Abstract
ऊतक इंजीनियरिंग और सेल थेरेपी महान वादा चिकित्सकीय पकड़ो। इस संबंध में, इस तरह के mesenchymal स्टेम सेल (MSCs), के रूप में multipotent कोशिकाओं, क्षतिग्रस्त अंगों को समारोह बहाल करने के लिए उपचारात्मक इस्तेमाल किया जा सकता है, निकट भविष्य में। फिर भी, MSCs और उनके आसपास के प्रवर्धन अक्षमता को अलग करने की अत्यधिक आक्रामक प्रक्रिया सहित कई तकनीकी मुद्दों, वर्तमान में इन चिकित्सकीय तौर तरीकों के संभावित नैदानिक इस्तेमाल में बाधा। इस के साथ साथ, हम dedifferentiated वसा कोशिकाओं (DFAT), एमएससी की तरह कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक बेहद कारगर तरीका परिचय। दिलचस्प बात यह है DFAT कोशिकाओं adipogenic, osteogenic, और chondrogenic कोशिकाओं सहित कई प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है। हालांकि अन्य समूहों के पहले परिपक्व वसा ऊतकों से DFAT कोशिकाओं को पैदा करने के लिए विभिन्न तरीकों का प्रस्तुत किया है, हमारे विधि हमें और अधिक कुशलता से DFAT कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए अनुमति देता है। इस संबंध में, हम दिखाना है कि DFAT संस्कृति के माध्यम से (डीसीएम), 20% के साथ पूरक FBS,DMEM से DFAT कोशिकाओं, 20% FBS के साथ पूरक पैदा करने में अधिक प्रभावी है। इसके अतिरिक्त, हमारे सेल संस्कृति विधि द्वारा उत्पादित DFAT कोशिकाओं कई प्रकार के ऊतकों में redifferentiated जा सकता है। जैसे, ऊतक dedifferentiation के अध्ययन के लिए एक बहुत ही रोचक और उपयोगी मॉडल प्रस्तुत किया है।
Introduction
सेल थेरेपी और ऊतक इंजीनियरिंग पुनर्योजी चिकित्सा 1-5 के क्षेत्र में गर्म विषय हैं। इन चिकित्सकीय रूपरेखा महान वादा पकड़ जबकि, कई तकनीकी मुद्दों वर्तमान में अपने नैदानिक इस्तेमाल में बाधा। इस संबंध में आईपीएस कोशिकाओं की पीढ़ी के रूप में, सभी ऊतक इंजीनियरिंग के उपचारों बाहरी जीन transductions की स्वतंत्र कोशिकाओं क्रम में मरीज की सुरक्षा बनाए रखने के लिए उत्पादन होगा। तदनुसार, हम पहले समूह सफलतापूर्वक मानव DFAT कोशिकाओं 6 का उत्पादन करने के लिए थे। कई अन्य अनुसंधान समूहों के बाद से स्तनधारी मूल 7-9 की DFAT कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए हमारे विधि को अपनाया है, आगे हमारे मॉडल की उपयोगिता पर प्रकाश डाला।
कई अध्ययनों के दौरान, हमने पाया है कि सेल संस्कृति पर्यावरण की गुणवत्ता सेल के माध्यम से सामग्री का समायोजन करके संशोधित किया जा सकता है। यह निष्कर्ष DFAT कोशिकाओं के उत्पादन की सफलता की दर में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व और सेल की गुणवत्ता में सुधार हुआ है; दोनों में महत्वपूर्ण कारकोंकुशलता से भविष्य चिकित्सीय परीक्षण के लिए कोशिकाओं को पैदा होता है। इस संबंध में, एक बेहतर DFAT संस्कृति के माध्यम से (डीसीएम, एक माध्यम के समान सेल माध्यम है, जो पुनः संयोजक मानव इंसुलिन, सीरम albumin, एल glutamic एसिड, कई फैटी एसिड होता है, और कोलेस्ट्रॉल स्टेम mesenchymal के लिए) और DFAT सेल पीढ़ी के लिए एक विधि में और प्रसार विकसित किया गया था (डीसीएम की सामग्री के बारे में अधिक जानकारी के अनुरोध पर उपलब्ध है)। का उपयोग करते हुए इस विधि उच्च गुणवत्ता DFAT कोशिकाओं adipogenic, osteogenic, और chondrogenic कोशिकाओं सहित कई प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के साथ उत्पन्न किया गया। कुल मिलाकर, यह मान्य सेल संस्कृति प्रोटोकॉल DFAT कोशिकाओं की गुणवत्ता को बढ़ाता है और सेल थेरेपी और ऊतक इंजीनियरिंग के नैदानिक अनुप्रयोगों को बढ़ाने के लिए काफी उपयोगी हो सकता है।
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Protocol
मानव वसा के नमूने प्लास्टिक सर्जरी, यूरोलॉजी, बाल चिकित्सा सर्जरी और निहोन विश्वविद्यालय इताबाशी अस्पताल (टोक्यो, जापान) के आर्थोपेडिक सर्जरी विभाग में सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त किया गया। रोगियों को सूचित लिखित सहमति दे दी, और निहोन विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन की आचार समिति के अध्ययन को मंजूरी दे दी।
1. ऊतक तैयार
- प्रयोगशाला के लिए ऑपरेशन रूम से ऊतक का नमूना ले आओ।
- (-) पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ वसा ऊतकों के धो 1-2 जी एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में कमरे के तापमान (आरटी) एक बार में, और उसके बाद एक 10 सेमी प्लास्टिक पकवान में नमूना रखें।
2. collagenase पाचन
- (-) पीबीएस से नमूना निकालें, तो बाँझ 0.1% की 10 मिलीलीटर जोड़ने (डब्ल्यू / वी) ऊतक का नमूना युक्त डिश के लिए collagenase समाधान (कोलेजिनेस प्रकार द्वितीय)।
- लगभग 15 मिनट के लिए शल्य कैंची के साथ ऊतक कीमा, जब तक यह एक pureed मिलकर पहुँचता हैency।
- बाद में, 0.1% में कीमा बनाया हुआ ऊतक (w / v) कोलैजिनेज़ एक प्रकार के बरतन पर कोमल आंदोलन के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 30 मिनट (60 आरपीएम) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को पचाने।
- एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पचा नमूना फ़िल्टर। इसके बाद, (सामग्री की तालिका देखें) फिल्टर के माध्यम से 2% FBS के साथ पूरक डीसीएम के 10 मिलीलीटर से गुजरती हैं।
3. सेल अलगाव
- आरटी पर 1 मिनट के लिए 100 XG पर छान कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
- इस बिंदु पर, के डीसीएम एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 2% FBS के साथ पूरक 5 मिलीलीटर तैयार करते हैं।
- इसके बाद, एक 1000 μl पिपेट का उपयोग कर चल वसा कोशिकाओं को आकर्षित और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब युक्त मध्यम कोशिकाओं जोड़ें।
- बाद में, कोशिकाओं के साथ डीसीएम मध्यम मिश्रण करने के लिए धीरे 50 मिलीलीटर ट्यूब हिला।
- फिर, आरटी पर 1 मिनट के लिए 100 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
- एक 18 जी सुई और एक 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग ट्यूब के नीचे मध्यम त्यागें।
- अगले, डीसीएम एस के 10 मिलीलीटर जोड़नेएकत्र कोशिकाओं को 2% FBS के साथ upplemented।
- धीरे 50 मिलीलीटर ट्यूब झटकों से कोशिकाओं के साथ डीसीएम मिक्स।
- आरटी पर 1 मिनट के लिए 100 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
4. चढ़ाना प्रकोष्ठों
- 12.5 सेमी कुप्पी के लिए 20% FBS के साथ पूरक डीसीएम या DMEM के 41 मिलीलीटर जोड़ें।
- इसके बाद, एक का उपयोग कर 200 μl पिपेट कुप्पी के लिए वसा कोशिकाओं के 40 μl जोड़ें।
- फिर, डीसीएम या DMEM 20% FBS के साथ पूरक के साथ फ्लास्क भरें। महत्वपूर्ण कदम: इस बिंदु पर, यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं मध्यम भर में फैले हुए हैं। दिखने में अलग कोशिकाओं की जाँच करें और बाद में एक दौर पेट्री डिश के ढक्कन पर कुप्पी रखने के लिए यह फ्लैट रखने के लिए।
- अंत में, मशीन के अंदर कुप्पी जगह है और यह 7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में undisturbed छोड़ दें।
- ऊष्मायन के एक सप्ताह के बाद, फ्लास्क पलटना और DFAT कोशिकाओं के लिए जाँच करें। अगले, DFAT सेल पीढ़ी प्रवीणता के रूप में इस बिंदु पर fibrobl के बाद से 10 में वर्णित का आकलनएएसटी की तरह कोशिकाओं (DFAT कोशिकाओं) वसा कोशिकाओं से अलग क्षेत्रों में स्थित हैं।
- डीसीएम या DMEM के जोड़े 5 मिलीलीटर पिछले सेल संस्कृति के माध्यम से हटाने के बाद कुप्पी के लिए 20% FBS के साथ पूरक। DFAT कोशिकाओं मध्यम बदलने के बाद एक सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें।
- एक सेल काउंटर का उपयोग करना, विभिन्न सेल संस्कृति शर्तों (डीसीएम बनाम DMEM) के तहत उत्पन्न DFAT कोशिकाओं की संख्या गिनती।
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Representative Results
इस अध्ययन में, विधि और DFAT सेल पीढ़ी के लिए टूलकिट (चित्रा 1) में सुधार हुआ था। हमारे विधि हम दोनों डीसीएम और DMEM 20% FBS (2A चित्रा) से युक्त माध्यम का उपयोग कर DFAT कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है। जैसे, हम DFAT कोशिकाओं को पैदा करने में डीसीएम और DMEM की दक्षता की तुलना में। इस संबंध में डीसीएम तीन बार से DFAT सेल प्रसार बढ़ाया जब, adipocytes की संख्या (चित्रा 2A और बी) की परवाह किए बिना DMEM की तुलना में। 20% का उपयोग FBS भी जब 10% FBS (नहीं दिखाया डेटा) का उपयोग कर प्रोटोकॉल की तुलना में सेल के विकास को बढ़ाता है। हम आगे की पुष्टि की है कि डीसीएम का उपयोग कर उत्पादन DFAT कोशिकाओं adipocytes में redifferentiate और (चित्रा 3) अस्थिकोरक में अंतर करने की क्षमता है। Assays के लिए विधि हमारे पिछले अध्ययन 6 में वर्णित है।
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चित्रा 1:। अलगाव, dedifferentiation चित्रण एक योजनाबद्ध, और परिपक्व adipocytes के संस्कृति वसा ऊतकों का एक छोटा सा टुकड़ा 0.1% collagenase के साथ पचा गया था। centrifugation के बाद, एककोष्ठकी adipocytes चल परत से अलग थे। अलग कक्षों मध्यम 7 दिनों के लिए 20% FBS युक्त के साथ भरा बोतल में सुसंस्कृत थे। संस्कृति के दौरान, कोशिकाओं संलग्न और बोतल की ऊपरी सतह को चपटा और फिर DFAT कोशिकाओं में परिवर्तित किया गया। अगले, बोतल उल्टे थे और DFAT कोशिकाओं पारंपरिक तरीकों का उपयोग सुसंस्कृत कर रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: डीसीएम DFAT सेल पीढ़ी को बढ़ाता है। (
चित्रा 3:। डीसीएम का उपयोग कर उत्पन्न DFAT कोशिकाओं के Multilineage संभावित मानव DFAT कोशिकाओं DFAT कोशिकाओं के redifferentiation और भेदभाव क्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए उचित प्रेरण मीडिया में 3 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे। गएल osteogenic (एएलपी और Alizarin लाल एस), adipogenic (तेल लाल-ओ) की क्षमता के लिए विश्लेषण किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
परिपक्व adipocytes है कि इन विट्रो dedifferentiation में से गुजरना है, एक प्रक्रिया छत संस्कृति के रूप में जाना जाता है, एक अधिक आदिम phenotype पर वापस लौटने और proliferative योग्यता हासिल कर सकता है। इन कोशिकाओं के रूप में dedifferentiated वसा (DFAT) कोशिकाओं में भेजा जाता है। DFAT कोशिकाओं के multilineage भेदभाव की क्षमता का मूल्यांकन किया गया था। फ्लो का विश्लेषण और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला है कि DFAT कोशिकाओं ASCs 6 की तुलना में अत्यधिक सजातीय थे। वास्तव में, DFAT कोशिकाओं के सेल सतह प्रतिजन प्रोफ़ाइल बहुत ASCs 6 में पाए जाने वाले के समान है। तदनुसार, DFAT कोशिकाओं MSCs की तरह ही काम कर सकता है।
अन्य समूह है जो सफलतापूर्वक DFAT कोशिकाओं को एक DMEM F12 सेल संस्कृति 20% बछड़ा सीरम 7-8 के साथ पूरक माध्यम का उपयोग उत्पन्न किया है। हालांकि हम एक सेल संस्कृति 10% FBS के साथ पूरक माध्यम का उपयोग कर DFAT कोशिकाओं का उत्पादन करने का प्रयास किया, इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पादन DFAT कोशिकाओं की संख्या डब्ल्यू तुलना में काफी कम थामुर्गी 20% FBS (डेटा नहीं दिखाया गया है) के साथ पूरक। इसलिए, FBS एकाग्रता और / या इसकी सामग्री DFAT कोशिकाओं के दोनों dedifferentiation और / या DFAT कोशिकाओं के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है। एक भविष्य अध्ययन के हिस्से के रूप में, हम आगे व्यवस्था है जिसके द्वारा सीरम सामग्री DFAT सेल पीढ़ी और प्रसार को नियंत्रित स्पष्ट करने का प्रयास करेंगे। दूसरी ओर, डीसीएम कम ग्लूकोज, फैटी एसिड और अन्य रसायनों से DMEM हमारे अध्ययन में इस्तेमाल होता है। सेल संस्कृति में इस परिवर्तनशीलता मध्यम घटक दोनों DFAT सेल पीढ़ी और विकास की दक्षता में मिलाना सकता है। वास्तव में, कम ग्लूकोज एकाग्रता थोड़ा DMEM का उपयोग करते समय DFAT सेल पीढ़ी की दक्षता में सुधार (डेटा) नहीं दिखाया। हालांकि सटीक DFAT सेल पीढ़ी और विकास पर डीसीएम के प्रभाव अंतर्निहित तंत्र अज्ञात हैं, हम यहाँ की मान्यता है कि कुछ मध्यम घटकों की एकाग्रता इन सेलुलर घटनाओं ड्राइव। आगे के अध्ययन से यह बात स्पष्ट करने की जरूरत है। इसके अलावा, हम एक Limite का परीक्षण किया है के बाद सेDMEM योगों के घ संख्या, आगे के प्रयोगों DFAT कोशिकाओं के उत्पादन में अन्य DMEM रूपों (जैसे, DMEM युक्त एल glutamine या pyridoxine) की क्षमता की तुलना करने के लिए आवश्यक हैं।
हालांकि हम DFAT कोशिकाओं का उत्पादन करने में सक्षम हैं, आणविक DFAT सेल पीढ़ी गवर्निंग तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है। इसी तरह के सवालों आईपीएस कोशिकाओं 11 के उत्पादन के चारों ओर। इन चिकित्सकीय तौर-तरीकों की एक ऐसी नैदानिक इस्तेमाल के रूप में सेल राज्य नियामक तंत्र के आगे की खोज की आवश्यकता होगी। तदनुसार, हम दृढ़ता से विश्वास है कि DFAT कोशिकाओं elucidating के लिए एक मॉडल प्रदान कैसे कोशिकाओं, बाहरी जीन transductions से मुक्त एक स्टेम सेल की तरह राज्य में लौटने। DFAT कोशिकाओं के उत्पादन प्रोटोकॉल, इसलिए कर रहे हैं भविष्य के क्लिनिकल परीक्षण में उपयोग के लिए वर्तमान में अनुकूलित किया जा रहा।
कि कोलैजिनेज़ उपचार और वसा कोशिका अलगाव दोनों ठीक से प्रदर्शन कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का उपयोग DFAT कोशिकाओं को पैदा करने में एक महत्वपूर्ण कारक है। apprसंस्कृति के दौरान ठीक कैंची और बुलबुले को हटाने की opriate उपयोग भी DFAT सेल प्रसार को बढ़ाने में सहायता।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
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