Protocol
Alle dierlijke experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen Animal Protection van Yokohama City University.
1. Generatie van de acute leverschade muismodel
- Voeg 1 ml fenol 0,85% NaCl-oplossing (0,6 g fenol in 100 ml van 0,85% NaCl-oplossing) tot 1 mg difterietoxine (DT) van een 1 mg / ml voorraadoplossing DT maken. Noot: DT bij een concentratie van 1 mg / ml kan worden opgeslagen gedurende ongeveer 2 jaar bij 3 ° C tot 8 ° C.
- Serieel verdunnen de 1 mg / ml DT stockoplossing aan 0,3 ug / ml DT fenol 0,85% NaCl-oplossing en bereid een hoeveelheid van de 0,3 ug / ml DT-oplossing is als werkoplossing. Opmerking: Deze werkoplossing moet vers worden bereid.
- Experimenten met behulp van een subletale dosis (~ 50% sterfte) uit te voeren, te beheren 8 weken oude muizen een 1,5 ug dosis / kg van DT.
- Voer een intraperitoneale injectie van DT door het houden van de muis in dorsale decubitus en steek de needle onder de buiging van de knieën, links of rechts van de middellijn. Vermijd de middellijn penetratie van de blaas te voorkomen. Hoek de naald bij ongeveer 45 ° aan het lichaam.
- Met een insulinespuit Injecteer de muizen met 100 pl vers bereide 0,3 ug / ml DT per 20 gram muis gewicht. Bijvoorbeeld, zou een 18-g muis 90 pl van het 0,3 ug / ml DT oplossing ontvangt.
- Op 48 uur na DT-injectie, het verzamelen van bloed uit de staartader door het plaatsen van de muis in een restrainer en opwarming muis staart van de in een 37 ° C waterbad gedurende ongeveer 10 minuten aan de bloedvaten verwijden. Maak dan een 1-mm inkeping in de staart 2 cm vanaf de punt met een scherp scalpel en het verzamelen van het bloed met een microcapillaire buis.
- Centrifugeer de microcapillaire buis met het bloed bij 1500 g gedurende 5 minuten en verzamel het serum door het scheiden van het supernatant en celpellet.
- Pipetteer 50 ul van 1:20 verdund muis serum op GOT / AST-PIII glijdt. Meet de absorptie van het reactieproduct (blauwe kleurstof) bij 650 nm onder toepassing van een multifunctionele automatische droge-chemie-analysator volgens het protocol van de fabrikant.
LET OP: Het uitlezen van aspartaataminotransferase (AST) / glutaminezuur oxaalazijnzuur transaminase (GOT) activiteit wordt automatisch weergegeven. 2 dagen na DT injectie, ongeveer 60% van de muizen vertoonden AST waarden tussen 12.000 - 16.000 IU / L en werden beschouwd te lijden aan acute beschadiging van de lever. Deze muizen werden overgebracht naar een nieuwe kooi en gebruikt als ontvangers celtransplantatie.
2. Voorbereiding van de humane lever stamcellen
- Isoleer humane lever stamcellen uit menselijke primaire foetale levercellen met een mobiele sorter met behulp van de CDCP1, CD90 en CD66 cel antigenen aan een CDCP1 + CD90 + CD66- subpopulatie te krijgen, dan is het zaad van de geïsoleerde cel populatie op collageen IV-gecoate cultuur gerechten, zoals eerder vermeld 15. Gebruik primaire foetale levercellen van een embryonale menselijkeleeftijd tussen week 14 en 18.
- Verzamel humane lever stamcellen gekweekt tot 80% - 90% samenvloeiing op 100-mm cultuur gerechten, zuigen het kweekmedium, was de cellen met 10 ml PBS, en verwijder de PBS. Trypsinize de cellen met 2 ml 0,05% trypsine / EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Opmerking: Cellen groter dan 90% confluentie zijn niet geschikt voor celtransplantatie sinds celdifferentiatie hun proliferatieve vermogen kunnen beïnvloeden muizen.
- De status van de cel dispersie onder een microscoop. Wanneer de cellen lijken te zweven of vrij stromende, stopt de enzymatische digestie door het toevoegen van 8 ml van DMEM / F12 met 10% FBS.
- Hang de cellen langzaam met behulp van een 10-ml serologische pipet en overdracht van de cellen in een 15-mL conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 100 xg en 4 ° C.
- resuspendeer voorzichtig de cel pellet in 10 ml DMEM / F12 met 10% FBS en het bepalen van het aantal cellen met behulp van een microscoop telkamer.
- Verdeel de cellen in 1,0 x 10 6 cellen per 50 pl PBS porties voor elke individuele muis en opgeslagen op ijs tot transplantatie.
3. milt Transplantatie van humane lever stamcellen
- Plaats een schone kooi op een 37 ° C elektrische verwarming pad.
- Verdoven de muis met behulp van isofluraan inhalatie (1-1,5% (vol / vol) in 2 L zuurstof per min) door deze onder het mondstuk. U kunt ook gebruik maken van buizen met gaas doordrenkt met isofluraan.
- Zorg ervoor dat de muis wordt verdoofd door licht te knijpen de achterste voetzool. Als een knie ruk wordt opgewekt, plaatst u de muis terug in de kamer. Gebruik dierenarts zalf op de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving.
- Scheren de operatieplaats via tondeuse en toepassen 70% (vol / vol) ethanol en povidonjood te steriliseren. maak dan 1 cm huidincisie in de linker flank net onder de ribben rand van de ribben, gevolgd door een insnijdingde buikwand en het peritoneum.
- bloot de milt zorgvuldig. Gebruik een 100-gl microinjectie spuit met een 32 G-1/2-inch naald direct te injecteren 1,0 x 10 6 humane lever stamcellen in 50 pi PBS in de milt van elke muis. Kantel de naald in een 5 ° hoek voor injectie.
- Waarborgen dat de diepte van de injectie minder dan de helft van de dikte van de milt. De naald moet de milt voeren aan één uiteinde (het hoofd) en de cellen aan het andere uiteinde (de staart) te deponeren.
- Om lekkage van de cellen na de injectie te voorkomen, voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een vinger gedurende 2 minuten en verwijder de naald.
- Plaats de milt terug in de muis lichaam en sluit de holte met een normale doorlopende draad voor de spieren en de huid.
- Breng de muizen in een 37 ° C voorverwarmde kooi onmiddellijk na transplantatie. Om de muis te waarborgen is in staat om comfortabel te ademen, plaatst u de muis op zijn kant in de kooi, eenvoiding contact tussen de aanwezige kooi en de plaats van de operatie.
- Bewaken van de muizen tot de verdoving is uitgewerkt om ervoor te zorgen de hechtingen gesloten blijven en de muizen terug te keren naar pre-operatie omstandigheden.
- Zorg ervoor dat de muizen worden geleverd met een normale drinkwater en voedsel. Na 1 uur terug de kooi om de muis ruimte van het dier centrum en dagelijks toezicht op de muizen.
4. Detectie van getransplanteerde humane lever stamcel-afgeleide hepatocyten in de muizenlever
Opmerking: Voor de volgende procedures, euthanaseren alle dieren met behulp van een overdosis van ketamine en xylazine, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Op 4-6 weken na transplantatie, euthanaseren de muizen en open de buikholte door tegelijkertijd het snijden van de cutis en fascia met behulp van chirurgische schaar.
- Ontleden het bindweefsel boven het peritoneum, met de schaar als spreader, en snijd het buikvlies langs de linea alba de peritoneale openenholte.
- Til het borstbeen met een tang, doorboren het membraan en doorsnijden weerskanten van het borstbeen omhoog door de baarmoederhals gordel.
- Scheidt de vena cava de thoracale zijde van de lever en trek de slokdarm door de lever in de voorste richting. Verwijder het membraan om de lever te verwijderen.
Opmerking: Wees voorzichtig te houden van de uiteinden van de schaar wees naar boven om eventuele schade aan de thoracale organen eronder te voorkomen. De thymus heeft de neiging om af vasthouden aan de dorsale zijde van het borstbeen en dit moet zorgvuldig worden vermeden. - Met het membraan als handgreep, beginnen trekken van de lever uit de buikholte. Het interieur vena cava zal worden met de lever op zijn plaats. Snijd het interieur vena cava; wees niet te vroeg te bevrijden van de juiste bijnier.
Let op: Muizen hebben een vier-lobbig lever, bestaande uit een mediane kwab, links kwab, rechter kwab, en de Spiegelse kwab. De galblaas hangt in kleine vertakking vande mediaan kwab. - Scheid de lobben van elkaar op de kruispunten en insluiten in optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding volgens protocol van de fabrikant. Bevriezen van de LGO met het leverweefsel in de metalen roosters op de cryostaat.
- Cut-5 urn dikke secties monster met behulp van een cryostaat bij -18 ° C en brengen ze op RT objectglaasjes. Bewaar de voorraad bij -80 ° C. Bereid de dia's hematoxyline en eosine (H & E) en immunofluorescentie kleuring volgens eerder beschreven procedures 16.
5. Detectie van humaan albumine secretie en berekening van de chimere Rate
- Lever reconstitutie menselijke meten uitvoeren humaan albumine ELISA met serum en humaan albumine ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereken het gehumaniseerde lever chimere rente met real-time PCR-analyse van expressie niveaus in de hele-gehumaniseerde lever. Bepaal de relatieve expression hoogte verhouding van humaan-specifieke actine mens-muis kruis actine (verhouding 1) en de verhouding van muisspecifieke actine mens-muis kruis actine (verhouding 2). Het chimere wordt berekend als verhouding 1 / (verhouding 1 + verhouding 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alb-treck / SCID-muizen hepatocyten uiten het menselijk DT-receptor HB-EGF-gen onder de controle van een albumine promoter en cytotoxische effecten vertonen na toediening DT 12. Om de effecten van DT behandeling op leverbeschadiging evalueren, werden DT doses van 1,5 gg / kg geïnjecteerd in 8 weken oude Alb-treck / SCID-muizen en aandoeningen van lever 48 uur na toediening DT werden histologisch beoordeeld. Vergeleken met controlemuizen (niet behandeld met DT), de DT-behandelde muizen vertoonden een ongeorganiseerde hepatische architectuur met een correctie voor congestie met verhoogde serum AST activiteit. Bovendien, de hepatocyten van DT-behandelde muizen hadden meerdere diep gekleurd acidofiele cytoplasmatische insluitsels met donkere kernen (waarschijnlijk apoptotische hepatocyten); andere hepatocyten verduurzaamd leek of vertoonden een gevacuoleerd cytoplasma met donkere kernen met weinig of geen poortader ontsteking (figuur 1 12 DT.
Human HpSCs kan worden gebruikt voor de lange termijn in vitro kweken en vertonen uniform celmorfologie met een aantal ALB en minder CK19-positieve cellen. Op 6 weken transplantatie plaatsen in de muis levers werden de menselijke HpSCs onderworpen aan een basisexamen onder een microscoop en geëvalueerd histologisch; menselijke HpSCs waargenomen lever structuur hebben gereconstitueerd door vervanging van de oorspronkelijke muis hepatocyten (figuur 2). Macroscopisch, bij 4 dagen na de menselijke HPSC transplantatie, kleine humane lever clusters die gelijkmatig zijn verdeeld rond de lever werden ontdekt; 45 dagen na transplantatie, deze had zich verspreid in grote clusters (figuur 3). Wiele muis levers opgelost in menselijke levercellen werden aangeduid als "gehumaniseerde lever." Deze resultaten geven aan dat muizen met dodelijke acuut leverfalen dat menselijke HPSC transplantatie ondergaan lever structuren vergelijkbaar met die waargenomen in normale muis levers kan vertonen.
Voorafgaand aan het testen of de onrijpe humane hepatocyten getransplanteerd in muizen hadden het potentieel voor differentiatie en in vivo zou kunnen functioneren, werd de aanwezigheid van menselijke hepatocyten in muizenlevers eerste bevestigd door immunohistochemische analyse ongeveer 6 weken na transplantatie menselijke HPSC. Lever secties van muizen met 60% menselijke cel herbevolking die specifiek en positief co-gekleurd met menselijke kernen en humaan cytokeratine 18/08 (CK8 / 18) antilichamen bleken donor cel afkomstige humane hepatocyten bevatten, terwijl de oorspronkelijke controle muizen levers waren negatief voor deze merkers (Figuur 4).
in vivo te beoordelen, werd de expressie van humaan albumine (ALB) en humaan cytokeratine 19 (CK19) immunohistochemisch onderzocht. Human HPSC-afgeleide menselijke hepatocyten werden goed gedifferentieerd in de muis levers en tentoongesteld opgereguleerd menselijke ALB expressie. Human ALB-positieve en CK19-negatieve hepatocyten leek functionele hepatocyten, terwijl cellen die positief co-gekleurd met menselijke ALB en CK19 tentoongesteld bipotentiële vermogens voor differentiëren in hepatocyten en cholangiocyten (Figuur 5). Een grootschalig scanning methode die wordt gebruikt om alle menselijke HPSC-afgeleid gehumaniseerd lever lobben analyseren onthulde de aanwezigheid van meerdere rond en kolonie-achtige clusters rondom de lever lobben met duidelijke menselijke kernen en CK8 / 18 expressie (Figuur 6), waaruit de kolonievormende vormend vermogen van menselijke HpSCs in het gehumaniseerde levers. De herbevolking level bereikt tot 90%één maand na transplantatie (figuur 7A) en humaan albumine secretie werd gedetecteerd in de levers herbevolkt muizen (Figuur 7B), wat aangeeft dat menselijke HpSCs succes kan reconstitueren het Alb-treck / SCID muizenlever. Deze resultaten demonstreren dat humaan HpSCs hoge potentie voor differentiatie naar functionele hepatocyten in vivo als reactie op de redding van defecte muizenlever functies.
Figuur 1. Lever schade optreedt in Alb-treck / SCID (Toxine Receptor Mediated Cell knockout) muizen na Difterie toxine (DT) Injection. Histologie (hematoxyline-eosine kleuring) van de muis levers met en zonder DT administratie na 48 uur. DT dosis: 1,5 mg / kg, serum AST activiteit van normale lever (linker paneel): 30 IU / L; serum AST activiteit van DT-behandelde lever (rechter paneel): 15000IU / L. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Transplantatie van humane lever stamcellen in Alb-treck / SCID muizen met acuut leverfalen. Macroscopische uitzicht (linker paneel) en histologische analyse (hematoxyline-eosine kleuring, rechter paneel) van gehumaniseerd levers met menselijke HpSCs op 6 weken na transplantatie . m, muis lever regio; h menselijke donorcellen-afgeleide humane regio. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
<br /> Figuur 3. Macroscopische Analyse van gehumaniseerd Levers Afgeleid van humane lever stamcellen Label met Green Fluorescent Protein. High-vergroting beelden van de lever structuur 4 dagen (linker paneel) en 45 dagen (rechter paneel) na transplantatie met menselijke lever stamcellen cellen (HpSCs). Humane lever stamcellen (HpSCs) werden gelabeld met verbeterde groen fluorescerend eiwit (EGFP) met een lentivirus vector. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. karakterisering van menselijke lever stamcellen afgeleide menselijke hepatocyten in Alb-treck / SCID muizen. Immunohistochemische analyse onderscheid te maken tussen menselijke levercellen gekleurd met anti-humane CK8 / 18 (groen) antigen en anti-h Uman nucleair antigen (aqua blauw) in de menselijke lever stamcellen afgeleid gehumaniseerd levers na 6 weken na transplantatie. m, muis lever regio; h menselijke donorcellen afgeleide regio humane lever. Wit gestippelde lijn: lever regio muis vs. lever regio mens. Kernen werden tegengekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (blauw). Schaal bars = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. humane lever stamcellen Differentiatie in vermenselijkte Levers van Alb-treck / SCID muizen. Immunohistochemische analyses van menselijk albumine en menselijke CK19 in HPSC-afgeleide levers op 6 weken na transplantatie. Kernen werden tegengekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (blauw). Schaal bar = 100 urn.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. meerdere clusters van humane lever stamcellen afgeleide cellen zijn aanwezig in Alb-treck / SCID Muizen met vermenselijkte Levers. Meerdere grote clusters afkomstig van menselijke lever stamcellen werden geïdentificeerd in de lever kwabben op 6 weken na transplantatie door immunohistochemische analyse voor human CK8 / 18 (groen) en de menselijke kernen (aqua blauw). Schaal bars = 1,000 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. GehumaniseerdLever Herbevolking Waardeer en humaan albumine secretie in Alb-treck / SCID muizen. (A) Chimeer rate in Alb-treck / SCID-muizen 1 maand na humane lever stamceltransplantatie; gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 12). Mann-Whitney-test: p <0,0005 voor Sham en menselijke HpSCs (B) Detectie van humaan albumine in muizen sera één maand na donor stamceltransplantatie.. Data = gemiddelde ± SEM (n = 5). Mann-Whitney-test: P = 0,0313 voor Sham en menselijke HpSCs. ND: niet op te sporen; Sham: muizen getransplanteerd met PBS; HpSCTx:. Muizen getransplanteerd met menselijke HpSCs Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Recente studies hebben aangetoond dat de muizenlever kan worden herbevolkt met menselijke hepatocyten, met inbegrip van volwassen hepatocyten en proliferatieve hepatische stamcellen 17. Deze bevolkt levers zijn gebruikt als preklinische experimentele modellen voor geneesmiddelmetabolisme testen en geneesmiddelen en ontwikkeling 18; bovendien hebben zij voorzien in een in vivo omgeving voor cellen rijping en differentiatie 19. Het belangrijkste doel van dit onderzoek was om een roman leverziekte muismodel dat de menselijke onvolwassen proliferatie van levercellen, rijping en differentiatie toegestaan, ook voor de overname van het metabolisme van geneesmiddelen activiteiten genereren.
Tijdens milt transplantatie is uitgebreid bestudeerd. Cellen getransplanteerd in de milt van ratten en muizen overleven gedurende hun gemiddelde levensduur. De milt transplantatie protocol heeft bewezen zeer nuttig zijn bij het onderzoeken van specifieke onderzoeksvragen te zijn;veel laboratoria over de hele wereld hebben geprobeerd om dit protocol te gebruiken als een zeer reproduceerbaar en betrouwbaar model voor de lever celtransplantatie als gevolg van de verbeterde muizen overleving en leverregeneratie. Echter, het implanteren van cellen in de milt pulp een risico, omdat de meeste geïmplanteerde cellen transloceren naar de lever waar ze portal takken kunnen afsluiten. Hoewel dit occlusie tijdelijk kan zijn en misschien niet van invloed op een gezonde lever milieu, in het geval van reeds bestaande leverschade, kan deze procedure verder te verlagen de leverfunctie en het verhogen van portal hypertensie en wellicht ook een negatieve invloed cel innesteling. Hoewel we met succes hepatocyte transplantatie hebben toegepast met behulp van de milt transplantatie, een aantal kwesties rechtvaardigen verder onderzoek, in het bijzonder het onderwerp van potentiële nieuwe cel bronnen. Bovendien, bij het uitvoeren van de milt hepatocyte transplantatie, de cel laden limiet strikt worden gevolgd om mogelijke verstoringen te voorkomen dooroverblijfsel lever microcirculatie. De DT receptor is geïdentificeerd als een membraan-verankerde vorm van de heparine-bindende EGF-achtige groeifactor (HB-EGF precursor) 20. Dat HB-EGF precursors afgeleid van toxine-gevoelige dieren, zoals mensen en apen, binden DT en functioneren als toxines, HB-EGF precursors van muizen en ratten niet binden DT 21. De transgene Alb-treck / SCID muismodel uiting humane HB-EGF-achtige receptoren onder controle van een levercel-specifieke albumine promoter; na toediening van DT, deze muizen ontwikkelen acuut leverfalen als gevolg van voorwaardelijke ablatie van levercellen, het verstrekken van ruimte voor donorcel residency en proliferatie. Menselijke levercellen, zelfs bij een onvolwassen fase, is bekend dat ze prolifereren in vitro bezitten, hoewel ze hun metabolisme van functies te verliezen, beperking van hun preklinische toepassingen 22. Histologische en immunohistochemische bevindingen verkregen na de transplantation van menselijke HpSCs in Alb-treck / SCID muizen met dodelijke acuut leverfalen aangegeven dat het menselijke HpSCs kon uitbreiden en reconstrueren de beschadigde muis lever structuren; de herbevolking tempo in sommige muizen was bijna 100%.
In onze experimenten menselijk HPSC transplantatie bevorderd muis overleving en resulteerde in verhoogde uitscheiding van humaan ALB in muizensera 16. Deze cellen ook gerijpt en gedifferentieerde in vivo en tentoongesteld menselijke metabolisme van activiteiten, wat aangeeft dat de menselijke HPSC-afgeleid gehumaniseerd muizen levers zijn vergelijkbaar om te rijpen en functioneel "menselijke organen" en hebben potentiële toepassingen in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Deze resultaten bevestigen verder dat de Alb-treck / SCID muis is een ideaal model voor gehumaniseerde lever generatie. Ondanks de kansen en voordelen van Alb-treck / SCID-muizen als een ideaal model voor de lever stamcellen afgeleide gehumaniseerde lever generatie van de mens, ze bezitten een unieke nadeel; wanneer de menselijke adult hepatocyten werden getransplanteerd in drie Alb-treck / SCID muizen behandeld met één enkele dosis van DT werden geen gehumaniseerde lever gegenereerd, mogelijk omdat humane volwassen hepatocyten gebrek proliferatieve capaciteit. Extra doses van DT kan niet na transplantatie van menselijke volwassen hepatocyten worden toegediend; aangezien de DT receptor (HB-EGF) in Alb-treck / SCID-muizen hepatocyten is onder controle van de albumine promotor, extra DT behandeling in de muizenlever vernietigen van de getransplanteerde menselijke volwassen hepatocyten.
Voor zover wij weten is dit het eerste model op een gehumaniseerd lever van onrijpe humane cellen te maken. Cell replacement rate na de transplantatie wordt beïnvloed door de ontvanger micro-omgeving (bv, lever niche) en donor cel eigenschappen, zoals volwassen versus onvolwassen en proliferatieve en differentiële vermogen. Het combineren Alb-treck / SCID met stamceltransplantatie wordt geoptimaliseerde omstandigheden en voordelen voor het genereren van menselijke biedenseerd levers. Ook dit vormt een krachtig instrument voor transplantatie van foetale levercellen en mogelijk evenals iPS of ES-afgeleide levercellen aangezien voorafgaand aan DT behandeling, het Alb-treck / SCID dieren worden bijgehouden in een gezonde toestand, leverschade induceerbaar allen punt, en de muizen fokken normaal zonder nierschade. Daarentegen uPA / SCID-muizen vertonen een hoge neonatale mortaliteit en zijn moeilijk te kweken. Bovendien kan overexpressie van urokinase in de dieren leiden tot ernstige bloeden en nierbeschadiging en daarom is er een beperkte kans voor celtransplantatie voorafgaand aan het spenen; Alb-treck / SCID kan worden gebruikt voor celtransplantatie op elke leeftijd.
De succesvolle productie van een gehumaniseerd muis lever vereist de volgende belangrijke stappen: 1) Leverbeschadiging te beperken tot subletale niveaus (meestal met de letale dosis 50%); 2) De primaire humane foetale levercellen dienen in een sub-confluente toestand niet groter dan 90% worden gehandhaafd;3) Cell lekkage na de milt transplantatie moet worden voorkomen; en 4) de niveaus van humaan albumine in muizensera moeten regelmatig gecontroleerd. Een beter begrip van de kritische factoren betrokken bij het proces van gehumaniseerd muizenlever generatie kunnen bijdragen tot verdere wijzigingen of nieuwe ontwikkelingen gebruikmaking ratten en andere dieren. Mogelijke aanpassingen zijn: de inductie van nierschade voor de behandeling ontwikkeling en reparatie met menselijke nefronen, hun voorlopers, en het verzamelen van ductale cellen en de zelf-assemblage van menselijke nefronen in driedimensionale structuren in de muis lichaam; bestuderen het herstel van schade eilandje in de pancreas via pancreas stam / progenitorcellen afgeleid van de direct geherprogrammeerd, iPS of ES-cellen. Voorbeelden van proces modificaties omvatten: het beheersen van weefsel of orgaan letsel met giftige stoffen of chemicaliën zoals retrorsine, streptozotocine of cisplatine met de concurrentie van donorcellen met ingezeten cellen te vergemakkelijken; vermijdendifferentiële of afnemende proliferatie om het proliferatieve vermogen van de donorcellen verbeteren, dus het bevorderen van de vervanging van ontvangende cellen, zoals ES of IPS afgeleide cellen; selecteren van een geschikte locaties transplantatie en controle cel infusie efficiënte -transplantatie, bijvoorbeeld via de poortader of de staart van Entopic transplantatie en het mesenterium en renale capsule ectopische transplantatie; monitoring van vervangende toestand via de expressie van weefsel of orgaan uitgescheiden eiwitten vertegenwoordiger van stam / voorlopercellen of onrijpe cellen transplantatie en kanker cel tracing, zoals alfa foetoproteïne of transferrine.
Samengevat, Alb-treck / SCID-muizen vormen een geschikt model voor de menselijke lever stamceltransplantatie, omdat ze zorgen voor een gunstig klimaat dat zorgt voor differentiatie in mature hepatocyten. Dit nieuwe model heeft een enorm potentieel applicatieve, niet alleen voor de ex vivo expansie van menselijke levercellen but ook voor drug schermen en het testen van kandidaat therapeutische geneesmiddelen voor de toxiciteit en het metabolisme van de lever. Daarnaast zullen deze resultaten helpen bij de ontwikkeling van toekomstige studies die de klinische toepassing van deze techniek om menselijke lever celtransplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
- Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
- Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
- Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
- Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
- Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
- Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
- Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
- Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
- Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
- Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
- Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
- Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
- Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
- Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
- Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
- Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).
