Abstract
L'ingénierie tissulaire et la thérapie cellulaire sont très prometteurs cliniquement. À cet égard, des cellules pluripotentes, telles que des cellules souches mésenchymateuses (MSC) peuvent être utilisés en thérapeutique, dans un avenir proche, pour restaurer la fonction des organes endommagés. Néanmoins, plusieurs questions techniques, y compris la procédure très envahissante d'isoler MSCs et l'inefficacité entourant leur amplification, entravent actuellement l'utilisation clinique potentielle de ces modalités thérapeutiques. Ici, nous introduisons une méthode très efficace pour la production de cellules graisseuses dédifférenciées (DFAT), les cellules MSC-like. Fait intéressant, les cellules peuvent être différenciées DFAT en plusieurs types cellulaires incluant adipogène, osteogene et les cellules chondrogéniques. Bien que d'autres groupes ont déjà présenté différentes méthodes pour générer des cellules DFAT du tissu adipeux mature, notre méthode nous permet de produire des cellules DFAT plus efficacement. À cet égard, nous démontrons que le milieu de culture DFAT (DCM), supplémenté avec 20% de FBS,est plus efficace pour générer des cellules DFAT que DMEM, supplémenté avec 20% de FBS. En outre, les cellules DFAT produites par notre procédé de culture cellulaire peuvent être redifférenciés dans plusieurs types de tissus. En tant que tel, un modèle très intéressant et utile pour l'étude de la dédifférenciation du tissu est présenté.
Introduction
La thérapie cellulaire et l' ingénierie tissulaire sont des sujets brûlants dans le domaine de la médecine régénérative 1-5. Bien que ces modalités thérapeutiques très prometteuses, plusieurs problèmes techniques entravent actuellement leur utilisation clinique. À cet égard, comme dans la génération de cellules iPS, toutes les thérapies d'ingénierie tissulaire doivent produire des cellules libres de transduction de gènes externes afin de maintenir la sécurité des patients. En conséquence, nous avons été le premier groupe à produire avec succès des cellules DFAT humaines 6. Plusieurs autres groupes de recherche ont depuis adopté notre méthode pour générer des cellules DFAT d'origine mammifère 7-9, soulignant en outre l'utilité de notre modèle.
Au cours de plusieurs études, nous avons constaté que la qualité du milieu de culture cellulaire peut être modifiée en ajustant la teneur du milieu cellulaire. Cette constatation a conduit à une augmentation du taux de production de cellules DFAT de réussite et une meilleure qualité de cellule; les deux facteurs critiquesgénérer efficacement des cellules pour les futurs essais cliniques. À cet égard, un meilleur milieu de culture DFAT (DCM, un support similaire à souches mésenchymateuses milieu cellulaire, qui contient de l'insuline humaine recombinante, l'albumine sérique, l'acide L-glutamique, de plusieurs acides gras et de cholestérol) et un procédé pour DFAT génération de cellules et prolifération a été développé (plus d'informations sur le contenu du DCM est disponible sur demande). En utilisant cette méthode cellules DFAT de haute qualité ont été obtenues avec la capacité de se différencier en différents types de cellules, y compris adipogène, osteogene et les cellules chondrogéniques. Au total, ce protocole de culture cellulaire validé améliore la qualité des cellules DFAT et peut être très utile pour améliorer les applications cliniques de la thérapie cellulaire et l'ingénierie tissulaire.
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Protocol
Des échantillons de graisse sous-cutanée humaine ont été obtenus chez des patients subissant une intervention chirurgicale dans les départements de chirurgie plastique, urologie, chirurgie pédiatrique et chirurgie orthopédique de Nihon University Hospital Itabashi (Tokyo, Japon). Les patients ont donné leur consentement éclairé écrit, et le Comité d'éthique de la Faculté de médecine de l'Université Nihon a approuvé l'étude.
1. Préparation des tissus
- Amener l'échantillon de tissu à partir de la salle d'opération au laboratoire.
- Laver 1-2 g de tissu adipeux avec 5 ml de PBS (-) à la température ambiante (RT) une fois, dans un tube de 50 ml, puis placer l'échantillon dans un plat en plastique de 10 cm.
2. digestion à la collagénase
- Retirer l'échantillon du PBS (-), puis ajouter 10 ml de solution stérile à 0,1% (p / v) de solution de collagénase (collagénase de type II), le récipient contenant l'échantillon de tissu.
- Émincer le tissu avec des ciseaux chirurgicaux pendant environ 15 min, jusqu'à ce qu'elle atteigne une purée se composentence.
- Par la suite, la digestion du tissu haché dans 0,1% (p / v) d'une solution de collagénase à 37 ° C pendant 30 min (60 min) dans un tube de 50 ml, en agitant doucement sur un agitateur.
- Filtrer l'échantillon digéré à travers un filtre de 100 um dans un tube de 50 ml. Ensuite, passer 10 ml de DCM (voir le tableau des matériaux) additionné de 2% de FBS à travers le filtre.
3. Cellule d'isolement
- Centrifuger les cellules filtrées à 100 xg pendant 1 min à température ambiante.
- A ce stade, la préparation 5 ml de DCM, supplémenté avec 2% de FBS dans un tube de 50 ml.
- Ensuite, dessinez les cellules graisseuses flottantes en utilisant une pipette de 1000 et ajouter les cellules à un milieu contenant 50 ml de tube.
- Par la suite, secouer le tube de 50 ml doucement pour mélanger le milieu DCM avec les cellules.
- Ensuite, centrifuger le tube à 100 g pendant 1 min à température ambiante.
- Jeter le milieu au fond du tube en utilisant une aiguille de 18 G et une seringue de 20 ml.
- Ensuite, ajouter 10 ml de DCM supplemented FBS à 2% aux cellules recueillies.
- Mélanger le DCM avec les cellules en agitant doucement le tube de 50 ml.
- Centrifuger le tube à 100 g pendant 1 min à température ambiante.
4. Cellules Placage
- Ajouter 41 ml de DCM ou DMEM supplémenté avec 20% de FBS à 12,5 cm flacon.
- Ensuite, en utilisant une pipette de 200 pi ajouter 40 ul de cellules adipeuses dans le ballon.
- Ensuite, remplir le flacon avec du DCM ou DMEM supplémenté avec 20% de FBS. ÉTAPE CRITIQUE: À ce stade, faire en sorte que les cellules sont réparties dans tout le milieu. Contrôler visuellement les cellules détachées et ensuite garder le ballon sur le couvercle d'une boîte de Pétri ronde pour le maintenir à plat.
- Enfin, placer le ballon à l' intérieur de l'incubateur et à laisser non perturbée dans un incubateur à CO2 à 5% à 37 ° C pendant 7 jours.
- Après une semaine d'incubation, inverser le flacon et vérifier les cellules DFAT. Ensuite, évaluer DFAT génération cellulaire compétences comme décrit 10 depuis à ce stade fibroblcellules ast-like (cellules DFAT) sont situés dans des régions distinctes de cellules graisseuses.
- Ajouter 5 ml de DCM ou du DMEM supplémenté avec 20% de FBS dans le ballon après l'enlèvement du milieu de culture de la cellule précédente. Laisser les cellules DFAT à croître pendant une semaine après avoir changé le milieu.
- L'utilisation d'un compteur de cellules, compter le nombre de cellules DFAT générées dans différentes conditions de culture cellulaire (DCM vs. DMEM).
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Representative Results
Dans cette étude, la méthode et d' outils pour DFAT génération de cellules a été améliorée (Figure 1). Notre méthode nous permet de générer des cellules DFAT utilisant à la fois du DCM et du milieu DMEM contenant 20% de FBS (figure 2A). En tant que tel, nous avons comparé l'efficacité de DCM et DMEM dans la génération de cellules DFAT. À cet égard, le DCM amélioré DFAT la prolifération cellulaire par trois fois par rapport au DMEM, quel que soit le nombre d'adipocytes (figure 2A et B). En utilisant 20% de FBS améliore également la croissance cellulaire par rapport aux protocoles utilisant 10% de FBS (données non représentées). Nous avons en outre confirmé que les cellules produites en utilisant du DCM DFAT ont la capacité de redifférencier en adipocytes et de se différencier en ostéoblastes (figure 3). Le procédé pour les essais est décrit dans notre précédente étude 6.
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Figure 1:. Un schéma illustrant l'isolement, la dédifférenciation et la culture des adipocytes matures Un petit morceau de tissu adipeux a été digéré avec 0,1% de collagénase. Après centrifugation, les adipocytes ont été isolés à partir uniloculaires la couche flottante. Les cellules isolées ont été cultivées dans des flacons remplis d'un milieu contenant 20% de FBS pendant 7 jours. Au cours de la culture, les cellules fixées et aplatis à la surface supérieure des flacons, puis ont été transformés en cellules DFAT. Ensuite, les flacons ont été inversées et les cellules DFAT ont été cultivées en utilisant des méthodes classiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: DCM améliore DFAT génération cellulaire. (
Figure 3:. Potentiel multilignée de cellules DFAT cellules DFAT humaines générées à l' aide de DCM ont été cultivées pendant 3 semaines dans les médias d'induction appropriés pour évaluer les redifférenciation et de différenciation des capacités des cellules DFAT. Le caunes ont été analysés pour ostéogénique (ALP et alizarine S rouge), adipocytaire (huile rouge-O) capacité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Adipocytes matures qui subissent en dédifférenciation in vitro, un processus connu sous le nom de la culture de plafond, peuvent revenir à un phénotype plus primitif et d' acquérir des capacités prolifératives. Ces cellules sont appelées graisse comme dédifférenciées (DFAT) cellules. Le potentiel de différenciation multilignée DFAT des cellules a été évaluée. Analyse par cytométrie en flux et l' analyse de l' expression du gène a révélé que les cellules DFAT étaient très homogènes par rapport à ASCs 6. En fait, le profil de l' antigène de surface cellulaire des cellules DFAT est très similaire à ceux trouvés dans ASCs 6. Par conséquent, les cellules DFAT peuvent fonctionner de manière similaire aux cellules souches mésenchymateuses.
L'autre groupe qui a généré avec succès des cellules utilisées DFAT un milieu DMEM de culture cellulaire F12 supplémenté avec 20% de sérum de veau 7-8. Nous avons tenté de produire des cellules DFAT en utilisant un milieu de culture cellulaire additionné de FBS à 10%, le nombre de cellules DFAT produites avec ce protocole était significativement inférieur à phen complété avec 20% de FBS (données non présentées). Par conséquent, la concentration en FBS et / ou de son contenu est important pour la dédifférenciation des cellules soit DFAT et / ou la prolifération des cellules DFAT. Dans le cadre d'une étude future, nous tenterons d'élucider davantage le mécanisme par lequel le contenu de sérum régissant la génération de cellules DFAT et la prolifération. D'un autre côté, le DCM contient moins de glucose, d'acides gras et d'autres produits chimiques que les DMEM utilisés dans notre étude. Cette variabilité dans la culture cellulaire constituants du milieu peut moduler l'efficacité de la production à la fois des cellules et la croissance DFAT. En effet, une faible concentration en glucose améliore légèrement l'efficacité de la génération DFAT cellulaire lors de l'utilisation du DMEM (données non présentées). Bien que les mécanismes précis qui sous-tendent l'effet du DCM sur la génération de cellules et la croissance DFAT sont inconnus, nous postulons ici que la concentration de certains constituants du milieu entraîne ces événements cellulaires. D'autres études sont nécessaires pour clarifier ce point. En outre, étant donné que nous avons testé une limited DMEM nombre de formulations, d' autres expériences sont nécessaires pour comparer l'efficacité des autres variations de DMEM (par exemple, le DMEM contenant de la L-glutamine ou pyridoxine) dans des cellules productrices DFAT.
Bien que nous soyons en mesure de produire des cellules DFAT, les mécanismes moléculaires régissant DFAT génération de cellules est encore incertaine. Des questions similaires entourent la production de cellules iPS 11. En tant que telle utilisation clinique de ces modalités thérapeutiques exigera une exploration plus poussée des mécanismes de régulation de l'état de la cellule. En conséquence, nous croyons fermement que les cellules DFAT fournissent un modèle pour élucider comment les cellules retournent à un état de cellules souches ressemblant, libre de transductions de gènes externes. protocoles de production de cellules DFAT sont donc optimisés actuellement pour une utilisation dans les essais cliniques futurs.
Veiller à ce que l'isolement de la cellule de traitement de la collagénase et la graisse sont tous deux effectué correctement est un facteur essentiel pour générer avec succès des cellules DFAT utilisant ce protocole. Apprutilisation opriate des ciseaux fins et élimination des bulles lors de la culture aident aussi à améliorer la DFAT prolifération cellulaire.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
- Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
- de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
- Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
- Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
- Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
- Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
