Abstract
Tissue engineering en celtherapie veelbelovend klinisch. In dit verband kan multipotente cellen, zoals mesenchymale stamcellen (MSCs), therapeutisch worden toegepast, in de nabije toekomst de functie herstellen beschadigde organen. Toch een aantal technische kwesties, waaronder de zeer invasieve procedure voor het isoleren van MSC's en de inefficiëntie rond hun versterking, momenteel belemmeren de potentiële klinische gebruik van deze therapeutische modaliteiten. Hierin introduceren we een zeer efficiënte werkwijze voor de productie van gededifferentieerde vetcellen (DFAT), MSC-achtige cellen. Interessant is DFAT cellen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen waaronder adipogenic, osteogene, chondrogene en cellen. Hoewel andere groepen die eerder verschillende methoden hebben ingediend voor het genereren van DFAT cellen uit volwassen vetweefsel, onze methode laat ons toe om DFAT cellen efficiënter te produceren. Hierbij tonen we dat DFAT kweekmedium (DCM), aangevuld met 20% FBS,effectiever in het genereren DFAT cellen dan DMEM, aangevuld met 20% FBS. Bovendien kan de DFAT cellen die door onze celkweek methode redifferentiated in verschillende weefseltypen. Als zodanig is een zeer interessant en nuttig model voor de studie van weefsel dedifferentiatie gepresenteerd.
Introduction
Celtherapie en tissue engineering zijn hot topics op het gebied van regeneratieve geneeskunde 1-5. Hoewel deze therapeutische modaliteiten zijn veelbelovend, een aantal technische kwesties die momenteel belemmeren hun klinisch gebruik. In dit opzicht, zoals bij het genereren van iPS cellen, alle weefselmanipulatie therapieën moeten cellen aan externe gen transductie produceren om patiëntveiligheid handhaven. Daarom waren we de eerste groep met succes de productie van menselijke cellen DFAT 6. Verscheidene andere onderzoeksgroepen hebben sindsdien aangenomen onze methode om DFAT cellen van zoogdieren oorsprong 7-9 te genereren, verder aandacht voor de bruikbaarheid van ons model.
Gedurende verscheidene studies hebben we gevonden dat de kwaliteit van de celkweek omgeving kan worden gewijzigd door instellen van de inhoud van het celmedium. Deze bevinding heeft geleid tot een verhoging van de slaagkans van DFAT celproductie en cellen kwaliteit verbeterd; zowel kritische factoren inefficiënt genereren van cellen voor toekomstige klinische trials. In dit opzicht een verbeterde DFAT kweekmedium (DCM, een medium vergelijkbaar met mesenchymale stamcel medium dat recombinant humaan insuline, serum albumine, L-glutaminezuur, verscheidene vetzuren bevat, en cholesterol) en een werkwijze voor DFAT celgeneratie en proliferatie werd ontwikkeld (meer informatie over de inhoud van DCM is beschikbaar op aanvraag). Deze methode hoogwaardige DFAT cellen werden gegenereerd met de mogelijkheid om te differentiëren in verschillende celtypes waaronder adipogenic, osteogene, chondrogene en cellen. Al met al, deze gevalideerd celkweek protocol verhoogt de kwaliteit van DFAT cellen en kunnen zeer bruikbaar voor het verbeteren van klinische toepassingen van celtherapie en tissue engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Monsters van menselijk onderhuids vet werden verkregen van patiënten die een chirurgische ingreep in de afdelingen plastische chirurgie, urologie, Pediatrische Chirurgie en Orthopedie van Nihon University Itabashi Hospital (Tokyo, Japan). De patiënten gaven schriftelijk informed consent, en de ethische commissie van Nihon University School of Medicine ingestemd met de studie.
1. Tissue Voorbereiding
- Breng het weefselmonster van de operatiekamer naar het laboratorium.
- Wassen 1-2 g vetweefsel met 5 ml PBS (-) bij kamertemperatuur (KT) eenmaal in een 50 ml buisje en plaats het monster in een 10 cm plastic schaaltje.
2. Collagenase Spijsvertering
- Verwijder het monster uit de PBS (-) toegevoegd, waarna 10 ml steriel 0,1% (w / v) oplossing collagenase (collagenase type II) het schaaltje met het weefselmonster.
- Gehakt het weefsel met chirurgische schaar ongeveer 15 minuten, totdat een gepureerd bestaan bereiktrantie.
- Vervolgens verteren gehakt weefsel in 0,1% (w / v) collagenase oplossing bij 37 ° C gedurende 30 min (60 rpm) in een 50 ml buis met zacht schudden op een schudder.
- Filtreer het gedigereerde monster door een 100 urn filter in een 50 ml buis. Daarna worden 10 ml DCM (zie tabel of Materials) aangevuld met 2% FBS door het filter.
3. Cel Isolatie
- Centrifugeer de gefilterde cellen bij 100 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Op dit moment bereiden 5 ml DCM aangevuld met 2% FBS in een 50 ml buis.
- Vervolgens stellen de drijvende vetcellen met behulp van een 1000 ui pipet en voeg de cellen om een 50 ml buis met medium.
- Vervolgens schud de 50 ml buis zachtjes aan de DCM medium met de cellen te mengen.
- Vervolgens centrifugeer de buis bij 100 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Gooi het medium bij de bodem van de buis met een 18 G naald en een 20 ml spuit.
- Voeg vervolgens 10 ml DCM supplemented met 2% FBS aan de cellen verzameld.
- Meng de DCM met de cellen door schudden van de 50 ml buis voorzichtig.
- Centrifugeer de buis bij 100 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
4. Plating Cellen
- Voeg 41 ml DCM of DMEM aangevuld met 20% FBS tot een 12,5 cm kolf.
- Dan worden op een 200 ul pipet voeg 40 ul van vetcellen aan de kolf.
- Vervolgens vul de kolf met DCM of DMEM aangevuld met 20% FBS. Kritische stap: Op dit punt, ervoor te zorgen dat de cellen liggen verspreid over het medium. Controleer visueel de vrijstaande cellen en daarna houden de kolf op het deksel van een ronde petrischaal om het plat te houden.
- Tenslotte zet de kolf in de couveuse en laat het ongestoord in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 7 dagen.
- Na een week van incubatie, draai de fles en controleer DFAT cellen. Vervolgens beoordeelt DFAT cel generatie vaardigheid zoals beschreven 10 omdat op dit punt fibroblast-achtige cellen (DFAT cellen) bevinden zich in de regio's verschillend van vetcellen.
- Voeg 5 ml DCM of DMEM aangevuld met 20% FBS aan de fles na verwijdering van de vorige celkweekmedium. Laat de DFAT cellen om te groeien voor nog een week na het wijzigen van het medium.
- Met behulp van een cel teller, tel het aantal DFAT cellen die onder verschillende celcultuur condities (DCM vs. DMEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie, de werkwijze en toolkit voor DFAT celgeneratie verbeterd (figuur 1). Onze methode kunnen we DFAT cellen te genereren met zowel DCM en DMEM medium met 20% FBS (figuur 2A). Daarom, hebben we de doelmatigheid van DCM en in DMEM genereren DFAT cellen. In dit verband DCM DFAT verhoogde celproliferatie driemaal vergelijking met DMEM, ongeacht het aantal adipocyten (figuur 2A en B). Gebruik 20% FBS verbetert ook celgroei in vergelijking met protocollen gebruiken 10% FBS (gegevens niet getoond). We verder bevestigd dat DFAT cellen geproduceerd met DCM hebben de mogelijkheid om redifferentiate tot adipocyten en differentiëren in osteoblasten (Figuur 3). De werkwijze voor het testen wordt beschreven in onze vorige studie 6.
7 / 54177fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Een schematische afbeelding van de isolatie, dedifferentiatie en cultuur van rijpe adipocyten Een stukje vetweefsel werd gedigereerd met 0,1% collagenase. Na centrifugeren werden uniloculaire adipocyten geïsoleerd uit de drijflaag. De geïsoleerde cellen werden gekweekt in flessen gevuld met medium dat 20% FBS gedurende 7 dagen. Tijdens kweek worden de cellen bevestigd en afgeplat aan het bovenoppervlak van de flessen en vervolgens omgezet om DFAT cellen. Vervolgens werden de flessen omgekeerd en DFAT cellen werden gekweekt met behulp van conventionele methoden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: DCM verbetert DFAT cel generatie. (
Figuur 3:. Multilineage potentieel van DFAT cellen Menselijke cellen DFAT gegenereerd met DCM werden gedurende 3 weken in de juiste inductiemedia de herdifferentiatie en differentiatie mogelijkheden van DFAT cellen evalueren. de cells werden geanalyseerd op osteogene (ALP en alizarinerood S), adipogenic (Oil red-O) capaciteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Volwassen adipocyten dat ondergaan in vitro dedifferentiatie, een proces dat bekend staat als het plafond cultuur, kan terugkeren naar een meer primitieve fenotype en krijgen proliferatieve capaciteiten. Deze cellen worden aangeduid als gededifferentieerde vet (DFAT) cellen. De multilineage differentiatiepotentiaal van DFAT cellen werd geëvalueerd. Flow cytometrie analyse en genexpressie analyse bleek dat DFAT cellen zeer homogeen vergeleken met ASC 6. In feite, de cel-oppervlakte-antigeen profiel van DFAT cellen is vergelijkbaar met de in ASC 6. Dienovereenkomstig kunnen DFAT cellen vergelijkbare functie om MSCs.
De andere groep die met succes heeft gegenereerd DFAT gebruikte cellen een DMEM F12 cel kweekmedium aangevuld met 20% kalfserum 7-8. Hoewel we geprobeerd DFAT cellen met een celkweekmedium aangevuld met 10% FBS, het aantal DFAT cellen die met dit protocol was significant lager dan wikip aangevuld met 20% FBS (gegevens niet getoond). Daarom is de FBS-concentratie en / of de inhoud is belangrijk voor zowel dedifferentiatie van DFAT cellen en / of proliferatie van cellen DFAT. Als onderdeel van een toekomstige studie, zullen we proberen om het mechanisme waarmee serum inhoud betreft DFAT cel generatie en proliferatie verder te ontrafelen. Anderzijds, DCM bevat minder glucose, vetzuren en andere chemicaliën dan DMEM gebruikt in onze studie. Deze variabiliteit in celkweekmedium componenten kunnen de efficiëntie van zowel DFAT celgeneratie en groei moduleren. In feite, lage glucoseconcentratie enigszins verbetert de efficiëntie van DFAT celgeneratie bij gebruik van DMEM (gegevens niet getoond). Hoewel het precieze mechanisme onderliggend effect DCM op DFAT celgeneratie en groei bekend, postuleren we hier dat de concentratie van bepaalde bestanddelen medium drijft deze cellulaire gebeurtenissen. Verdere studies zijn nodig om dit punt te verduidelijken. Aangezien we hebben een limite getestd aantal DMEM samenstellingen zijn verdere experimenten nodig om de efficiëntie van andere DMEM variaties (bijvoorbeeld DMEM met L-glutamine en pyridoxine) vergelijken DFAT producerende cellen.
Hoewel we kunnen DFAT cellen, de moleculaire mechanismen die DFAT celgeneratie is nog onduidelijk. Vergelijkbare vragen rond de productie van iPS-cellen 11. Als zodanig klinisch gebruik van deze therapeutische modaliteiten zullen verdere verkenning van de cel staat regulerende mechanismen nodig. Daarom zijn wij ervan overtuigd dat DFAT cellen te voorzien van een model voor het ophelderen hoe cellen terug te keren naar een stamcel-achtige toestand, vrij van externe gen transducties. DFAT celproductie protocollen daarom wordt nog geoptimaliseerd voor gebruik in toekomstige klinische trials.
Ervoor zorgen dat collagenase behandeling en vet cel isolatie zijn beide correct uitgevoerd is een belangrijke factor in het succesvol genereren DFAT cellen met behulp van dit protocol. ca.opriate gebruik van fijne schaar en verwijdering van bellen tijdens cultuur ook helpen bij het verbeteren van DFAT cel proliferatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
- Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
- de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
- Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
- Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
- Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
- Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
