Protocol
Все экспериментальные процедуры животных были проведены в соответствии с Руководством по защите животных от Yokohama City University.
1. Генерация модели острого печени Травма мыши
- Добавить 1 мл phenolized 0,85% раствора NaCl (0,6 г фенола в 100 мл 0,85% раствора NaCl) до 1 мг токсина дифтерии (DT), чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора DT. Примечание: ДТ в концентрации 1 мг / мл может храниться в течение приблизительно 2 лет при 3 ° С до 8 ° С.
- Серийно разбавить 1 мг / мл маточного раствора ДТ до 0,3 мкг / мл DT в phenolized 0,85% раствором хлорида натрия и готовят аликвоты 0,3 мкг / мл раствора DT в качестве рабочего раствора. Примечание: Этот рабочий раствор должен быть свежеприготовленным.
- Для проведения экспериментов с использованием сублетальных дозы (~ 50% летальность), управлять 8-недельных мышей в возрасте 1,5 мкг / кг дозы DT.
- Выполните внутрибрюшинную инъекцию DT, держа мышь в спинных лежачее и вставьте needlе ниже сгиба колен, слева или справа от средней линии. Избегайте средней линии, чтобы предотвратить проникновение в мочевой пузырь. Угол иглы под примерно 45 ° по отношению к телу.
- Использование инсулиновый шприц, вводят мышам с помощью 100 мкл свежеприготовленного 0,3 мкг / мл DT на 20 г веса мыши. Например, 18-г мыши должен получить 90 мкл 0,3 мкг раствора DT / мл.
- В 48 ч после инъекции дт, собирают кровь из хвостовой вены, помещая мышь в фиксатор и нагревая хвост мыши на водяной бане 37 ° С в течение приблизительно 10 мин, чтобы расширить кровеносные сосуды. Затем, сделайте 1-мм ник в хвост 2 см от кончика с острым скальпелем и собирают кровь с микрокапиллярной трубкой.
- Центрифуга микрокапиллярной трубки, содержащей кровь при 1500 х г в течение 5 мин и собирают сыворотку отделение надосадочной жидкости и осадка клеток.
- 50 мкл 1:20 разбавленной сыворотки мыши на GOT / AST-PIII скользит. Измеряют поглощение продукта реакции (синий краситель) при 650 нм с использованием многоцелевой автоматического анализатора сухим химии в соответствии с протоколом производителя.
Примечание: для чтения из аспартатаминотрансферазы (АСТ) / отображается автоматически глутаминовой щавелевоуксусной трансаминазы (GOT) активность. 2 дня после инъекции DT, примерно 60% мышей выставлены значения AST между 12000 - 16000 МЕ / л и были рассмотрены, страдают от острого повреждения печени. Эти мыши были переведены в новую клетку, и использовали в качестве реципиентов трансплантата клеток.
2. Подготовка печени человека стволовых клеток
- Изолировать печени человека стволовые клетки из первичных клеток эмбриональной печени человека с использованием клеток сортировщика антигены CDCP1, CD90 и CD66 клеток для получения субпопуляции CDCP1 + CD90 + CD66-, затем засеять популяцию клеток изолированных на коллаген IV покрытием блюда культуры, как сообщалось ранее 15. Используйте первичные эмбриональные клетки печени человека зачаточномвозраст от 14 до 18 недель.
- Собирают печени человека стволовые клетки культивировали до 80% - 90% слияния на чашки для культивирования 100 мм, аспирация культуральной среды, промыть клетки с 10 мл PBS, а затем удалить PBS. Trypsinize клетки с 2 мл 0,05% -ного раствора трипсина / ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С. Примечание: Клетки в более чем 90% слияния, не подходят для трансплантации клеток, так как дифференцировка клеток могут влиять на их способность пролиферативный у мышей.
- Контроль состояния дисперсии клеток под микроскопом. Когда клетки кажутся плавающими или течет свободно, остановить ферментативного расщепления путем добавления 8 мл DMEM / F12, содержащей 10% FBS.
- Суспендирования клеток медленно с помощью 10 мл серологической пипеткой и переносят клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 100 х г и 4 ° С.
- Аккуратно ресуспендируют осадок клеток в 10 мл DMEM / F12, содержащей 10% FBS и определяют количество клеток с помощью микроскопа счетнокамерное.
- Разделить ячейки в 1,0 × 10 6 клеток на 50 мкл PBS аликвоты для каждой отдельной мыши и не хранить на льду до трансплантации.
3. внутриселезеночное Трансплантация печени человека стволовых клеток
- Поместите чистую клетку на 37 ° C электрический грелку.
- Обезболить мыши с помощью изофлуран ингаляции (1 - 1,5% (об / об) в 2 л кислорода в минуту), поместив ее под соплом. В качестве альтернативы, используйте пробирки, содержащие марлю, смоченную изофлуран.
- Убедитесь в том, что мышь находится под наркозом, слегка зажимая заднюю лапу. Если коленный рефлекс выявляется, поместите мышь обратно в камеру. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Бритье хирургический сайт, используя электрические ножницы и применять 70% (по объему / об) этанола и повидон-йода для стерилизации. Затем делают разрез кожи 1 см в левый бок чуть ниже реберной границы ребер, а затем разрез набрюшной стенки, а также брюшину.
- Осторожно обнажения селезенки. С помощью 100-мкл микроинъекции шприц с 32-G 1/2-дюймовый иглу , чтобы непосредственно вводить 1,0 × 10 6 печени человека стволовых клеток в 50 мкл PBS в селезенку каждой мыши. Наклоните иглу под углом 5 ° для инъекций.
- Убедитесь, что глубина инъекции составляет менее половины толщины селезенки. Игла должна войти в селезенку на одном конце (голова) и хранение клеток на другом конце (хвост).
- Для того, чтобы предотвратить утечку клеток после инъекции, осторожно применять давление с помощью пальца в течение 2 мин, а затем удалить иглу.
- Поместите селезенку обратно в тело мыши и закрыть полость с нормальной проточной шву для мускулатуре и кожи.
- Передача мышей в 37 ° C подогретого клетки сразу же после трансплантации. Для обеспечения мышь способна дышать комфортно, поместите курсор на его стороне в клетке, Аопорожнять контакт между клеткой и подстилки месте операции.
- Монитор мышей до анестезии не спадет, чтобы обеспечить швы остаются закрытыми и мыши вернуться к предоперационного условия.
- Убедитесь, что у мышей обеспечены нормальной питьевой водой и пищей. Через 1 ч возвращают в клетку в комнату мыши центра животных и контролировать мышей ежедневно.
4. Обнаружение пересаженных печени человека стволовых клеток, полученных из гепатоцитов в печени мышей
Примечание: Для следующих процедур, усыпить всех животных с помощью передозировки кетамина и ксилазина с последующим смещением шейных позвонков.
- Через 4 - 6 недель после трансплантации, эвтаназии мышей и открыть брюшной полости за счет одновременного разрезания кутис и фасции с помощью хирургических ножниц.
- Рассеките соединительной ткани над брюшины, используя ножницы, как расширитель, и разрезают брюшину вдоль белой линии, чтобы открыть брюшнуюполость.
- Lift грудину с пинцетом, проколоть мембрану, и прорезать каждую сторону от грудины вверх через цервикальный пояском.
- Отрежьте полую вену на грудном стороне печени и тянуть пищевод через печень в переднем направлении. Извлеките диафрагму, чтобы удалить печень.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы держать кончики ножниц указал вверх, чтобы предотвратить повреждения органов грудной клетки внизу. Тимус имеет тенденцию иногда цепляются к спинной стороне грудной кости, и это должно быть тщательно избегать. - С помощью диафрагмы в качестве ручки, начинают вытягивать печень из брюшной полости. Внутренняя полая будет держать печень на месте. Обрежьте внутреннюю полую вену; будьте осторожны, чтобы не преждевременно освободить правый надпочечник.
Примечание: Мыши имеют четыре-лопастные печень, состоящую из средней доли, левой доли, правой доли, и хвостатого мочку. Желчный пузырь суспендируют в небольшом раздвоениюмедианная лопасть. - Отдельные лепестки друг от друга на стыках и встраивать их в оптимальной температуры резания (ОКТ) соединения в соответствии с протоколом производителя. Замораживание ОКТ, содержащий ткани печени в металлических сеток на криостата.
- Вырезать 5-мкм срезы толщиной образца с помощью криостата при температуре -18 ° C и смонтировать их на предметные стекла микроскопа RT. Хранить запас при -80 ° С. Подготовьте слайды для гематоксилином и эозином (H & E) и иммунофлюоресценции окрашивания в соответствии с ранее описанными процедурами 16.
5. Обнаружение Альбумин человека секретируемых Расчет химерного Rate
- Для измерения человеческого воссоздание печени, проводить человеческого альбумина ELISA с использованием сыворотки и человеческого альбумина ELISA набор в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Вычислить гуманизированного печени химерный скорость путем ПЦР в реальном времени анализ уровней экспрессии во всем-гуманизировать печени. Определить относительную ехотношение уровней прижимное актина человека специфичные для человека и мыши кросс актина (соотношение 1) и отношение мыши конкретных актина к человеческой-мышиной поперечному актина (отношение 2). Химерные ставка рассчитывается как отношение 1 / (соотношение 1 + 2) соотношение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alb-Treck / SCID мышей гепатоциты экспрессии человеческого рецептора DT HB-EGF ген под контролем промотора альбумина и проявляют цитотоксические эффекты после введения DT 12. Для того, чтобы оценить влияние лечения на ДТ поражения печени, DT дозы 1,5 мкг / кг вводили в 8-недельных Alb-Treck / SCID мышей и патологические изменения в администрации DT часов после печени 48 были оценены гистологически. По сравнению с контрольными мышами (не получавших ДТ), ДТ-обработанных мышей проявляли неорганизованное печеночной архитектуры, показывая коррекцию заторов с повышенной активностью в сыворотке крови АСТ. Кроме того, гепатоциты ДТ-обработанных мышей имели множественные, глубоко запятнанные ацидофильные цитоплазматические включения вместе с темными ядрами (вероятнее всего, апоптотических гепатоцитов); некоторые другие гепатоциты появились сохранились или выставлены вакуолизированы цитоплазму с темными ядрами с небольшим или вообще без воспаления воротной вены (рис 1 12.
Человеческие HpSCs могут быть использованы для долгосрочного экстракорпоральное культивирования и демонстрируют однородную морфологию клеток с некоторым ALB и меньшим количеством CK19-позитивных клеток. В 6 недель после трансплантации в печени мышей, человеческие HpSCs были подвергнуты основной исследования под микроскопом и оценивали гистологически; наблюдали человека HpSCs, что восстанавливают структуру печени путем замены исходных гепатоцитов мыши (рисунок 2). Макроскопически, на 4-й день после трансплантации человеческого HPSC, небольшие кластеры печени человека, которые были равномерно распределены вокруг печени были обнаружены; на 45 дней после трансплантации, они были пролиферируют в большие кластеры (Рисунок 3). КтоПечень ле мыши воссозданные с гепатоцитов человека были названы "очеловеченные печенки." Эти результаты указывают на то, что у мышей с летальной молниеносного печеночной недостаточности, что трансплантация HPSC человека может демонстрировать структуры печени, аналогичные тем, которые наблюдаются у нормальных печени мышей.
Перед испытанием были ли незрелые гепатоциты человека трансплантировали мышам потенциал для дифференциации и может функционировать в естественных условиях, наличие гепатоцитах человека в печени мышей впервые была подтверждена иммуногистохимического анализа приблизительно через 6 недель после трансплантации человеческого HPSC. срезов печени мышей с 60% репопуляции клеток человека, которые специфически и положительно окрашенных совместно с человеческими ядрами и человеческого цитокератином 8/18 были найдены (CK8 / 18) антитела содержат донорских клеток, полученных гепатоцитов человека, в то время как оригинальный контрольных мышей печень негативна для этих маркеров (рисунок 4).
в естественных условиях, экспрессия человеческого альбумина (альбумин) и человеческого цитокератином 19 (CK19) оценивали иммуногистохимии. Человеческие HPSC-полученные гепатоциты человека были хорошо дифференцированы в печени мышей и выставляются повышающей регуляции экспрессии ALB человека. Человеческие ALB-положительные и отрицательные CK19-гепатоциты напоминали функциональные гепатоциты, тогда как клетки , которые положительно совместно окрашивали с человеческим ALB и CK19 экспонируемых bipotential возможности для дифференциации в гепатоциты и холангиоцитов (рисунок 5). Крупномасштабное метод сканирования используется для анализа всех человеческих HPSC-производные гуманизированные долей печени показало наличие множественных круглых и колонии-подобных скоплений , окружающих лепестка печени с четкими человеческими ядрами и CK8 / 18 выражения (рисунок 6), демонстрируя колонии - формирование способности человека HpSCs в гуманизированных печенью. Уровень репопуляция достиг до 90%один месяц после трансплантации (7А) и секреции человеческого альбумина была обнаружена в заселен мышей печени (рис 7б), что указывает на человека HpSCs мог успешно воссоздать Alb-Treck / SCID печени мыши. Эти результаты показывают , что человеческие HpSCs имеют высокий потенциал для дифференцировки в функциональных гепатоцитов в естественных условиях в ответ на спасение дефектных функций печени мышей.
Рисунок 1. Печень повреждение происходит в Alb-Treck / SCID (Токсин рецептор - опосредованного Cell Нокаут) мышей после токсина дифтерии (DT) Раствор для инъекций. Гистологии (гематоксилин-эозином) из печени мышей без и с введением DT после 48 часов. ДТ доза: 1,5 мкг / кг, в сыворотке АСТ активность нормальной печени (левая панель): 30 МЕ / л; Активности АСТ в сыворотке крови DT-обработанной печени (правая панель): 15000МЕ / л. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Трансплантация печени человека стволовых клеток в Alb-Treck / SCID мышей с фульминантной печеночной недостаточностью. Макроскопическом (левая панель) и гистологический анализ (гематоксилин-эозином, правая панель) очеловеченного с печенью человека HpSCs через 6 недель после трансплантации , м, мыши область печени; ч, человеческого донора клеток, полученных человеческий регион. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
<бр /> Рисунок 3. Макроскопические Анализ гуманизированных Печени , полученные от человека печеночных стволовых клеток маркируется с помощью зеленого флуоресцентного белка. с высоким увеличением изображения структуры печени 4 -х дней (левая панель) и 45 дней (правая панель) после трансплантации с печеночными стволовыми человека клетки (HpSCs). Печени человека стволовые клетки (HpSCs) метили с повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) с использованием вектора лентивирус. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Характеристика печени человека стволовых клеток , полученных из гепатоцитов человека в ALB-Treck / SCID мышей. Иммуногистохимический анализ различия между гепатоцитов человека с окрашенными CK8 / 18 (зеленый) антиген против человеческого и анти-ч Уманский ядерный антиген (аква-синий) в клеточных производных гуманизированных печени печеночная стволовых человека через 6 недель после трансплантации. м, мыши область печени; ч, человеческого донора клеток, полученных человека область печени. Белая пунктирная линия: мыши область печени против области печени человека. Ядра контрастно 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (синий). Шкала баров = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Человеческий печени Стволовые клетки Дифференциация в очеловеченных Печени ALB-Treck / SCID мышей. Иммуногистохимического анализа человеческого альбумина и человеческого CK19 в HPSC полученных из печени через 6 недель после трансплантации. Ядра контрастно 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (синий). Масштабные полоски = 100 мкм.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Несколько Кластеры печени человека стволовых клеток , полученных из клетки присутствуют в ALB-Treck / SCID мышей с очеловеченных Печени. Несколько больших кластеров , полученных из человеческих печеночных стволовых клеток были идентифицированы в долях печени через 6 недель после трансплантации иммуногистохимического анализа для человек CK8 / 18 (зеленый) и человеческого ядра (аква-синий). Шкала баров = 1000 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. ГуманизированныеПечень Репопуляции Rate и Альбумин человека секреция в Alb-Treck / SCID мышей. (А) химерных скорость в ALB-Treck / SCID мышей 1 месяц после трансплантации стволовых клеток печени человека; Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (n = 12). Тест Манна-Уитни: P <0,0005 для Sham и человеческих HpSCs (B) Обнаружение человеческого альбумина в сыворотке крови мышей через один месяц после трансплантации донорских клеток.. Данные = среднее значение ± SEM (n = 5). тест Манна-Уитни: P = 0,0313 для Sham и человеческих HpSCs. ND: незаметного; Sham: мышей с трансплантированной PBS; HpSCTx:. Пересаженные мышей с человеческими HpSCs Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Недавние исследования показали , что печень мыши может быть заселена с гепатоцитах человека, в том числе взрослых гепатоцитов и пролиферативных печеночных стволовых клеток 17. Эти заселен печенки были использованы в качестве доклинических экспериментальных моделей для тестирования метаболизма лекарственных средств и открытия и разработки лекарственных средств 18; кроме того, они предоставили среду в естественных условиях для созревания и дифференцировки клеток 19. Основная цель настоящего исследования состояла в том, чтобы создать новую модель заболевания печени мыши, что позволило незрелую пролиферацию гепатоцитов человека, созревание и дифференцировку, для приобретения метаболизма лекарственных средств деятельности.
Курс внутриселезеночное трансплантации была тщательно изучена. Клетки пересаживают в селезенке мышей и крыс выживают в течение их средней продолжительности жизни. Внутриселезеночное протокол трансплантации оказался очень полезным при исследовании конкретных вопросов исследования;многие лаборатории по всему миру предпринимались попытки использовать этот протокол в качестве высокой воспроизводимостью и надежной модели для трансплантации клеток печени из-за улучшенной выживаемости мышей и печени регенерации. Тем не менее, имплантировать клетки в селезеночной пульпе представляет опасность, так как большинство имплантированных клеток будет смещать в печень, где они могут окклюзии портальные ветви. Даже если эта закупорка может быть временным и не может повлиять на здоровую окружающую среду печени, в случаях существовавшие ранее повреждения печени, эта процедура может еще больше уменьшить функции печени и увеличение портальной гипертензии и может также отрицательно влиять на клеточную приживление. Хотя мы успешно применяли трансплантацию гепатоцитов с использованием селезенку трансплантации, несколько вопросов, требуют дальнейшего изучения, особенно тему новых потенциальных источников клеток. Кроме того, при выполнении селезенку трансплантации гепатоцитов, предел нагрузки сотовой ячейки должны быть строго соблюдены для того, чтобы предотвратить возможные нарушения со стороныостаток печеночной микроциркуляции. Рецептор ДТ был идентифицирован как мембраной якорь формы ЭФР-подобного фактора роста гепарин-связывающего (HB-EGF , предшественник) 20. В то время как предшественники HB-EGF , полученных из токсина чувствительных животных, таких как люди и обезьяны, связывают DT и функции , как токсин рецепторов, предшественников HB-EGF из мышей и крыс , не связываются DT 21. Трансгенные Альб-Treck / SCID мышиной модели выражает HB-EGF-подобных рецепторов человека под контролем специфичного для клеток промотора альбумина печени; после введения DT, эти мыши развиваются молниеносный печеночной недостаточности из-за условной абляции гепатоцитов, обеспечивая пространство для донорских клеток ординатуре и пролиферации. Гепатоцитах человека, даже при незрелой стадии, как известно, обладают значительным потенциалом пролиферативную в пробирке, хотя они теряют свои функции метаболизма лекарственных средств, что ограничивает их доклинические приложения 22. Гистологические и иммуногистохимические результаты, полученные после ТНСnsplantation человеческих HpSCs в текущем Alb-Treck / SCID мышей с летальным молниеносного печеночной недостаточностью показали, что человеческие HpSCs могли бы расширить и восстановить поврежденные структуры печени мыши; скорость репопуляция в некоторых мышей был почти на 100%.
В наших экспериментах трансплантация HPSC человек способствовало выживание мышей и привело к увеличению секреции человеческого ALB в сыворотке крови мышей 16. Эти клетки также повзрослели и дифференцированы в естественных условиях и выставлены деятельности метаболизма лекарственных средств человека, что свидетельствует о том , что человеческие HPSC-производные гуманизированные мышей печени похожи на зрелые и функциональные "органы человека" и имеют потенциал применения в разработке лекарственных средств. Эти результаты еще раз подтверждают, что Alb-Treck / SCID мышь является идеальной моделью для гуманизированного поколения печени. Несмотря на перспективы и преимущества Alb-Treck / SCID мышей в качестве идеальной модели для клеточного происхождения поколения гуманизированного печени человека печеночными стволовыми, они обладают одним уникальным недостатком; когда человек объявлениеULT гепатоциты были пересажены на три Альб-Treck / SCID мышей, получавших разовую дозу DT, не очеловеченные печенки не было зарегистрировано, возможно, потому, что взрослого человека гепатоциты не имеют пролиферативную способность. Дополнительные дозы DT не могут быть введены после трансплантации взрослого гепатоцитов человека; так как рецептор DT (HB-EGF) в альб-Treck / SCID мышей гепатоциты находится под контролем промотора альбумина, дополнительное лечение ДТ уничтожит пересаженных взрослого человека гепатоцитов в печени мыши.
Насколько нам известно, это первая модель для создания гуманизированного печени из незрелых клеток человека. Коэффициент замещения клеток после трансплантации зависит от реципиента микроокружения (например, печеночная ниша) и свойства донорских клеток, таких как зрелый по сравнению с незрелыми и пролиферативной и дифференциальной способности. Сочетание ALB-Treck / SCID с трансплантацией стволовых клеток обеспечит оптимизированные условия и преимущества для генерации человеканализованных печенки. Это также представляет собой мощный инструмент для трансплантации фетальных клеток печени и потенциально, а также IP-адресов или ES полученные клетки печени, так как до начала лечения DT, то Alb-Treck / SCID животных поддерживают в здоровом состоянии, повреждение печени индуцируется в любом точка, и мыши размножаются обычно без повреждения почек. В противоположность этому, UPA / SCID мышей обладают высокой неонатальной смертности и трудно размножаться. Кроме того, избыточная экспрессия урокиназы у животных может привести к серьезным кровотечением и повреждением почек и, таким образом, существует ограниченное окно возможностей для трансплантации клеток до отъема; Альб-Treck / SCID, могут быть использованы для трансплантации клеток в любом возрасте.
Успешное поколение гуманизированного печени мыши необходимы следующие важные шаги: 1) Повреждение печени должно быть ограничено сублетальный уровней (как правило, с помощью смертельной дозы, 50%); 2) Первичные эмбриональные клетки печени человека должна быть сохранена в суб-сливающийся статуса не более чем на 90%;3) сообщение утечки Cell внутриселезеночное-трансплантация должна быть предотвращена; и 4) уровни человеческого альбумина в сыворотке крови мышей должны контролироваться через регулярные промежутки времени. Полное понимание критических факторов, участвующих в процессе генерации гуманизированного печени мыши может внести свой вклад в дальнейшие модификации или новых разработок с использованием крыс или других животных. Возможные приспособления включают в себя: индукция травмы почки для изучения развития и ремонта с человеческими нефронов, их предшественниках и собирательных трубок клетки и самосборки человеческих нефронов в трехмерных структур в организме мыши; изучение ремонта повреждений островковых клеток в поджелудочной железе с использованием стволовых клеток поджелудочной железы / клеток-предшественников, полученных из непосредственно репрограммированных ИПИ или ЭС клеток. Примеры модификаций процесса включают в себя: контроль ткани или повреждения органов с токсинов или химических веществ, таких как retrorsine, стрептозотоцина или цисплатин, чтобы облегчить конкуренцию донорских клеток с клетками-резидентами; избегаядифференциальное или уменьшение пролиферации с целью повышения пролиферативной способности клеток-доноров, способствуя тем самым замену клеток-реципиентов, таких как ES или iPS- полученные клетки; При выборе подходящих участков после трансплантации и контролировать клеточную инфузию для обеспечения эффективной трансплантации, например, с помощью портала или хвостовую вену для трансплантации в нормальном положении и брыжейки и почечной капсулы для эктопической трансплантации; мониторинга состояния замещения посредством экспрессии ткани или органа секретируемых белков представителя стволовых / клеток-предшественников или незрелых отслеживании клетки трансплантата и раковых клеток, таких как альфа-фетопротеина или трансферрин.
Таким образом, Альб-Treck / SCID мышей представляют собой подходящую модель для трансплантации стволовых клеток печени человека, так как они обеспечивают благоприятное среду, которая позволяет дифференцировать в зрелые гепатоциты. Эта новая модель имеет огромный потенциал аппликативный, не только для экс естественных условиях экспансии гепатоцитов человека бут также для экранов наркотиков и тестирования кандидатов терапевтических препаратов на токсичность печени и обмена веществ. Кроме того, эти результаты будут способствовать улучшению будущих исследований по изучению клинического применения этой методики трансплантации клеток печени человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
- Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
- Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
- Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
- Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
- Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
- Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
- Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
- Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
- Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
- Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
- Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
- Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
- Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
- Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
- Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
- Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).
