Abstract
הנדסת רקמות טיפול בתאים להחזיק הבטחה גדולה קלינית. בהקשר זה, תאי מולטיפוטנטיים, כגון תאי גזע mesenchymal (MSCs), ניתן להשתמש לצורך טיפולי בעתיד הקרוב, כדי לשקם את תפקוד לאיברים פגומים. אף על פי כן, כמה בעיות טכניות, לרבות הליך פולשני מאוד לבודד MSCs ואת יעילות שמסביב הגברה שלהם, כרגע לעכב את השימוש הקליני הפוטנציאל של שיטות טיפול אלה. בזאת, אנו מציגים שיטה יעילה ביותר עבור הדור של תאי שומן dedifferentiated (DFAT), תאי MSC דמויים. מעניין לציין, כי תאים DFAT ניתן להבדיל לכמה סוגי תאים כולל adipogenic, osteogenic, ותאי chondrogenic. למרות קבוצות אחרות בעבר הציגו שיטות שונות להפקת תאי DFAT מרקמות שומן בוגרות, השיטה שלנו מאפשרת לנו לייצר תאי DFAT בצורה יעילה יותר. בהקשר זה, אנו מראים כי מדיום תרבות DFAT (DCM), בתוספת 20% FBS,הוא יעיל יותר ביצירת תאי DFAT מ DMEM, בתוספת 20% FBS. בנוסף, תאי DFAT המיוצרים על ידי שיטת תרבית תאים שלנו ניתן redifferentiated לתוך סוגי רקמות שונים. ככזה, מודל מעניין ושימושי מאוד לחקר dedifferentiation רקמות מוצג.
Introduction
Cell טיפול והנדסת רקמות הם נושאים חמים בתחום של רפואה רגנרטיבית 1-5. בעוד שיטות טיפול אלה מחזיקות הבטחה גדולה, כמה בעיות טכניות כרגע לעצור בשימושו הקליני שלהם. בהקשר זה, כמו בדור של תאי שב"ס, כל טיפולי הנדסת הרקמות חייבים לייצר תאים ללא transductions גן החיצוני על מנת לשמור על בטיחות חולה. בהתאם לכך, היינו הקבוצה הראשונה לייצר תאי DFAT אדם בהצלחה 6. מספר קבוצות מחקר אחרות מאז אמצו את השיטה שלנו כדי לייצר תאי DFAT ממוצא יונק 7-9, עוד המדגישות את התועלת של המודל שלנו.
במהלך מספר מחקרים, מצאנו כי איכות סביבת תרבית תאים ניתן לשנות על ידי התאמת התוכן של המדיום הסלולרי. ממצא זה הוביל לעלייה בשיעור ההצלחה של ייצור תאי DFAT ואיכות תא משופר; הן גורמים קריטייםיצירת תאים ביעילות לניסויים קליניים עתידיים. בהקשר זה, מדיום תרבות משופר DFAT (DCM, מדיום דומה mesenchymal גזע מדיום סלולארי, המכיל אינסולין אנושי רקומביננטי, אלבומין, חומצת L-גלוטמית, כמה חומצות שומן, כולסטרול) שיטה לייצור תאי DFAT ו התפשטות פותחה (מידע נוסף על התוכן של DCM זמין לפי בקשה). שימוש זה תאי שיטה באיכות גבוהה DFAT נוצרו עם היכולת להתמיין לסוגי תאים שונים, הכוללים adipogenic, osteogenic, ותאי chondrogenic. בסך הכל, פרוטוקול תרבית תאי תוקף זה משפר את איכות תאי DFAT ועשוי להיות שימושי למדי עבור שיפור יישומים קליניים של טיפול בתאים והנדסת רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דוגמאות של שומן תת עורי האנושי התקבלו מחולים שעברו ניתוח במחלקות לכירורגיה פלסטית, אורולוגיה, כירורגיה ילדים כירורגיה אורתופדית בבית החולים איטבאשי אוניברסיטת ניהון (טוקיו, יפן). החולים נתן הסכמה בכתב הודיע, וועדת האתיקה של אוניברסיטת ניהון לרפואה אישרה את המחקר.
1. רקמות הכנה
- תביאו את דגימת רקמה מחדר הניתוח למעבדה.
- לשטוף 1-2 גרם של רקמה שומנית עם 5 מ"ל של PBS (-) בטמפרטורת החדר (RT) פעם, בתוך שפופרת 50 מ"ל ולאחר מכן הנח את הדוגמה צלחת פלסטיק 10 ס"מ.
2. עיכול Collagenase
- הסר את המדגם מתוך PBS (-), ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של 0.1% סטרילי (w / v) פתרון collagenase (סוג Collagenase השנייה) כדי בצלחת המכילה את דגימת רקמה.
- לרכך את הרקמה עם מספרי כירורגיות למשך כ 15 דקות, עד שהוא מגיע מחיה מורכבתency.
- בהמשך לכך, לעכל את הרקמה טחון ב -0.1% (w / v) פתרון collagenase על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (60 סל"ד) בצינור 50 מ"ל עם תסיסה עדינה על שייקר.
- סנן המדגם מתעכל דרך פילטר 100 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל. לאחר מכן, להעביר 10 מ"ל של DCM (ראו טבלה של חומרים) בתוספת 2% FBS דרך המסנן.
בידוד תא 3.
- צנטריפוגה תאים המסוננים ב 100 XG דקות 1 ב RT.
- בשלב זה, להכין 5 מ"ל של DCM בתוספת 2% FBS בתוך שפופרת 50 מ"ל.
- בשלב הבא, לצייר את תאי השומן צף בעזרת פיפטה 1,000 μl ולהוסיף את התאים במדיום המכיל 50 מ"ל צינור.
- בהמשך לכך, לנער את שפופרת 50 מ"ל בעדינות לתערובת המדיום DCM עם התאים.
- לאחר מכן, צנטריפוגות הצינור ב 100 XG דקות 1 ב RT.
- מחק את המדיום בתחתית הצינור באמצעות מחט 18 G ו מזרק 20 מ"ל.
- לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של DCM supplemented עם 2% FBS אל התאים שנאספו.
- מערבבים את DCM עם התאים על ידי טלטול שפופרת 50 מ"ל בעדינות.
- צנטריפוגה הצינור ב 100 XG דקות 1 ב RT.
4. תאי ציפוי
- להוסיף 41 מ"ל של DCM או DMEM בתוספת FBS 20% בבקבוק 12.5 ס"מ.
- לאחר מכן, בעזרת פיפטה 200 μl להוסיף 40 μl של תאי השומן אל הבקבוק.
- לאחר מכן, למלא את הבקבוק עם DCM או DMEM בתוספת 20% FBS. שלב קריטי: בשלב זה, להבטיח כי התאים מפוזרים ברחבי בינוני. ראייה לבדוק את התאים המנותקים ולאחר מכן לשמור את הבקבוק על המכסה של צלחת פטרי עגולה כדי לקבע אותו שטוח.
- לבסוף, הניחו את הבקבוק בתוך האינקובטור ולהשאיר אותה ללא הפרעה חממה 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
- לאחר שבוע של דגירה, להפוך את הבקבוק לאיתור תאי DFAT. לאחר מכן, להעריך שליטת דור תא DFAT כמתואר 10 מאז ב fibrobl בנקודה זותאי אס 'דמוי (תאי DFAT) ממוקמים באזורים מובחנים מתאי שומן.
- הוסף 5 מ"ל של DCM או DMEM בתוספת 20% FBS אל הבקבוק לאחר הסרת המדיום תרבית תאים הקודמת. אפשר תאי DFAT לגדול במשך שבוע נוסף לאחר שינוי המדיום.
- באמצעות דלפק תא, לספור את מספר תאי DFAT שנוצרו בתנאי תרבית תאים שונים (DCM לעומת DMEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, שיטת ערכת הכלים עבור דור תא DFAT השתפרו (איור 1). השיטה שלנו מאפשרת לנו לייצר תאי DFAT היא באמצעות DCM ו DMEM בינוני המכילים 20% FBS (איור 2 א). ככזה, השווינו את היעילות של DCM ו DMEM ביצירת תאי DFAT. בהקשר זה, DCM משופרת התפשטות תאים DFAT פי שלושה בהשוואה DMEM, ללא קשר למספר של adipocytes (איור 2 א 'וב'). באמצעות 20% FBS גם משפר את צמיחת תאים בהשוואה פרוטוקולים באמצעות 10% FBS (מידע לא מוצג). אנחנו כמו כן, אישר כי תאי DFAT הופק באמצעות DCM יש את היכולת redifferentiate לתוך adipocytes להתמיין אוסטאובלסטים (איור 3). שיטת המבחנים מתוארת במחקר הקודם שלנו 6.
7 / 54177fig1.jpg "/>
איור 1:. סכימטי המתאר את הבידוד, dedifferentiation, והתרבות של adipocytes בוגרת פיסה קטנה של רקמת השומן מתעכל עם 0.1% collagenase. לאחר צנטריפוגה, adipocytes עם תא האחד בודד מהשכבה הצפה. התאים הבודדים היו בתרבית צלוחיות מלאות בינוניים המכיל FBS 20% למשך 7 ימים. במהלך התרבות, התאים מצורפים בברוטליות אל פני השטח העליונים של הצלוחיות ולאחר מכן הומרו תאי DFAT. בא, הצלוחיות היו הפוכות ותא DFAT היו בתרבית בשיטות מקובלות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: DCM משפר הדור תא DFAT. (
איור 3:. פוטנציאל Multilineage של תאי DFAT תאי DFAT אדם שנוצרו באמצעות DCM היו בתרבית במשך 3 שבועות בתקשורת האינדוקציה המתאימה כדי להעריך את יכולות redifferentiation והתמיינות של תאי DFAT. גאמות נותחו עבור osteogenic (ALP ו- S האדום פואית), adipogenic (שמן-O האדום) קיבולת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipocytes מבוגרים שעוברים ב dedifferentiation במבחנה, תהליך המכונה תרבות תקרה, עלול לחזור פנוטיפ פרימיטיווי יותר ולהשיג יכולות שגשוג. תאים אלה מכונים שומן dedifferentiated כתאים (DFAT). פוטנציאל בידול multilineage של תאי DFAT הוערך. Cytometry זרימה חשף ניתוח ביטוי ניתוח גנים שתאי DFAT היו הומוגנית מאוד בהשוואה 6 ASCs. למעשה, הפרופיל אנטיגן פני קרום התא של תאי DFAT דומה מאוד לאלה שנמצאו ASCs 6. בהתאם לכך, תאי DFAT עשויים פועלים באופן דומה MSCs.
הקבוצה השנייה אשר יצרה בהצלחה תא DFAT מנוצל מדיום תרבית תאי F12 DMEM בתוספת 20% עגל בסרום 7-8. למרות ניסינו לייצר תאי DFAT באמצעות מדיום תרבית תאים בתוספת 10% FBS, את מספר התאים DFAT מיוצר עם פרוטוקול זה היה נמוך משמעותית מ wתרנגולת השלימה עם 20% FBS (מידע לא מוצג). לכן, ריכוז FBS ו / או תוכנו חשוב dedifferentiation או של תאי DFAT ו / או תרבות תאי DFAT. במסגרת מחקר בעתיד, ננסה עוד להבהיר את המנגנון שבאמצעותו תוכן בסרום מסדיר דור ובחלוקה של תאי DFAT. מצד השני, DCM מכיל פחות גלוקוז, חומצות שומן וכימיקלים אחרים מאשר DMEM השתמש במחקר שלנו. השתנות זו תרבית תאי מרכיבים בינוניים עשויות לווסת את היעילות של השני דור צמיחת תאי DFAT. למעשה, ריכוז הגלוקוז נמוך מעט משפר את היעילות של דור תא DFAT בעת שימוש DMEM (מידע לא מוצג). למרות המנגנון המדויק בבסיס ההשפעה של DCM על דור צמיחת תאי DFAT אינו ידועים, אנו מניחים כאן כי ריכוז מרכיבים בינוניים מסוימים שמניע אירועים הסלולר אלה. יש צורך במחקרים נוספים כדי להבהיר את הנקודה הזו. יתר על כן, מאז יש לנו נבדק limiteד מספר פורמולציות DMEM, ניסויים נוספים נדרשים כדי להשוות את היעילות של וריאציות DMEM אחרים (למשל, DMEM המכיל L- גלוטמין או פירידוקסין) בייצור תאים DFAT.
למרות שאנו מסוגלים לייצר תאי DFAT, המנגנונים המולקולריים השולטים הדור תא DFAT עדיין לא ברורים. שאלות דומות להקיף את ייצור תאי iPS 11. כמו בשימוש קליני כזה של שיטות טיפול אלה ידרשו חקירה נוספת של מנגנוני ויסות מצב תא. בהתאם לכך, אנו מאמינים כי תאי DFAT לספק מודל הבהרה כיצד תאים לחזור גבעול דמוי תא מדינה, ללא transductions גן החיצוני. פרוטוקולי ייצור תאי DFAT ולכן, להיות מותאמים לשימוש כיום בניסויים קליניים עתידיים.
הבטחה כי בידוד תא טיפול ושומן collagenase שניהם ביצעו כראוי היא גורם מפתח ביצירת בהצלחה תאי DFAT שימוש בפרוטוקול זה. apprהשימוש opriate של מספריים בסדר והוצאת בועות במהלך התרבות גם לסייע בשיפור התפשטות תאים DFAT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
- Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
- de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
- Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
- Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
- Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
- Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
