Abstract
Tissue engineering og celleterapi lover godt klinisk. I denne henseende kan multipotente celler, såsom mesenchymstamceller (MSC), anvendes terapeutisk, i den nærmeste fremtid, at genoprette funktionen af beskadigede organer. Ikke desto mindre er flere tekniske spørgsmål, herunder den meget invasiv procedure isolere MSC og ineffektivitet omgiver deres forstærkning, i øjeblikket hæmmer den potentielle kliniske anvendelse af disse terapeutiske modaliteter. Heri, introducerer vi en meget effektiv fremgangsmåde til generering af dedifferentierede fedtceller (DFAT), MSC-lignende celler. Interessant nok kan DFAT celler differentieres i flere celletyper, herunder adipogenisk, osteogene, og chondrogene celler. Selv om andre grupper tidligere har præsenteret forskellige metoder til at generere DFAT celler fra modent fedtvæv, vores metode giver os mulighed for at producere DFAT celler mere effektivt. I denne henseende viser vi, at DFAT dyrkningsmedium (DCM), suppleret med 20% FBS,er mere effektiv til frembringelse DFAT celler end DMEM, suppleret med 20% FBS. Derudover kan de DFAT celler produceret af vores cellekultur metode redifferentiated i flere vævstyper. Som sådan er en meget interessant og nyttig model til undersøgelse af væv dedifferentiation præsenteret.
Introduction
Celleterapi og vævsmanipulering er varme emner inden for regenerativ medicin 1-5. Mens disse terapeutiske modaliteter lover godt, flere tekniske spørgsmål i øjeblikket hæmmer deres kliniske anvendelse. I denne henseende som i genereringen af iPS celler skal alle vævsteknologiske terapier producere celler fri for eksterne gen transduktioner for at opretholde patientens sikkerhed. Derfor var vi den første gruppe at kunne producere humane DFAT celler 6. Flere andre forskergrupper har siden vedtaget vores metode til at generere DFAT celler i pattedyr 7-9, yderligere fremhæver nytten af vores model.
I løbet af adskillige undersøgelser har vi fundet, at kvaliteten af den celledyrkningsmiljøet kan modificeres ved at justere indholdet af cellen medium. Denne opdagelse har ført til en stigning i succesraten for DFAT celle produktion og forbedret cellernes kvalitet; både kritiske faktorer ieffektivt generere celler for fremtidige kliniske forsøg. I denne henseende en forbedret DFAT dyrkningsmedium (DCM, et medium, der ligner med mesenchymale stamceller medium, der indeholder rekombinant humant insulin, serum albumin, L-glutaminsyre, flere fedtsyrer og kolesterol) og en fremgangsmåde til DFAT celle generering og spredning blev udviklet (mere information om indholdet af DCM er til rådighed efter anmodning). Anvendelse af denne fremgangsmåde høj kvalitet DFAT celler blev genereret med evnen til at differentiere til flere celletyper, herunder adipogenisk, osteogene, og chondrogene celler. Tilsammen valideret cellekultur protokol øger kvaliteten af DFAT celler og kan være ganske nyttig til forøgelse kliniske anvendelser af celleterapi og vævsmanipulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøver af menneskelig subkutant fedt blev opnået fra patienter, der gennemgår kirurgi i departementerne plastikkirurgi, Urologi, Pediatric Surgery og Ortopædisk Kirurgi af Nihon University Itabashi Hospital (Tokyo, Japan). Patienterne gav skriftligt informeret samtykke, og den etiske komité i Nihon University School of Medicine godkendt undersøgelsen.
1. Vævspræparat
- Bring vævsprøve fra operationsstuen til laboratoriet.
- Vask 1-2 g fedtvæv med 5 ml PBS (-) ved stuetemperatur (RT) én gang, i en 50 ml rør og derefter placere prøven i en 10 cm plastik fad.
2. collagenasefordøjelse
- Fjern prøven fra PBS (-), hvorefter der tilsættes 10 ml steril 0,1% (vægt / volumen) collagenaseopløsning (Collagenase type II) til skål indeholdende vævsprøven.
- Hakke vævet med kirurgiske sakse til ca. 15 min, indtil den når en pureret beståtighed.
- Efterfølgende fordøje det hakkede væv i 0,1% (vægt / volumen) collagenase-opløsning ved 37 ° C i 30 min (60 rpm) i en 50 ml rør med forsigtig omrøring på en ryster.
- Filtrer det fordøjede prøve gennem en 100 um filter i et 50 ml rør. Derefter sigtes 10 ml DCM (se tabel of Materials) suppleret med 2% FBS gennem filteret.
3. Cell Isolation
- Centrifuger de filtrerede celler ved 100 xg i 1 min ved stuetemperatur.
- På dette tidspunkt, forberede 5 ml DCM suppleret med 2% FBS i en 50 ml rør.
- Dernæst udarbejde de flydende fedtceller under anvendelse af en 1.000 pi pipette og tilsæt cellerne til et 50 ml rør indeholdende medium.
- Efterfølgende rystes 50 ml rør forsigtigt for at blande DCM medium med cellerne.
- Derefter centrifugeres røret ved 100 xg i 1 min ved stuetemperatur.
- Kassér medium i bunden af røret under anvendelse af en 18 G nål og en 20 ml sprøjte.
- Dernæst tilsættes 10 ml DCM supplemented med 2% FBS til de indsamlede celler.
- Bland DCM med cellerne ved at ryste 50 ml rør forsigtigt.
- Centrifugeres røret ved 100 xg i 1 min ved stuetemperatur.
4. Plating Cells
- Tilsættes 41 ml DCM eller DMEM suppleret med 20% FBS til en 12,5 cm kolbe.
- Dernæst ved anvendelse af en 200 pi pipette tilsættes 40 pi fedtceller til kolben.
- Derefter fylde kolben med DCM eller DMEM suppleret med 20% FBS. Kritiske trin: På dette tidspunkt sikre, at cellerne er fordelt over hele mediet. Kontrollér visuelt de løsrevne celler og bagefter holde kolben på låget af en rund petriskål at holde det fladt.
- Endelig anbringes kolben inde i inkubatoren og lad den uforstyrret i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 7 dage.
- Efter en uges inkubation vendes kolben og tjekke for DFAT celler. Dernæst vurderer DFAT celle generation færdigheder, som beskrevet 10 da der på dette tidspunkt fibroblast-lignende celler (DFAT celler) ligger i områder adskiller sig fra fedtceller.
- Der tilsættes 5 ml DCM eller DMEM suppleret med 20% FBS til kolben efter fjernelse af den tidligere celledyrkningsmediet. Tillade DFAT celler til at vokse til en anden uge efter udskiftning af mediet.
- Ved hjælp af en celle tæller, tælle antallet af DFAT celler genereret under forskellige celle dyrkningsbetingelser (DCM vs. DMEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse blev metoden og værktøjssæt til DFAT celle generation forbedret (figur 1). Vores metode giver os mulighed for at generere DFAT celler under anvendelse af både DCM og DMEM-medium indeholdende 20% FBS (figur 2A). Som sådan sammenlignede vi effektiviteten af DCM og DMEM i generering DFAT celler. I denne henseende DCM forbedret DFAT celleproliferation med tre gange sammenlignet med DMEM, uanset antallet af adipocytter (figur 2A og B). Anvendelse af 20% FBS øger også cellevækst sammenlignet med protokoller anvendelse af 10% FBS (data ikke vist). Vi bekræftede yderligere, at DFAT celler produceret ved anvendelse af DCM har evnen til at redifferentiate til adipocyter og differentiere til osteoblaster (figur 3). Fremgangsmåden til assayene er beskrevet i vor tidligere undersøgelse 6.
7 / 54177fig1.jpg "/>
Figur 1:. En skematisk afbilder isolation, dedifferentiering, og kultur af modne adipocytter Et lille stykke af fedtvæv blev fordøjet med 0,1% collagenase. Efter centrifugering blev unilocular adipocytter isoleret fra det flydende lag. De isolerede celler blev dyrket i kolber fyldt med medium indeholdende 20% FBS i 7 dage. Under dyrkning, fæstnes cellerne og fladtrykte til den øvre overflade af kolberne og blev derefter konverteret til DFAT celler. Dernæst blev kolberne inverteret og DFAT celler blev dyrket ved hjælp af konventionelle metoder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: DCM forbedrer DFAT celle generation. (
Figur 3:. Multilineage potentiale DFAT celler Humane DFAT celler frembragt ved anvendelse af DCM blev dyrket i 3 uger i de passende induktion medier til evaluering af redifferentiering og differentieringsfaktorer evner DFAT celler. calen blev analyseret for osteogent (ALP og alizarin rød S), adipogeniske (Oil rød-O) kapacitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modne adipocytter der gennemgår in vitro dedifferentiering, en proces kendt som loft kultur, kan vende tilbage til en mere primitiv fænotype og få proliferative evner. Disse celler benævnes dedifferentierede fedt (DFAT) celler. Den multilineage differentiering potentiale DFAT celler blev evalueret. Flowcytometrianalyse og genekspression analyse afslørede, at DFAT celler blev stærkt homogene i forhold til ASC'er 6. Faktisk celleoverfladeantigen profil DFAT celler er meget lig dem, der findes i ASC'er 6. Følgelig kan DFAT celler fungerer på samme måde som MSC'er.
Den anden gruppe, der med succes har genereret DFAT celler udnyttede en DMEM F12 celledyrkningsmedium suppleret med 20% kalveserum 7-8. Selvom vi forsøgte at producere DFAT celler under anvendelse af et cellekulturmedium suppleret med 10% FBS, antallet af DFAT celler produceret med denne protokol var signifikant lavere end whøne suppleret med 20% FBS (data ikke vist). Derfor FBS koncentration og / eller dens indhold er vigtigt for enten dedifferentiering af DFAT celler og / eller proliferation af DFAT celler. Som en del af en kommende undersøgelse, vil vi forsøge at yderligere at belyse den mekanisme, hvormed serum indhold regulerer DFAT celle generation og spredning. På den anden side, indeholder DCM mindre glucose, fedtsyrer og andre kemikalier end DMEM anvendes i vores undersøgelse. Denne variabilitet i cellekulturmedium bestanddele kan modulere effektiviteten af både DFAT celle generering og vækst. Faktisk koncentration lav glucose lidt forbedrer effektiviteten af DFAT celle generation, når der anvendes DMEM (data ikke vist). Selvom de præcise mekanismer bag DCM virkning på DFAT celle generation og vækst er ukendte, vi postulerer her, at koncentrationen af visse mellemstore bestanddele driver disse cellulære begivenheder. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afklare dette punkt. Da vi har testet en limited antal DMEM formuleringer, der kræves yderligere forsøg for at sammenligne effektiviteten af andre DMEM variationer (f.eks DMEM indeholdende L-glutamin eller pyridoxin) i at producere DFAT celler.
Selvom vi er i stand til at producere DFAT celler, de molekylære mekanismer, der styrer DFAT celle generation er stadig uklart. Lignende spørgsmål omgiver produktionen af iPS celler 11. Som sådan klinisk anvendelse af disse terapeutiske modaliteter vil kræve yderligere udforskning af reguleringsmekanismer celle stat. Derfor vi overbevist om, at DFAT celler giver en model til at belyse, hvordan celler vender tilbage til en stamcelle-lignende tilstand, fri for eksterne gen transduktioner. DFAT celle produktion protokoller er derfor optimeres i øjeblikket til brug i fremtidige kliniske forsøg.
Sikring af, at collagenase behandling og fedt celle isolation er begge udført korrekt er en nøglefaktor i succes generere DFAT celler ved hjælp af denne protokol. Godkopriate anvendelse af fine sakse og fjernelse af bobler under dyrkning også støtte til forøgelse DFAT celleproliferation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
- Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
- de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
- Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
- Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
- Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
- Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
