Protocol
Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados de acordo com as Diretrizes de Proteção aos Animais de Yokohama City University.
1. geração do modelo Hepática Aguda Lesão Rato
- Adicionar 1 ml de solução de NaCl a 0,85% de fenol (0,6 g de fenol em 100 ml de solução de NaCl a 0,85%) para 1 mg de toxina da difteria (DT) para fazer um / ml de solução stock de 1 mg DT. Nota: DT a uma concentração de 1 mg / ml pode ser armazenado por cerca de 2 anos a 3 ° C e 8 ° C.
- Serialmente diluir a solução de 1 mg / ml da DT para 0,3 ug / mL em solução de DT fenol a 0,85% de NaCl e preparar-se uma alíquota da solução de DT / ml 0,3 ug como uma solução de trabalho. Nota: Esta solução de trabalho deve ser preparada.
- Para realizar experiências utilizando uma dose subletal (~ 50% de letalidade), administrar ratinhos de 8 semanas de idade, um / kg de dose de 1,5 ug de DT.
- Realizar uma injeção intraperitoneal de DT, mantendo o rato em decúbito dorsal e inserir o needle abaixo da curva dos joelhos, para a esquerda ou direita da linha média. Evitar a linha média para evitar a penetração da bexiga. Ângulo a agulha em aproximadamente 45 ° em relação ao corpo.
- Usando uma seringa de insulina, administrada a ratos com 100 uL de recém-preparados 0,3 ug / ml de DT por 20 g de peso do rato. Por exemplo, um 18-g rato deve recebem 90 ul da solução de DT / ml 0,3 ug.
- A 48 h após a injecção DT, recolha de sangue a partir da veia da cauda, colocando o rato num limitador e o aquecimento da cauda do rato num banho de água a 37 ° C durante aproximadamente 10 min para dilatar os vasos sanguíneos. Em seguida, fazer uma de 1 mm do entalhe em cauda de 2 cm da ponta com um bisturi afiado da lâmina e recolher o sangue com um tubo microcapilar.
- Centrifuga-se o tubo microcapilar contendo o sangue a 1500 xg durante 5 minutos e recolher o soro, separando o sobrenadante e pelete de células.
- Pipeta 50 ul de 01:20 soro de ratinho diluído Onto GOT / AST-PIII desliza. Medir a absorvância do produto de reacção (corante azul) a 650 nm, utilizando um multi-usos analisador automático de química seca de acordo com o protocolo do fabricante.
NOTA: A leitura de aspartato aminotransferase (AST) / atividade glutâmico transaminase oxalacética (GOT) é exibido automaticamente. 2 dias após a injecção de DT, cerca de 60% dos ratinhos exibiram valores de AST entre 12.000 - 16.000 UI / L e foram consideradas como sofrendo de lesão hepática aguda. Estes ratos foram transferidos para uma gaiola nova e utilizada como receptores de transplante de células.
2. Preparação de células-tronco hepáticas humanas
- Isolar células estaminais hepáticas humanas a partir de células fetais humanas primárias do fígado, com um classificador de células utilizando os antigénios de células CDCP1, CD90, e CD66 para obter uma subpopulação CDCP1 + CD90 + CD66-, em seguida, propagar a população de células isoladas em placas de cultura de colagénio IV-revestidas, como relatado anteriormente 15. Use células fetais humanas primárias do fígado de um embriãoidade entre as semanas 14 e 18.
- Recolher as células estaminais hepáticas humanas cultivadas para 80% - 90% de confluência em placas de cultura de 100 mm, aspirar o meio de cultura, lavar as células com 10 ml de PBS, e em seguida remover o PBS. Tripsinizar as células com solução de tripsina / EDTA a 2 ml de 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Nota: As células em mais do que 90% de confluência não são adequados para o transplante de células uma vez que a diferenciação das células pode influenciar a sua capacidade proliferativa em murganhos.
- Monitorizar o estado de dispersão de células sob um microscópio. Quando as células parecem ser flutuante ou fluindo livremente, parar a digestão enzimática por adição de 8 ml de DMEM / F12 contendo 10% de FBS.
- Suspender as células lentamente com uma pipeta serológica de 10 ml e transferência das células para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugar as células durante 5 min a 100 xg e 4 ° C.
- Cuidadosamente ressuspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM / F12 contendo 10% de FBS e determinar o número de células utilizando um microscópio de câmara de contagem.
- Dividir as células em 1,0 x 10 6 culas por 50 ul de PBS alíquotas para cada ratinho individual e armazenar em gelo até à transplantação.
3. interna do baço transplante de células-tronco hepáticas humanas
- Coloque uma gaiola limpa em uma temperatura de 37 ° C almofada de aquecimento elétrico.
- Anestesiar o rato usando isoflurano inalação (1 - 1,5% (vol / vol) em 2 L de oxigénio por minuto), colocando-o por debaixo do bocal. Como alternativa, use tubos contendo gaze embebida com isoflurano.
- Certifique-se de que o rato é anestesiado por beliscar levemente na pata traseira. Se um empurrão de joelho é provocada, coloque o mouse de volta na câmara. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
- Raspar o local da cirurgia usando cortadores elétricos e aplicar 70% (/ vol vol) de etanol e iodopovidona para esterilizar. Em seguida, fazer uma incisão na pele de 1 cm no flanco esquerdo, logo abaixo da borda costal das costelas, seguido por uma incisão naa parede abdominal, bem como o peritoneu.
- Cuidadosamente expor o baço. Utilize uma seringa microinjecção de 100 ul, com uma agulha de 32 G 1/2-inch de injectar directamente 1,0 x 10 6 células estaminais hepáticas humanas em 50 ul de PBS para o baço de cada rato. Inclinar a agulha com um ângulo de 5 ° para injecção.
- Assegure-se que a profundidade de injecção é menos do que metade da espessura do baço. A agulha deve entrar no baço em uma extremidade (cabeça) e depositar as células na outra extremidade (a cauda).
- Para evitar vazamento das células após a injeção, aplicar suavemente pressão usando um dedo por 2 min e em seguida, remover a agulha.
- Colocar o baço de volta para dentro do corpo do rato e fechar a cavidade com uma sutura contínua normal para a musculatura e da pele.
- Transferir os ratos em uma gaiola de 37 ° C pré-aquecido imediatamente após o transplante. Para garantir o mouse é capaz de respirar confortavelmente, coloque o mouse sobre o seu lado na gaiola, umanulando o contacto entre a cama gaiola e no local da cirurgia.
- Monitorar os ratos até que a anestesia desgasta fora para garantir as suturas permanecem fechados e os ratos regressar às condições-cirurgia pré.
- Assegurar a ratinhos são fornecidas com água de beber normal e comida. Depois de 1 hora, volte a gaiola para a sala de rato do centro do animal e monitorar os ratos diariamente.
4. Detecção de Transplanted hepática estaminais humanas hepatócitos derivados de células do fígado do rato
Nota: Para os seguintes procedimentos, todos os animais a eutanásia, usando uma overdose de cetamina e xilazina, seguido por deslocação cervical.
- Aos 4 - 6 semanas após o transplante, eutanásia os ratos e abrir a cavidade abdominal, cortando simultaneamente, a cútis e fáscia usando uma tesoura cirúrgica.
- Dissecar o tecido conjuntivo acima do peritônio, usando a tesoura como um difusor, e cortar o peritônio ao longo da linha alba para abrir o peritonealcavidade.
- Levante o esterno com uma pinça, perfurar o diafragma, e cortar cada lado do esterno-se através do cinto de colo do útero.
- Cortar a veia cava do lado torácica do fígado e puxar o esófago através do fígado na direcção anterior. Remover o diafragma, a fim de remover o fígado.
Nota: Tenha cuidado para manter as pontas das tesouras apontou para cima, a fim de evitar qualquer dano aos órgãos torácicos embaixo. O timo tem uma tendência a agarrar-se ocasionalmente para o lado dorsal do esterno e isso deve ser evitado com cuidado. - Usando o diafragma como uma pega, começam a puxar o fígado para fora da cavidade abdominal. A veia cava interior vai realizar o fígado no lugar. Corte o interior da veia cava; ter cuidado para não libertar prematuramente da adrenal direita.
Nota: Os ratos têm um fígado de quatro lóbulos consistindo de um lobo médio, lobo esquerdo, lobo direito e do lobo caudado. A vesícula é suspenso na pequena bifurcaçãoo lobo mediano. - Separa-se os lóbulos de cada outro nas junções e incorporá-los no composto óptima temperatura de corte (OCT), de acordo com o protocolo do fabricante. Congelar o OCT contendo o tecido do fígado nas grades de metal do criostato.
- Cortar secções de amostra de 5 um de espessura, utilizando um criostato a -18 ° C e montá-los em lâminas de microscópio RT. Armazenar o estoque a -80 ° C. Preparar as lâminas para hematoxilina e eosina (H & E) e imunofluorescência de acordo com os procedimentos relatados anteriormente 16.
5. Detecção de albumina humana e Secreção Cálculo da proteína quimérica Classificação
- Para medir a reconstituição de fígado humano, albumina humana realizar ELISA utilizando soro de albumina e um kit de ELISA humano de acordo com as instruções do fabricante.
- Calcula-se a taxa de fígado quimérico humanizado por em tempo real A análise de PCR dos níveis de expressão no todo-o fígado humanizado. Determine o ex relativapression rácio nível de actina específicos de humano para cruz actina de ratinho-humano (razão 1) e a razão entre actina específica-rato a cruz actina de ratinho-humano (razão 2). A taxa quimérica é calculado como a relação 1 / (proporção de 1 +, entre 2).
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Representative Results
Alb-TRECK / hepatócitos ratos SCID expressam o receptor DT gene HB-EGF humano sob o controlo de um promotor de albumina e exibem efeitos citotóxicos após a administração DT 12. Para avaliar os efeitos do tratamento sobre a lesão hepática DT, DT doses de 1,5 ug / kg foram injectadas em ratinhos SCID de 8 semanas de idade, Alb-TRECK / e as alterações patológicas no administração DT hr pós fígado 48 foram avaliados histologicamente. Em comparação com ratos de controlo (não tratados com DT), os ratos tratados com DT exibiu uma arquitetura hepática desorganizado que mostra uma correção para o congestionamento com o aumento da atividade da AST no soro. Além disso, os hepatócitos de ratos tratados com DT tinha múltiplas profundamente manchados inclusões citoplasmáticas, acidofílicas em conjunto com núcleos escuro (mais provavelmente hepatócitos apoptóticos); alguns outros hepatócitos pareciam conservados ou exibiram um citoplasma vacuolado com núcleos escuros com pouca ou nenhuma inflamação da veia porta (Figura 1 12.
HpSCs humanos podem ser utilizados para a longo prazo na cultura in vitro e exibem morfologia de células uniforme, com alguns ALB e menos células CK19-positiva. Em 6 semanas após o transplante para os fígados de rato, os HpSCs humanos foram submetidos a exame básico sob um microscópio e histologicamente avaliadas; Foram observadas HpSCs humanos ter reconstituído a estrutura do fígado através da substituição dos hepatócitos de rato original (Figura 2). Macroscopicamente, aos 4 dias após o transplante HPSC humano, pequenos agrupamentos hepáticas humanas que foram distribuídos uniformemente em torno do fígado foram detectados; aos 45 dias pós-transplante, estes tinham proliferado em grandes aglomerados (Figura 3). Quemle fígados de rato reconstituídos com hepatócitos humanos foram designados "fígados humanizados". Estes resultados indicam que os ratos com insuficiência hepática fulminante letal que sofrem transplante HPSC humano pode apresentar estruturas hepáticas semelhantes àquelas observadas em fígados normais de ratinho.
Antes de testar se os hepatócitos humanos transplantados para ratos imaturos tinha o potencial para diferenciação e poderia funcionar in vivo, a presença de hepatócitos humanos em fígados de rato foi confirmada primeiro por análise imuno-histoquímica em aproximadamente seis semanas pós transplante HPSC humano. secções de fígado de ratos com repovoamento celular humana 60% que especificamente e positivamente co-coradas com núcleos humanos e citoqueratina humana 8/18 (18 / Ck8) anticorpos foram encontrados para conter hepatócitos humanos derivados de células dadoras, enquanto que os ratos de controlo fígados original eram negativo para os marcadores (Figura 4).
in vivo, a expressão da albumina humana (ALB) e citoqueratina humana 19 (CK19) foi avaliada por imunohistoquímica. Humanos hepatócitos humanos HPSC derivados foram bem diferenciados nos fígados de rato e exibiu upregulated expressão ALB humano. Hepatócitos humanos ALB-positivos e negativos CK19-se assemelhava hepatócitos funcionais, enquanto que as células que co-coradas positivamente com ALB humana e CK19 exibiram capacidade para se diferenciarem em bipotenciais hepatócitos e cholangiocytes (Figura 5). Um método de digitalização em grande escala usada para analisar todos os lobos do fígado humanizados HPSC derivados humanos revelou a presença de múltiplas rodadas e aglomerados de colónias-like que cercam os lobos do fígado com núcleos humanos claras e CK8 expressão / 18 (Figura 6), demonstrando a de colônias formando capacidade de HpSCs humanos nos fígados humanizados. O nível de repovoamento atingiu até 90%de um mês após o transplante (Figura 7A) e a secreção de albumina humana foi detectado no fígado dos ratos repopulated (Figura 7B), o que indica que HpSCs humanos pode reconstituir com sucesso o / fígado de ratinho SCID-Alb TRECK. Estes resultados demonstram que HpSCs humanos apresentam um elevado potencial para se diferenciarem em hepatócitos funcionais in vivo em resposta ao salvamento de funções do fígado do rato defeituosos.
Figura 1. danos ao fígado ocorre em Alb-TRECK / SCID (Toxina Receptor Mediated celular Knockout) Ratos Após Difteria toxina (DT) Injection. Histologia (coloração hematoxilina-eosina) de fígados de rato sem e com administração DT após 48 horas. DT de dose: 1,5 ug / kg, a actividade AST sérica de fígado normal (painel da esquerda): 30 UI / L; atividade sérica da AST de fígado tratados DT (painel direito): 15000UI / L. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. O transplante de células-tronco hepáticas humanas em Alb-TRECK / SCID com fulminante insuficiência hepática. Vista macroscópico (painel esquerdo) e análise histológica (coloração hematoxilina-eosina, painel da direita) de fígados humanizados com HpSCs humanos em 6 semanas após o transplante . m, região de fígado de rato; H, doador humano de células-derivadas região humana. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
<br /> Figura 3. Análise macroscópica da humanizados fígados derivadas de células estaminais hepáticas humanas marcadas com proteína verde fluorescente. imagens de alta ampliação da estrutura do fígado 4 dias (painel esquerdo) e 45 dias (painel direito) após o transplante hepático com haste humano células (HpSCs). Células-tronco hepáticas humanas (HpSCs) foram marcadas com reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) usando um vetor lentivírus. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Caracterização dos hepáticas humanas Stem análise imunohistoquímica hepatócitos humanos em Alb-TRECK / SCID. Derivadas de células distinguir entre hepatócitos humanos corados com CK8 / 18 (verde) antigénio anti-humano e anti-h antígeno nuclear uman (azul do aqua) em fígados derivadas de células-tronco hepática humanos humanizados em 6 semanas pós-transplante. m, região de fígado de rato; H, doador humano de células-derivadas região do fígado humano. Branca tracejada linha: região de fígado de rato vs. região fígado humano. Os núcleos foram contrastadas com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (azul). Barras de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. hepáticas humanas células-tronco diferenciadas em humanizados Fígados de Alb-TRECK / SCID. Imunohistoquímica análises de albumina humana e CK19 humana em fígados HPSC derivados em 6 semanas pós-transplante. Os núcleos foram contrastadas com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (azul). Barras de escala = 100 pm.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Vários clusters de hepáticas humanas Células-tronco derivadas de células estão presentes em Alb-TRECK / SCID com humanizados Fígados. Várias grandes aglomerados derivadas de células-tronco hepáticas humanas foram identificadas nos lobos hepáticos em 6 semanas após o transplante por análise de imuno-histoquímica para humana CK8 / 18 (verde) e núcleos humana (azul do aqua). Barras de escala = 1.000 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. HumanizadoFígado Repovoamento Taxa e Albumina Humana secreção em Alb-TRECK / SCID. (A) a taxa quimérico em Alb-TRECK após o transplante de células-tronco hepáticas humanas / SCID camundongos 1 mês; os dados são apresentados como média ± EPM (n = 12). Teste de Mann-Whitney: P <0,0005 para Sham e HpSCs humanos (B) Detecção de albumina humana em soros de rato de um mês após o transplante de células do dador.. Dados = média ± SEM (n = 5). teste de Mann-Whitney: P = 0,0313 para Sham e HpSCs humanos. ND: não detectável; Sham: murganhos transplantados com PBS; HpSCTx:. Ratos transplantados com HpSCs humanos Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Estudos recentes têm mostrado que o fígado do rato podem ser repovoada com hepatócitos humanos, incluindo hepatócitos e células estaminais adultas hepáticas proliferativas 17. Estes repopulated fígados foram utilizados como modelos experimentais pré-clínicos para drogas de teste do metabolismo e da descoberta e desenvolvimento de medicamentos 18; Além disso, eles têm proporcionado um ambiente in vivo para a maturação e diferenciação celular 19. O principal objetivo do presente estudo foi o de criar um modelo de rato doença hepática romance que permitiu a proliferação humano imaturo hepatócito, maturação e diferenciação, para a aquisição de atividades do metabolismo de drogas.
O curso de transplante interna do baço foi estudada extensivamente. As células transplantadas para o baço de ratos e camundongos sobreviver durante toda a sua vida média. O protocolo de transplante interna do baço tem provado ser muito útil na investigação de questões de pesquisa específicos;muitos laboratórios em todo o mundo têm tentado utilizar este protocolo como um modelo altamente reprodutível e confiável para o transplante de células hepáticas por causa da melhora da sobrevida ratos e fígado regeneração. No entanto, a implantação de células na polpa esplénica representa um risco, uma vez que a maioria das células implantadas vão translocar para o fígado onde podem ocluir ramos portais. Mesmo que este a oclusão pode ser temporária e não pode afectar um ambiente de fígado saudável, em caso de danos no fígado pré-existente, este procedimento podia reduzir ainda mais a função do fígado e aumentar a hipertensão portal e também pode influenciar negativamente o enxerto de células. Embora tenhamos aplicado com sucesso o transplante de hepatócitos usando transplante interna do baço, várias questões justificam um estudo mais aprofundado, especialmente objecto de potenciais fontes de células novas. Além disso, ao realizar o transplante de hepatócitos interna do baço, o limite de carga de células devem ser rigorosamente seguidas de forma a evitar riscos de perturbação pormicrocirculação hepática remanescente. O receptor de DT foi identificado como uma forma ancorada à membrana do factor de ligação a heparina do tipo EGF de crescimento (HB-EGF precursor) 20. Considerando precursores HB-EGF derivados de animais sensíveis à toxina, tais como os seres humanos e macacos, DT ligamento e funcionam como receptores de toxina, precursores HB-EGF de camundongos e ratos não se ligam DT 21. A / modelo de ratinho SCID transgénico Alb-TRECK expressa receptores de HB-EGF humano sob o controlo de um promotor de albumina específica da célula do fígado; após a administração de DT, estes murganhos desenvolvem insuficiência hepática fulminante devida a ablação condicional de hepatócitos, proporcionando espaço para a residência célula do dador e a proliferação. Hepatócitos humanos, mesmo em uma fase imatura, são conhecidos por possuir ampla capacidade proliferativa in vitro, embora eles perdem suas funções do metabolismo de drogas, limitando suas aplicações pré-clínicos 22. Os achados histológicos e imuno-histoquímico obtidos após o transplantation de HpSCs humanos em Alb-TRECK / SCID com insuficiência hepática fulminante letal indicaram que os HpSCs humanos poderia expandir e reconstituir as estruturas de fígado de rato danificados; a taxa de repovoamento de alguma ratinhos foi quase 100%.
Em nossos experimentos, o transplante HPSC humana promovendo a sobrevivência do mouse e resultou em aumento da secreção de ALB humana em soros de rato 16. Essas células também amadureceu e diferenciada in vivo e exibiu atividades do metabolismo de drogas humanos, indicando que humanos HPSC derivados de fígado de ratos humanizados são semelhantes a amadurecer e funcionais "órgãos humanos" e tem aplicações potenciais em desenvolvimento de drogas. Estes resultados confirmam ainda que a Alb-TRECK / SCID ratinho é um modelo ideal para a geração de fígado humanizado. Apesar das perspectivas e vantagens da Alb-TRECK / SCID como um modelo ideal para a geração de fígado humano haste hepática derivada de células humanizados, que possuem uma desvantagem única; quando ad humanault hepatócitos foram transplantadas em três ratinhos SCID Alb-TRECK / tratados com uma dose única de DT, não há fígados humanizados foram gerados, possivelmente porque hepatócitos humanos adultos carecem da capacidade proliferativa. doses adicionais de DT não pode ser administrado após o transplante de hepatócitos humano adulto; uma vez que o receptor de DT (HB-EGF) em Alb-TRECK / hepatócitos ratos SCID está sob o controlo do promotor de albumina, o tratamento adicional DT irá destruir os hepatócitos adultos humanos transplantados no fígado do rato.
Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro modelo para gerar um fígado humanizado a partir de células humanas imaturas. Taxa de substituição celular pós-transplante é influenciada pelo receptor de micro-ambiente (por exemplo, nicho hepática) e as propriedades das células do doador, como madura vs imaturo e proliferativa e capacidade diferencial. Combinando Alb-TRECK / SCID com transplante de células estaminais irá proporcionar condições otimizadas e vantagens para a geração de humanofígados ized. Isto constitui também uma ferramenta poderosa para o transplante de células fetais de fígado e potencialmente bem como PE ou ES-derivados de células hepáticas, uma vez antes do tratamento DT, os / animais SCID Alb-TRECK são mantidas num estado saudável, danos no fígado é indutível em qualquer ponto, e os ratos se reproduzir normalmente sem dano renal. Em contraste, uPA / SCID apresentam elevada mortalidade neonatal e são difíceis de reproduzir. Além disso, a sobre-expressão de uroquinase em que os animais podem originar hemorragias graves e lesões renais e, assim, há uma janela de oportunidade limitada para o transplante de células antes do desmame; Alb-TRECK / SCID podem ser usadas para transplante de células em qualquer idade.
A geração bem sucedida de um rato fígado humanizado requer os seguintes passos essenciais: 1) lesão hepática deve ser limitado a níveis sub-letais (normalmente utilizando a dose letal, 50%); 2) As células de fígado fetais primários humanos deve ser mantido num estado de sub-confluência não superior a 90%;3) vazamento de celular pós-transplante interna do baço deve ser impedida; e 4) Os níveis de albumina humana em soros de rato devem ser monitorizados em intervalos regulares. Uma compreensão abrangente dos fatores críticos envolvidos no processo de geração de fígado de rato humanizado pode contribuir para outras modificações ou novos desenvolvimentos, utilizando ratos ou outros animais. adaptações possíveis incluem: a indução de lesão renal pela análise de desenvolvimento e reparo com néfrons humanos, os seus progenitores, e coleta de células do ducto e da auto-montagem de néfrons humanos em estruturas tridimensionais do corpo do rato; estudar a reparação de danos ilhota no pâncreas, usando células-tronco / progenitoras pancreáticas derivados, iPS, ou células ES diretamente reprogramadas. Exemplos de modificações de processo incluem: controlar nos tecidos ou lesões de órgãos com toxinas ou produtos químicos, como retrorsine, estreptozotocina, ou cisplatina para facilitar a concorrência das células do doador com células residentes; evitandodiferencial ou diminuir a proliferação a fim de aumentar a capacidade proliferativa das células do doador, promovendo, assim, a substituição de células recipientes, tais como ES ou IPS-células derivadas; selecionando uma série de sites de transplante adequados e controlar a infusão de células para garantir o transplante eficiente, por exemplo, usando o portal ou a cauda veia para transplante entopic e do mesentério e cápsula renal para transplante ectópica; monitorização do estado de substituição através da expressão de tecido ou órgão proteínas secretadas representante do tronco / progenitoras ou células imaturas de transplantes e de células de câncer de rastreamento, tais como alfa-fetoproteína ou transferrina.
Em resumo, ratinhos SCID Alb-TRECK / constitui um modelo adequado para o transplante de células-tronco hepática humana, uma vez que proporcionam um ambiente benéfico que permite a diferenciação em hepatócitos maduros. Este novo modelo tem um tremendo potencial do aplicativo, não só para a expansão ex vivo de hepatócitos humanos but também para telas de drogas e testar candidatos drogas terapêuticas para a toxicidade hepática e metabolismo. Além disso, estes resultados vai ajudar no progresso de estudos futuros que examinam a aplicação clínica desta técnica para transplante de células hepáticas humanas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
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