leveren hvor de kan tilstoppe portal grener. Selv om dette okklusjon kan være forbigående og kan ikke påvirke et sunt leveren miljø, i tilfeller av allerede eksisterende leverskade, kan denne prosedyren ytterligere redusere leverfunksjon og øke portal hypertensjon og kanskje også negativt påvirke celle engraftment. Selv om vi har lykkes søkt hepatocytter transplantasjon bruker intrasplenic transplantasjon, flere problemer garanterer videre studier, spesielt gjenstand for eventuelle nye cellekilder. Dessuten, når du utfører intrasplenic hepatocytter transplantasjon, cellen lastegrensen må følges nøye for å unngå potensiell forstyrrelse avrest levermikrosirkulasjonen. DT-reseptoren har blitt identifisert som et membran-forankret form av heparin-bindende EGF-lignende vekstfaktor (HB-EGF-forløperen) 20. Mens HB-EGF forløpere avledet fra toksin-sensitive dyr, som mennesker og aper, bind DT og fungerer som toksin reseptorer, HB-EGF forløpere fra mus og rotter ikke binder DT 21. Den transgene Alb-treck / SCID-musemodell uttrykker humane HB-EGF-lignende reseptorer under kontroll av en levercellespesifikke promoter albumin; etter administrering av DT, disse musene utvikle fulminant leversvikt som følge av betinget ablasjon av hepatocytter, som gir plass for donorcelle bosted og spredning. Humane hepatocytter, selv på en umoden fase, er kjent for å ha omfattende proliferativ kapasitet in vitro, selv om de mister stoffet metabolisme funksjoner, noe som begrenser deres prekliniske applikasjoner 22. Histologiske og immunhistokjemiske resultater oppnådd ved å følge transplantation av menneskelige HpSCs i Alb-treck / SCID-mus med dødelig fulminant leversvikt indikerte at de menneskelige HpSCs kunne utvide og rekonstituere de skadede mus leverstrukturer; repopulation rate i noen mus var nesten 100%.
I våre eksperimenter human HpSC transplantasjon fremmet overlevelse mus og resulterte i øket sekresjon av human ALB inn i musesera 16. Disse cellene også modnet og differensiert in vivo og viste menneskelige stoffet stoffskifte aktiviteter, noe som indikerer at menneske HpSC-avledet humanisert mus lever er lik modne og funksjonelle "menneskelige organer" og har potensielle bruksområder i legemiddelutvikling. Disse resultatene ytterligere bekrefter at Alb-treck / SCID mus er en ideell modell for humanisert leveren generasjon. Til tross for utsiktene og fordeler Alb-treck / SCID mus som en ideell modell for menneskelig leverstamcelle-avledet humanisert leveren generasjon, har de en unik ulempe; når menneskelig annonseULT hepatocytter ble transplantert inn i tre Alb-treck / SCID-mus som ble behandlet med en enkelt dose av DT, ble det ikke humaniserte lever generert, muligens fordi human voksen leverceller mangler proliferativ kapasitet. Ytterligere doser av DT kan ikke gis etter transplantasjon av voksent menneske hepatocytter; Siden DT-reseptoren (HB-EGF) i Alb-treck / SCID-mus hepatocytter er under kontroll av de albumin-promoteren, mer DT behandling vil ødelegge de transplanterte humane hepatocytter voksen i muselever.
Så langt vi kjenner til, er dette den første modellen til å generere en humanisert leveren fra umodne menneskeceller. Cell erstatningsrate etter transplantasjon er påvirket av mottakeren mikro-miljøet (for eksempel lever nisje) og donor celle egenskaper, som for eksempel moden vs. umoden og proliferativ og differensial evne. Kombinere Alb-treck / SCID med stamcelletransplantasjon vil gi optimaliserte forhold og fordeler for generering av menneskeliganskaffe lever. Dette utgjør også et kraftig verktøy for transplantasjon av føtale leverceller og eventuelt i tillegg til IPS eller ES-avledede leverceller siden før DT behandling, de Alb-treck / SCID-dyr opprettholdt i en sunn tilstand, er leverskade induserbar til enhver punkt, og musene avle vanligvis uten nyreskade. I kontrast, uPA / SCID mus utviser høy neonatal dødelighet og er vanskelige å avle. Dessuten kan overekspresjon av urokinase i dyrene føre til alvorlig blødning og nyreskade, og derfor er det et begrenset vindu av muligheter for celletransplantasjon før avvenning; Alb-treck / SCID kan brukes til celletransplantasjon i alle aldre.
Den vellykkede generering av en humanisert muselever krever følgende kritiske trinn: 1) Leverskade bør begrenses til sub-letal nivåer (vanligvis ved hjelp av den letale dose, 50%); 2) Det humane primære føtale leverceller bør opprettholdes i et sub-konfluent status ikke er større enn 90%;3) Cell lekkasje post intrasplenic-transplantasjon bør forebygges; og 4) Nivåene av menneskelig albumin i musesera bør overvåkes med jevne mellomrom. En omfattende forståelse av de kritiske faktorer som er involvert i prosessen med humanisert muselever generasjon kan bidra til ytterligere modifikasjoner eller ny utvikling som anvender rotter eller andre dyr. Mulige tilpasninger inkluderer: induksjon av nyreskade for å undersøke utviklingen og reparasjon med menneskelige nephrons, deres forfedre, og samle duct celler og selvbygging av menneskelige nephrons inn tredimensjonale strukturer i musekroppen; studere reparasjon av holmen skader i bukspyttkjertelen ved hjelp av bukspyttkjertelen stilk / stamceller hentet fra direkte omprogrammeres, IPS eller ES-celler. Eksempler på prosessmodifikasjoner omfatter: kontrollerende vev eller organ skade med giftstoffer eller kjemikalier som retrorsine, streptozotocin, eller cisplatin å lette konkurranse av donorceller med bosatt celler; unngådifferensial eller redusere proliferasjon for å øke den proliferative kapasiteten til donorcellene, og dermed fremme utskifting av mottakercellene, for eksempel ES eller iPS- avledet celler; Velg en passende transplanterte nettsider og kontrollerende celle infusjon for å sikre effektiv transplantasjon, for eksempel ved hjelp av portalen eller halevenen for entopic transplantasjon og mesenteriet og nyrekapselen for ektopisk transplantasjon; overvåking erstatning status via uttrykket av vev eller organ utskilt proteiner representant for stilk / progenitor eller umodne celler transplantasjon og kreft celle tracing, slik som alfa fetoprotein eller transferrin.
I sammendraget, Alb-treck / SCID mus utgjør en passende modell for menneskelig leverstamcelletransplantasjon, som de gir et gunstig miljø som gir mulighet for differensiering til modne hepatocytter. Denne romanen modellen har enorm applicative potensial, ikke bare for ex vivo ekspansjon av humane hepatocytter but også for narkotika-skjermer og teste kandidat terapeutiske legemidler for levertoksisitet og metabolisme. I tillegg vil disse resultatene hjelpe til fremme av fremtidige studier som undersøker den kliniske anvendelse av denne teknikken for å humane levercelletransplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
- Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
- Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
- Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
- Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
- Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
- Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
- Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
- Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
- Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
- Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
- Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
- Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
- Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
- Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
- Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
- Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).
