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Chemistry

Schnelle Hochdurchsatz-Spezies Identifizierung von Pflanzen von Material mit Direktanalyse in Echtzeit hochauflösender Massenspektrometrie

Published: October 2, 2016 doi: 10.3791/54197
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, University at Albany-SUNY

Summary

Verfahren zur Identifizierung von Arten von botanischen Material durch direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie und multivariate statistische Analyse vorgestellt.

Abstract

Wir zeigen, dass die direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie verwendet werden können Massen Spektralprofile botanischer Material zu produzieren, und dass diese chemischen Fingerabdrücke für die Pflanzenarten Identifizierung verwendet werden. Die massenspektroskopischen Daten schnell und in einem Hochdurchsatz Weise ohne die Notwendigkeit für die Probenextraktion, Derivatisierung oder pH-Einstellung Schritten erfasst werden. Die Verwendung dieser Technik umgeht Herausforderungen durch herkömmlichere Techniken vorgestellt einschließlich langwierige Chromatographie Analysezeiten und ressourcenintensive Verfahren. Die hohe Durchsatzfähigkeiten der direkten Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie-Protokoll, gekoppelt mit multivariaten statistischen Analyseverarbeitung der Daten, bieten nicht nur Klasse Charakterisierung von Pflanzen, sondern auch Arten und Sorten Informationen ergeben. Hier wird die Technik mit zwei psycho pflanzlichen Produkten demonstriert, Kratombaum (Kratom) und Datura(Jimsonweed), die direkte Analyse in Echtzeit-Hochauflösende Massenspektrometrie durch statistische Analyseverarbeitung der Massenspektraldaten gefolgt unterworfen. Die Anwendung dieser Werkzeuge im Tandem ermöglicht die Pflanzenmaterialien schnell auf der Ebene der Vielfalt und Arten identifiziert werden.

Introduction

Seit Jahrtausenden psycho natürliche Produkte wurden in schamanistischen Ritualen, missbraucht für ihre bewusstseinser Attribute und verbraucht für ihre medizinischen Eigenschaften verwendet. Die Einnahme dieser Pflanzen und verwandten pflanzlichen Stoffen können in Bereichen von Bedeutung sein, wo sie endemisch sind, und sie haben soziale und wirtschaftliche Bedeutung. Vor kurzem jedoch hat es einen dramatischen Anstieg bei der Verwendung dieser "natürlichen" Drogen gewesen wegen der Leichtigkeit der Zugänglichkeit durch den Handel im Internet. Die Wahrnehmung, dass diese Substanzen sicher sind, mit einem erhöhten Vorgehen gegen den Besitz und die Verwendung von traditionellen Drogen und synthetische Substanzen gekoppelt zu verwenden, haben auf die Spitze in den Missbrauch von pflanzlichen Drogen beigetragen. Es ist im Allgemeinen schwierig, durch Visualisierung zwischen diesen Produkten und harmlos Pflanzenmaterial zu unterscheiden, und daher besteht ein Interesse Methoden zu entwickeln, die verwendet werden können, diese Produkte zu identifizieren. Doch herkömmliche analytische Methoden für die PflanzenSpezies Identifizierung sind zeitaufwendig und unpraktisch durchzuführen. Darüber hinaus ist das Verfahren Entwicklungsprozess zeit- und ressourcenintensiv. Diese Faktoren haben die Crafting von Rechtsvorschriften die Verwendung dieser Stoffe weit hinter der Geschwindigkeit der Eskalation in ihren Missbrauch Einhalt zu gebieten. So gibt es nur wenige Gesetze, die die Erzeugung, Herstellung, Verkauf und Konsum von vielen dieser natürlichen Psychoaktiva und als solche regeln, gibt es Hunderte von Pflanzen von Missbrauch Nutzern zur Verfügung , in Tausenden von verschiedenen Formen. 1,2

Zwei solche pflanzlichen Drogen von Missbrauch sind Kratombaum, die gemeinhin als Kratom bekannt und Pflanzen aus der Datura Gattung, nämlich D. stramonium, D. ferox und D. inoxia. Kratom und Datura sind azyklisch in den Vereinigten Staaten, aber die Drug Enforcement Administration hat sowohl als Arzneimittel zur Sorge aufgeführt. 3,4 Kratom durch die Anwesenheit der psychotrope Verbindungen gekennzeichnet ist Mitragynin einnd 7-hydroxymitragynine sowie andere nicht-psychoaktiven Alkaloide einschließlich Mitraphyllin, paynantheine, corynoxeine und Rhynchophyllin. 4-8 Die psychoaktiven Eigenschaften von Datura spp. werden Atropin und Scopolamin zugeschrieben, aber eine Vielzahl von anderen Tropan - Alkaloiden wurden in den Pflanzen. 9-12 Sowohl Kratom und Datura wurden impliziert in Vergiftungen und Todesfälle und ihre Identifizierung ist zunehmend notwendig in beiden forensischen und toxikologischen Kontexte identifiziert worden ist , als der Missbrauch dieser Produkte ist auf dem Vormarsch. 13-16

Im Großen und Ganzen verwendet traditionelle Methoden für die Analyse von forensischer Drogen Material, wie zum Beispiel Farbtests, Mikroskopie und Raman und Infrarotspektroskopie, werden in der Regel in / Regel-out vermutliche lastet. Kopplungstechniken, wie beispielsweise GC-MS und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) sind bestätigende Analyseverfahren basierend auf einem Vergleich der Profile von detektierten AnalytenIn den wissenschaftlichen Arbeitsgruppe zur Analyse der beschlagnahmten Drogen (SWGDRUG) Bibliotheksstandards. 17 Die Probenbehandlungsschritte , die vor der Analyse einschließlich Pulverisierung, Extraktion, Derivatisierung und Verdampfung durchgeführt werden, können Stunden , um die Laufzeit hinzugefügt und die Probe verfälschen, 9,11 , 18,19 Herstellung Analyse von botanischen Drogen weniger als einfach im Vergleich zu derjenigen für andere traditionelle Drogen wie Kokain oder Heroin. Darüber hinaus müssen die einzelnen chromatographischen Programme für jedes Produkt von Interesse entwickelt werden, die für jede Art oder Sorte von pflanzlicher Basis Drogenmissbrauch sehr unpraktisch für Routine Fallarbeit der Implementierung von Standard-Betriebsprotokolle macht.

Eine direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie ist eine Ambient-Ionisations-Massenspektrometrie-Technik, die einige der Herausforderungen im Zusammenhang mit herkömmlichen analytischen Methoden umgeht. Gase, Flüssigkeiten, Feststoffe, Pulver, DC-Platten und Pflanzen material können direkt durch direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie und sowohl polare als auch nichtpolare Verbindungen leicht in komplexen Matrices nachgewiesen werden kann. 20-22 Des Weiteren analysiert werden, haben Studien gezeigt , dass psychoaktive Verbindungen können schnell in identifiziert werden Pflanzenmaterial durch die direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie und speziesspezifische Informationen können aus der statistischen Verarbeitung der massenspektroskopischen Daten zu entnehmen. 22-26

Hier zeigen wir , dass die direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie verwendet werden können , um schnell verschiedene Pflanzenmaterial (dh Pflanzen, Pulver, Extrakte und Samen) für ihre psycho Komponenten beurteilen zu können , und dass die Arten und Sorten der anlagen- abgeleiteten Produkte können in einer schnellen und Hochdurchsatz-Art und Weise bestimmt werden. Die Analyse der forensically relevant botanischen Materials ohne die Notwendigkeit für die Probenvorbereitungsschritte oder Lang chromatographischeAnalyse Laufzeiten wird zusätzlich zu den Pflanzenarten Identifizierung berichtet.

Protocol

1. Herstellung von Pflanzenmaterialien

  1. Kratom Frisches Blattmaterial
    1. Verwenden Sie einen Durchmesser von 6 mm Lochung zu schaffen einheitliche chads von Kratom Blattmaterial von M. speciosa Pflanze. 5-mal wiederholen.
  2. Kratom Puderabsaugung
    1. Mix 5 ml Ethanol und 5 ml destilliertem Wasser zu schaffen 1: 1-Lösungsmittelgemisch für die Extraktion.
    2. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, zu suspendieren , eine kleine Menge (~ 5 mg) von Kratom Bali Pulver in 1 ml 1: 1 EtOH: H 2 O Lösungsmittelgemisch. 5-mal wiederholen.
    3. Beschallen die Kratom Bali Pulverextraktproben in einem Ultraschallbad für 30 min bei Umgebungstemperatur.
    4. Zentrifugieren Sie die Kratom Bali Pulverextrakt Proben für 2 Minuten bei 750 · g bei Raumtemperatur.
    5. Dekantieren, das Lösungsmittel aus Restpulver für die spätere Analyse.
  3. Datura Animpfmischung
    1. Schneiden Sie ein D. stramOnium - Samen in die Hälfte in der transversalen Ebene unter Verwendung einer Rasierklinge. Wiederholen Sie 5 verschiedene Samen verwendet.
    2. Wiederholen Sie dies für D. inoxia und D. Ferox Samen.

2. Direkte Analyse in Echtzeit Ionenquelle Parameter

  1. Gasheizung Temperatur
    1. Stellen Sie den Gaserhitzer Temperatur der Ionenquelle auf 350 ° C.
  2. Ionen - Modus
    1. Führen Sie die Analyse im Positiv-Ionen-Modus mit Netzspannung von 250 V.
  3. Helium Gasflussrate
    1. Stellen Sie den Heliumgasflussrate auf 2,0 l / sec.

3. Time-of-Flight-Massenspektrometer-Parameter

  1. Orifice Spannungen
    1. Stellen Sie die Blende 1-Spannung bis 20 V und die Öffnung 2 Spannung bis 5 V.
  2. Ring - Objektiv und Spitzenspannung
    1. Stellen Sie die Ringlinse Spannung bis 5V und ändern Sie die Spitzen-Spannung bis 600 V.
  3. Massenspektrometrische Acquisition
    1. Stellen Sie die Massenspektralanalyse Erfassungsrate bis 1 Spektrum pro Sekunde über einen Massenbereich von m / z 60-800.
  4. Massenspektrometer Auflösungsvermögen
    1. Stellen Sie die Auflösung des Massenspektrometers bis 6000 FWHM.

4. Analyse von Pflanzenmaterialien

  1. Analyse von Kratom Blatt
    1. Drücken Sie "Start Run" in Massenspektrometers Steuerungssoftware. Hängen Sie das chad von Pflanzenmaterial zwischen der Ionenquelle und Massenspektrometer Einlass (ca. 2 cm vom Einlass) mit einer Pinzette, bis ein Spektrum erhalten wird. Wiederholen Sie 5-mal mit separaten chads von Pflanzenmaterial.
    2. Kalibrieren des Spektrums mit Polyethylenglycol 600 (PEG).
      1. Dip das geschlossene Ende eines Schmelzpunkt Kapillarrohr in die PEG-Standard. Hängen Sie die beschichtete Kapillare between der Ionenquelle und dem Massenspektrometer Einlass.
    3. Nach der PEG-Standard zu analysieren, wählen Sie die "Stop", um den Analysenlauf zu beenden.
    4. Drücken Sie "Start Run" in Massenspektrometers Steuerungssoftware. Suspend eine geringe Menge an getrockneten Blattmaterials zwischen der Ionenquelle und Massenspektrometereinlass mit einer Pinzette bis ein Spektrum erhalten wird. 5 Mal wiederholen, jedes Mal neue Pflanzenmaterial zu analysieren.
    5. Kalibrieren Sie das Spektrum mit PEG.
      1. Dip das geschlossene Ende einer Kapillare in die PEG-Standard. Suspendieren des beschichteten Kapillare zwischen der Ionenquelle und dem Massenspektrometer Einlass.
    6. Nach der PEG-Standard zu analysieren, wählen Sie die "Stop", um den Analysenlauf zu beenden.
  2. Analyse von Kratompulver
    1. Drücken Sie "Start Run" in Massenspektrometers Steuerungssoftware. Tauchen Sie das geschlossene Ende eines Schmelzpunkt Kapillare in das Kratom Pulver.
    2. Suspend die beschichtete Kapillare zwischen der Ionenquelle und Massenspektrometereinlass bis ein Spektrum erhalten wird. Wiederholen Sie die Analyse 5-mal mit einer neuen Kapillare jedes Mal.
    3. Kalibrieren Sie das Spektrum mit PEG.
      1. Dip das geschlossene Ende einer Kapillare in die PEG-Standard. Suspendieren des beschichteten Kapillare zwischen der Ionenquelle und dem Massenspektrometer Einlass.
    4. Nach der PEG-Standard zu analysieren, wählen Sie die "Stop", um den Analysenlauf zu beenden.
  3. Analyse von Kratom Extract
    1. Tauchen das geschlossene Ende eines Kapillarröhrchens in den Extrakt.
    2. Suspendiere das Kapillarrohr in den 12 Probenhalter auf der linearen Schiene zum Massenspektrometer befestigt. Wiederholen 5 mal mit einem anderen Extrakt jeder Zeit.
    3. Drücken Sie "Start Run" in Massenspektrometers Steuerungssoftware. Mit dem Bedienfeld, wählen Sie die Schaltfläche ">" die lineare Schiene durch den Ionenstrom mit einer Geschwindigkeit von 1 mm / s voraus zusammeln Spektren.
    4. Kalibrieren Sie das Spektrum mit PEG.
      1. Dip das geschlossene Ende einer Kapillare in die PEG-Standard. Suspendieren des beschichteten Kapillare zwischen der Ionenquelle und dem Massenspektrometer Einlass.
    5. Nach der PEG-Standard zu analysieren, wählen Sie die "Stop", um den Analysenlauf zu beenden.
  4. Analyse von Datura Samen
    1. Drücken Sie "Start Run" in Massenspektrometers Steuerungssoftware. Hängen Sie die Datura Samen Hälfte zwischen der Ionenquelle und Massenspektrometer Einlass mit einer Pinzette , bis ein Spektrum gesammelt wird. Stellen Sie sicher, dass die Schnittseite orientiert sich an die Ionenquelle gegenüber. 5 Mal wiederholen, eine neue Samen Hälfte jedes Mal zu analysieren.
    2. Kalibrieren Sie das Spektrum mit PEG.
      1. Dip das geschlossene Ende einer Kapillare in die PEG-Standard. Suspendieren des beschichteten Kapillare zwischen der Ionenquelle und dem Massenspektrometer Einlass.
    3. Nach der PEG-Standard zu analysieren,wählen Sie die "Stop", um den Analysenlauf zu beenden.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.1-4.4.3 für jede Datura - Arten.

5. Datenverarbeitung

  1. Translating Datendateien
    1. In der Datenverarbeitungssoftware, wählen Sie Datei "Übersetzen DART-Dateien" mit "automatische Kalibrierung" eingeschaltet, um kalibrierte Daten-Dateien erstellen.
    2. Linksklick und ziehen Sie einen Rahmen um den ersten Peak im Chromatogramm und wählen Sie "Average" eine gemittelte Spektrum zu erzeugen.
    3. Rechts klicken und ein Feld um einen Bereich ziehen, wo keine Probe entnommen wurde, und wählen Sie "Average gesamte Feld als Hintergrund" Hintergrund aus dem gemittelten Spektrum zu subtrahieren.
    4. Speichern Sie das Massenspektrum als TXT-Datei.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1-5.1.4 für jeden Peak im Chromatogramm eine gemittelte Spektrum zu erzeugen für jede in der Datei zu replizieren.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.2-5.1.5 für jede Datei gesammelt.

    6. Statistische Analyse

    1. Hauptkomponentenanalyse
      1. Im Classify Abschnitt der Spektralanalyse-Software (Siehe Liste der Materialien), im Rahmen der "Set up" Registerkarte Erstellen von Klassen für die Datenverarbeitung durch die Auswahl von "Klasse hinzufügen".
      2. Importieren Sie die Textdateien von Daten, indem Sie auf "Datei hinzufügen (s)".
      3. Ordnen Sie Datendateien in die entsprechende Klasse von Pflanzen von Textdateien auswählen und "Set-Klasse für ausgewählten Dateien".
      4. Wählen Sie Merkmal Massen zur Unterscheidung von MS aus Trainingsset und eingestellten Schwellwert% bis 1%.
      5. Legen Sie einen Massentoleranz (MMU) bis 10, und wählen Sie "Build-Vektoren von Datendateien".
      6. In der "Compute" Abschnitt, führen Hauptkomponentenanalyse durch die Box für 3D-PCA Graph Überprüfung und wählen Sie "Berechnen".
      7. Führen Sie Leave-one-out Kreuzvalidierung durch Auswahl von "Validate (SLOW!)."
    3. Im Häufigkeitsplot Register der spektralen Analyse-Software, eine Heatmap von Daten erzeugen, indem Sie "Heat Map".
    4. Wählen Sie "Threshold gespeicherten Daten", um Fülle Schwelle auf 1% festgelegt.
    5. Exportieren Sie die Heatmap in eine Tabelle, indem Sie "Speichern Heat Map zu Excel".
    6. Im Tabellenkalkulationsprogramm, speichern Sie die exportierte Heatmap als TXT-Datei.
  2. Hierarchical Clustering - Analyse
    1. Importieren Sie die Heatmap als TXT-Datei in Cluster 3.0-Software.
    2. In der hierarchischen Registerkarte Cluster 3.0 unter Gene und Arrays, Kontrollkästchen "Cluster" und "berechnen Gewichte". Stellen Sie Cutoff bei 0,1 und Exponenten 1. Einzel Verknüpfung Wählen Sie Clustering-Analyse durchzuführen.
    3. Sehen Sie sich die erzeugten .cdt Datendatei in Java Treeview.

Representative Results

Repräsentative weiche Ionisierung positiv-Ionen - Modus eine direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie - Daten von Kratom Produkte und Datura Samen sind in den Abbildungen 2 und 3 dargestellt ist . Verschiedene Verbindungen , die bereits von M. isoliert speciosa, einschließlich Mitragynin (C 23 H 30 N 2 O 4 + H +, m / z 399,2284) und 7-hydroxymitragynine (C 23 H 30 N 2 O 5 + H +, m / z 415,2233), in allen vier nachgewiesen Proben und die Massenmessdaten entsprechen , sind in Tabelle 1 aufgeführt . 4-8 Representative Datura Daten werden in Figur 3 gezeigt und Unterschrift Biomarkern einschließlich Atropin (C 17 H 23 NO 3 + H +, m / z 290,1756) und Scopolamin (C 17 präsentiert H 21 NO 4 + H + M / z 304.1549) wurden in den drei Spezies nachgewiesen. Massenmessdaten mit Abbildung 3 zugeordnet sind in Tabelle 2 dargestellt. 12.09 Verbindung Identitäten wurden durch Elementarzusammensetzung Bestimmung, Isotopenanpassung bestätigt und Vergleiche zu Berichten in der Literatur. 23-24

Heatmap - Renderings der direkten Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie - Spektren von Kratom und Datura sind in Abbildung 4 dargestellt. Die präsentierten Daten wurden in der Hauptkomponentenanalyse (PCA) verwendet , um zwischen den beiden Klassen von pflanzlichen Drogen zu unterscheiden von Missbrauch (Abbildung 5). Die PCA Plot wurde mit zehn Spiel Massen konstruiert sind (siehe Tabelle 3), mit blauen Kreisen repräsentieren Kratom Daten und rote Quadrate repräsentieren Datura Daten. Die Merkmals Massen entsprach verschiedene Alkaloide ausgewählt, die inDatura oder Mitragyna spp., Einschließlich der psycho Verbindungen Atropin, Scopolamin, Mitragynin und 7-hydroxymitragynine 23,24 . Drei Hauptkomponenten für 75,26% der Varianz und Leave-one-out Kreuzvalidierung (LOOCV) betrug 100%. Die PCA Kurve zeigt deutlich , dass die Kratom Daten und Datura Daten gut voneinander gelöst werden. PCA - Analyse zeigte auch , dass die einzelnen Sorten von Kratom und die verschiedenen Arten von Datura identifiziert werden konnten und voneinander unterschieden (Figur 6). LOOCV betrug 94,29% mit drei Hauptkomponenten 75,26% der Varianz abdeckt. Die beiden Sorten von Kratom (Bali in blauen Kreisen und Rifat in roten Quadraten) Cluster zusammen angeben, dass sie zu der Spezies M. gehören speciosa, sind jedoch voneinander gelöst, was zeigt , dass sie verschiedene Varietäten darstellen. Darüber hinaus ist die Datura Artengruppe zusammen und vom M. getrennt speciosa Daten, aber jeder der einzelnen Arten von Datura (D. inoxia in grüne Dreiecke, D. stramonium in rosa Quadrate und D. ferox in Türkis Kreise) sind deutlich zu unterscheiden. Trotz eines Datenpunktes für D. stramonium erscheint ein Ausreißer zu sein, wird das Saatgut korrekt als D. eingestuft stramonium und nicht D. inoxia mit PCA. Am wichtigsten ist , den Unterschied in der Samenfarbe zwischen D. stramonium und D. inoxia bestätigt sie unterschiedliche Arten sind und dass der Datenpunkt in Frage kann nicht sein D. inoxia.

Hierarchical Clustering (Abbildung 7) wurde ohne a priori - Auswahl von Merkmals Massen durchgeführt. Stattdessen wurde die gesamte Gruppe der spektralen Datensätzen überspannt einen Massenbereich von m / z 60-800 importiert in Open - Source - genomische Clustering - Software und ein Dendrogramm diese Daten mit produziert. Die Ergebnisse of HCA auch Klasse enthüllt, Art und Sorte Differenzierung allein auf der Grundlage direkter Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie abgeleiteten Daten und denen der PCA-Analyse bestätigt. Die beiden Klassen von pflanzlichen Drogen von Missbrauch, Kratom und Datura, wurden in einzelne clades des dendrogram getrennt. Darüber hinaus wurden die Rifat und Bali Sorten von Kratom jeweils getrennt in einzelne Teil clades innerhalb des Kratom-Klasse. In ähnlicher Weise D. inoxia, D. ferox und D. stramonium wurden innerhalb der Datura Klasse in ihre eigenen clades nach Arten gelöst werden .

Abbildung 1
Abbildung 1. Bilder von M. speciosa (Kratom) Produkte und Datura spp Samen a: Bali Kratom getrocknete Blatt; b:.. Bali Kratom Pulver; c: Rifat Kratom lebenden Pflanzen; D. stramonium Samen; e: D. inoxia Samen; f: D. Ferox Samen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie positiv-Ionen - Spektren von M. speciosa (Kratom) Produkte ein: Rifat frisches Blatt; b. Bali getrocknete Blätter, c: Bali - Pulver; d: Bali Pulverextrakt. Die Massenmessdaten mit diesen Spektren zugeordnet sind in Tabelle 1 dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Eine direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie positiv-Ionen - Spektren von Datura spp. . Samen a: D. ferox; b: D. inoxia; c: D. stramonium. Die Massenmessdaten mit diesen Spektren zugeordnet sind in Tabelle 2 dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Heatmap Renderings der direkten Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie - Spektren von Kratom und Datura Pflanzenmaterialien. Hallogh Intensitätsspitzen sind in Dunkelrot und untere Intensitätsspitzen gezeigt in helleren Farbtönen angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Hauptkomponentenanalyse (PCA) Grundstück von Kratom und Datura Produkte konstruiert direkte Analyse in Echtzeit hochauflösender Massenspektrometrie abgeleitete Daten. Drei Hauptkomponenten (PCs) für 75,26% der Variation bilanziert und der Abschied ein- out Kreuzvalidierung (LOOCV) betrug 100%. Die Feature - Massen für die PCA sind in Tabelle 3. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 6. Hauptkomponentenanalyse (PCA) Grundstück von Kratom und Datura Produkte durch direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie - Daten. Klassenzuordnungen wurden auf der Grundlage der Vielfalt (Kratom) oder Art (Datura) der Pflanzenmaterialien. Drei Hauptkomponenten (PCs) entfielen 75,26% der Variation und der leave-one-out Kreuzvalidierung (LOOCV) betrug 94,29%. Die Feature - Massen für PCA sind in Tabelle 3 aufgeführt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7
Abbildung 7. Hierarchical Clustering Ergebnisse mithilfe der direkten Analyse in Echt ti erhaltenme-hochauflösender Massenspektrometrie-abgeleiteten Daten aus der Analyse von Kratom und Datura Pflanzenmaterialien. Die beiden Klassen von Pflanzen deutlich in zwei verschiedene Zweige in Dendrogramm getrennt sind (in blau und rot Klammern für Kratom und Datura dargestellt sind). Die Datura Saatgutarten sind auch voneinander (gezeigt in grün, türkis und rosa gestrichelte Kästen für D. inoxia, D. ferox und D. stramonium beziehungsweise) gelöst. Die Kratom Pflanzenmaterialien durch Vielfalt (dargestellt in rot und blau gestrichelte Kästen für Rifat und Bali, beziehungsweise) voneinander getrennt sind. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1
Tabelle 1. Massenmessdaten im Zusammenhang mit der weichen Ionisierung Spektren von Kratom products in Abbildung 2 dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Tabelle 2
Tabelle 2. Massenmessdaten im Zusammenhang mit der weichen Ionisierung Spektren von Datura Samen in Abbildung 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Tabelle 3
Tabelle 3. Eigenschaft Massen für die Hauptkomponentenanalyse Grundstück verwendet von Kratom und Datura Produkte in den 5 und 6.

Discussion

Die Fähigkeit , auf pflanzlicher Basis Drogen zu identifizieren , ist die Notwendigkeit der Erhöhung aufgrund der dramatischen Anstieg in den Bereichen Marketing, Verkauf und Konsum von ungeplanten psychotroper Substanzen. 2 Traditionelle Methoden zur Identifizierung von botanischen Material in der Regel Charakterisierung der physikalischen Merkmale betreffen , gekoppelt mit der Analyse der chemische Bestandteile durch Bindestriche chromatographischen-massenspektrometrischen Methoden. Doch diese beiden Ansätze gegenwärtigen Herausforderungen zu rationalisiert Analyse. Physikalische Eigenschaften der Pflanzen werden oft zerstört , wenn die Pflanzen getrocknet, pulverisierten oder während des Herstellungsprozesses extrahiert und als solches ist es oft schwierig , eine Art von Pflanzenbasis psychotrope Produkt von einem anderen zu unterscheiden , allein basierend auf physikalischen Eigenschaften. 23 Analyse von chromatographische-massenspektrometrischen Methoden kann die Identifizierung der psychotrope Verbindungen in pflanzlichen Matrices ermöglichen, aber die Probenvorbereitung und Methodenentwicklung ist Zeit einnd ressourcenintensiv, und die Schaffung neuer Protokolle für jede Klasse oder Spezies von pflanzlicher Basis Drogenmissbrauch ist unpraktisch in vielen forensischen Chemie-Labors.

Eine direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie umgeht einige dieser Herausforderungen, wie komplexen Matrices wie Blätter, Pulver, Extrakte und Samen können mit wenig Probenvorbereitung analysiert werden. Trotz der komplexen Matrices der Materialien hier abgetastet wurden die psychoaktive Bestandteile leicht erkennbar, selbst bei Konzentrationen Nanogramm-, 21 aufgrund der hohen Empfindlichkeit des Massenspektrometers. Samen, Blättern und Pulver wurden gezeigt, um leicht durch direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie, und eine Vielzahl von anderen Arten von Materialien können auch in der gleichen Weise abgetastet werden, analysiert werden, einschließlich der DC-Platten, Währung, Tabletten, Blumen, Festphasenmikroextraktion (SPME) Fasern und sogar Insekten puparial Hüllen 21,22 . Durch genaue Masse anaLyse, elementare Zusammensetzung Bestimmung und Isotopenanpassung kann Biomarkern und Verbindungen von Interesse identifiziert werden, unabhängig davon, ob die Verbindungen in einem Blatt enthalten sind, auf einer DC-Platte getupft und auf ein Kapillarrohr beschichtet.

Eine direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie Methodik kann für eine optimierte Analyse verwendet werden, da es nur sehr wenige Parameter, die aus dem Experiment modifiziert werden müssen, zu experimentieren. Die Analyse kann in positive Ionen oder negative Ionen-Modus durchgeführt werden, und die Moleküle von bis zu 3.000 amu kann in beiden Fällen nachgewiesen werden. Ionisierung in Positivionenmodus erfolgt durch Protonenübertragung von aktivierten Wassercluster, 21 und jede Verbindung mit einer Protonenaffinität höher als die von Wasser ionisiert werden. Hier wurde als positiv-Ionen-Modus aufgrund der hohen Protonenaffinität von Alkaloiden verwendet, die sie verursacht leicht durch Protonierung ionisiert werden. Die Analyse im Negativionen-Modus kann für die erfolgreiche Erkennung von -Kohlenwasserstoff verwendet werdenons (wie O 2 -Addukte) 21, explosive Materialien 27 und organischen Säuren, wie Artesunat in malarial Medikamente. 28 Aufgrund der Ionisationsverfahren von Protonentransfer und die Unfähigkeit , mehrfach geladenen Ionen, direkte Analyse in Echtzeit-Hochauflösungsmassen herzustellen Spektrometrie beschränkt sich hauptsächlich auf die Analyse von kleinen Molekülen bis zu 3.000 amu.

Außer Ionisierungsmodus ist die Temperatur der Ionenquelle ein wichtiger Parameter, und die geeignete Temperatur hängt weitgehend von der analysierten Probe. Zum Beispiel ist es wichtig, niedrigere Temperaturen zu verwenden (~ 250 ° C) für die SPME-Faser Analyse Zerstörung des Beschichtungsmaterials auf der Faser zu verhindern, während höhere Temperaturen (~ 500 ° C) soll für die Aminosäureanalyse zur Desorption verwendet werden, und nachfolgende Ionisierung. Hier Pflanzenmaterial Analysen wurden bei 350 ° C durchgeführt, da dies für die Ionisierung von Alkaloiden und anderen Verbindungen von Interesse ermöglicht, mitout verursacht Pyrolyse von Verbindungen in der Pflanzenmatrix.

Eine direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Analyse Massenspektrometrie ermöglicht nicht nur die Identifizierung der psychoaktiven Bestandteile des Pflanzenmaterials auf Basis von genauen Massen, elementare Zusammensetzung Bestimmung und Isotopenanpassung, aber es produziert auch einzigartige chemische Fingerabdrücke, die für die Identifizierung von Arten genutzt werden können unter Verwendung von multivariate statistische Analyse mit hoch reproduzierbare Ergebnisse, auch bei kleineren Datenmengen. Multivariate statistische Analyse wurde in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie-Daten zu einer Vielzahl von direkten Analyse angewandt, einschließlich der Bestandteile von Holz, puparial Hüllen, Samen, Blattmaterial und Biodiesel fuelstocks, die Vielseitigkeit und die Reproduzierbarkeit des Verfahrens zur Schau stellt. 22-26 die Hochdurchsatz - Funktionen der direkten Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie ermöglichen die Erfassung von großen Mengen an Masse spectral Daten in einer kurzen Zeitperiode, und die große Anzahl der Replikate für die statistische Analyse benötigt werden, unter Verwendung dieses Verfahrens leicht erworben. Die direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie Massenspektralanalyse Datensatz von Datura und Kratom wurde von mehr als 100 Einzelspektren besteht, die mit weniger als einer Stunde der Gesamtzeitaufwand gesammelt wurden. Zu erhalten, die gleiche Anzahl von Spektren GC-MS mit einer Ofentemperaturprogramm von 30 Minuten dauern würde, etwa 50 Stunden, ohne Berücksichtigung der zugesetzten Zeit für die Probenvorbereitungsschritte, wie Extraktion oder Derivatisierung verwendet wird.

Hauptkomponentenanalyse können verwendet werden, um Substanzen zu markieren Variationen zwischen den Sätzen von Pflanzen basierend auf dem Vorhandensein und der Intensität des ausgewählten Merkmals Massen. Die statistische Analyse Verarbeitung liefert Artbestimmung sowie sorten Informationen. Andere Methoden der statistischen Analyse, wie hierarchischen Clustering-Analyse (HCA), kann auch sein,ohne die a-priori-Auswahl von Merkmals Massen angewandt. Die Ergebnisse der HCA von umfassenden chemischen Fingerabdrücke zeigen , dass ohne Aufsicht statistische Analyse erfolgreich für Artbestimmung von pflanzlichen Drogen von Missbrauch angewendet werden. 25

Die Art der Diskriminierung von forensischer botanischen Material durch direkte Analyse in Echtzeit hochauflösende Massenspektrometrie wurde mit der Identifizierung von Psychopharmaka und andere Biomarker in der Soft-Ionisationsmassenspektren demonstriert, und die Anwendung der multivariaten statistischen Analyse. Die Anwendung von zwei Arten von statistischen Analysen zeigten nicht nur, dass die Klasse eines pflanzlicher Basis Missbrauchsdroge identifiziert werden kann, sondern auch, dass die Vielfalt und Art des Arzneimittels kann durch die direkte Analyse beobachtet, basierend auf den einzigartigen chemischen Fingerabdrücken bestimmt werden, in Echtzeit-hochauflösender Massenspektrometrie. Das hier vorgestellte Verfahren ermöglicht die schnelle Hochdurchsatz-Identifizierung mind einserweiternden Substanzen in einer Weise, die Herausforderungen begegnet bei herkömmlichen analytischen Methoden umgeht, und bietet forensische Laboratorien mit einem Mittel zur Charakterisierung und psychoPflanzenMaterial ohne Zeit zu identifizieren und intensive Methodenentwicklung Ressourcen. Dieses Protokoll kann auf Arten Differenzierung einer Vielzahl von anderen von Pflanzen abgeleiteten Materialien erweitert werden. 22-26

Acknowledgments

Die Autoren danken eine Universität in Albany-SUNY Presidential Initiatives Fund für Wissenschaft und Forschung in der Forensik und Cyber ​​Security Zuschuss anerkennen, eine National Science Foundation Grant (Zuschuss # 1310350) und National Institute of Justice Zuschuss (Zuschuss # 2015-DN-BX- K057) in den RAM. Wir erkennen auch Justine E. Giffen für die Fotos der Pflanzenmaterialien nehmen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL USA, Inc.
DART-SVP Ion Source IonSense, Inc. DART-SVP
Linear Rail System IonSense, Inc. HW-10029
Hole puncher (6 mm) Swingline A7074005
One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner Cole-Palmer EQ-08849-00
1.5 ml Eppendorf Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-682-550
AccuSpin Micro 17R Centrifuge Fisher Scientific 13-100676
#9 Stainless Steel Razor blade Stanley 11-515
Dip-it Tip Holder IonSense, Inc. SCT-70003
Dip-it Tips IonSense, Inc. DPT-110
Melting Point Capillary Krackeler Scientific 1-9530-3
Polyethylene glycol (600) Sigma Aldrich 81180
Rifat Kratom Live Plant World Seed Supply Kratom Collection LIVEKRATOMPLANT
Bali Kratom Dried Leaf The Kratom King OZKRAPCOM
Bali Kratom Powder The Kratom King OZKRAPCOMPOW
Datura stramonium seeds Horizon Herbs LLC PDATUJ
Datura inoxia seeds Horizon Herbs LLC PDATUM
Datura ferox seeds Georgia Vines 255/737
Ethanol, anhydrous Krackeler Scientific 1328-E402-4L
Mass Mountaineer Spectral Analysis Software mass-spec-software.com MM-20030-PCA-DVD
TSSPro3 Data Processing/Data Reduction Software Shrader Labs
Cluster 3.0 http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm Open Source Software
Java Treeview http://jtreeview.sourceforge.net/ Open Source Software

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References

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Chemie Ausgabe 116 die direkte Analyse in Echtzeit-Massenspektrometrie forensischen Chemie Drogen Identifizierung pflanzlicher Basis Drogen Kratom, Jimsonweed Analyse Massenspektrometrie Umgebungs Ionisierung Artbestimmung mit hohem Durchsatz
Schnelle Hochdurchsatz-Spezies Identifizierung von Pflanzen von Material mit Direktanalyse in Echtzeit hochauflösender Massenspektrometrie
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Lesiak, A. D., Musah, R. A. Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (116), e54197, doi:10.3791/54197 (2016).

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