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Neuroscience

Charakterisieren Multiskalige Mechanische Eigenschaften von Gehirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Schlag Einrückungen und Rheometrie

doi: 10.3791/54201 Published: September 6, 2016

Abstract

Zu entwerfen und Ingenieur Materialien durch die Eigenschaften des Gehirns inspiriert, ob für mechanische simulants oder für die Geweberegeneration Studien sich das Hirngewebe gut sein müssen an verschiedenen Längen- und Zeitskalen charakterisiert. Wie viele biologische Gewebe weist Hirngewebe eine komplexe, hierarchische Struktur. Jedoch im Gegensatz zu den meisten anderen Geweben ist Gehirn sehr geringe mechanische Steifigkeit, mit Young'schen Elastizitätsmoduln E in der Größenordnung von 100 s von Pa. Diese geringe Steifigkeit Herausforderungen experimentellen Charakterisierung von Schlüssel mechanischen Eigenschaften darstellen kann. Hier zeigen wir einige mechanische Charakterisierung Techniken, die angepasst wurden, um die elastischen und viskoelastischen Eigenschaften von hydriertem, konformen biologischen Materialien wie Hirngewebe zu messen, auf unterschiedlichen Längenskalen und Beladungsraten. Am mikroskaligen führen wir Kriechen-Compliance und Kraft Entspannung Experimente mit Rasterkraftmikroskop-fähigen Einzug. An den MesosCale, führen wir Experimente Auswirkungen Vertiefung ein Pendel-basierte instrumentierten Eindringkörper verwendet wird. Am makroskaligen führen wir Parallelplattenrheometrie die frequenzabhängigen Scherelastizitätsmodul zu quantifizieren. Wir diskutieren auch die Herausforderungen und Einschränkungen bei den einzelnen Methoden verbunden. Zusammen ermöglichen diese Techniken eine gründliche mechanische Charakterisierung von Hirngewebe, das besser genutzt werden kann, um die Struktur des Gehirns zu verstehen und bio-inspirierte Materialien zu konstruieren.

Introduction

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Die meisten Weichteile biologische Organe umfassen, sind mechanisch und strukturell komplexen, von geringer Steifigkeit im Vergleich zu mineralisiertem Knochen oder technischen Materialien und weisen eine nichtlineare und zeitabhängige Verformung. Im Vergleich zu anderen Geweben im Körper, ist bemerkenswert Hirngewebe kompatibel ist , mit Elastizitätsmoduln E in der Größenordnung von 100 s von 1 Pa. Das Hirngewebe zeigt strukturelle Heterogenität mit deutlichen und ineinandergreifenden grauen und weißen Substanz Regionen, die auch funktional unterscheiden. Verständnis Hirngewebe Mechanik wird in der Konstruktion von Materialien und Rechenmodelle unterstützen die Antwort des Gehirns während Verletzungen zu imitieren, Vorhersage mechanischer Beschädigung zu erleichtern, und das Engineering von Schutzstrategien ermöglichen. Zusätzlich können solche Informationen verwendet werden Entwurfsziele für die Geweberegeneration zu betrachten und zu einer besseren strukturellen Veränderungen im Hirngewebe zu verstehen, die mit Erkrankungen wie Multiple Sklerose und Autismus assoziiert sind. Here, wir beschreiben und verschiedene experimentelle Ansätze zeigen, dass die viskoelastischen Eigenschaften von mechanisch nachgiebigen Gewebe einschließlich Hirngewebe, auf der Mikro-, Meso- und Makroskalen zur Verfügung stehen zu charakterisieren.

Am mikroskaligen führten wir Kriechen-Compliance und Relaxationsexperimente Kraft mit Rasterkraftmikroskop (AFM) -fähigen Einzug. Typischerweise wird AFM-fähige Vertiefung verwendet , um den Elastizitätsmodul (oder momentane Steifigkeit) zur Abschätzung einer Probe 2-4. Jedoch kann das gleiche Instrument auch zur Messung mikroskaligen viskoelastischen (zeit- oder geschwindigkeitsabhängig) Eigenschaften 5-10 verwendet werden. Das Prinzip dieser Experimente, die in 1 gezeigt, ist eine AFM - auskragenden Sonde in das Gehirngewebe einrücken, eine festgelegte Größe der Kraft oder Eindringtiefe, zu pflegen und die entsprechenden Änderungen in Eindringtiefe und Kraft messen, die jeweils über die Zeit. Mit Hilfe dieser Daten können wir die Kriechen comp berechnenliance J C und Entspannungsmodul G R.

Am mesoskaliger führten wir Einfluss Einzug Experimente in Flüssigkeit getauchten Bedingungen, die die Gewebestruktur und Hydratationsniveaus, mit einem Pendel-basierten instrumentierten Nanoindentor halten. Der Versuchsaufbau ist in Figur 2 veranschaulicht. Da das Pendel mit dem Gewebe in Kontakt tritt, Sondenverdrängung als Funktion der Zeit aufgezeichnet wird , bis die oszillierende Pendel im Gewebe zur Ruhe kommt. Aus der resultierenden gedämpften harmonischen Schwingungsbewegung der Sonde kann man die maximale Eindringtiefe x max, Energiedissipation Kapazität K und Verlustqualitätsfaktor Q des Gewebes 11,12 (die der Rate der Energieabgabe bezieht) berechnen.

Im makroskopischen verwendeten wir eine parallele Platte-Rheometer der frequenzabhängigen Scherelastizitätsmoduln zu quantifizieren,der Speichermodul G bezeichnet 'und Verlustmodul G "des Gewebes. In dieser Art von Rheometrie wenden wir einen harmonischen Winkelspannung (und Scherbeanspruchung entspricht) mit bekannten Amplituden und Frequenzen und messen die Reaktions - Drehmoment (und eine entsprechende Scherspannung) , wie in Abbildung 3 dargestellt. aus der resultierenden Amplitude und Phasenverzögerung des gemessenen Drehmoments und geometrischen Variablen des Systems, können wir G 'und G "bei angelegten Frequenzen von Interesse 13,14 berechnen.

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Protocol

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Ethik-Statement: Alle Versuchsprotokolle, die vom Animal Research Committee von Boston Kinderkrankenhaus und im Einklang mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt.

1. Maus Gehirngewebe Acquisition Verfahren (für AFM-fähigen Vertiefung und Auswirkungen Vertiefung)

  1. Bereiten Sie eine Ketamin / Xylazin-Mischung die Mäuse zu betäuben. Kombinieren 5 ml Ketamin (500 mg / ml), 1 ml Xylazin (20 mg / ml) und 7 ml einer 0,9% igen Kochsalzlösung.
  2. Injizieren Maus (Rasse: TSC1; Syn-Cre; PLP-eGFP; Alter: p21, Geschlecht: männlich oder weiblich) mit 7 ul pro Gramm Körpergewicht der Ketamin / Xylazin Lösung.
  3. Sobald die Maus vollständig betäubt, wie durch einen Mangel an Reaktion auf Zehen und Schwanz kneift demonstriert, einschläfern die Maus durch Enthauptung große Dissektion Schere.
  4. Entfernen Sie den Schädel durch die Mitte kleiner Dissektion Schere Abholzen. Ab dem Cerebellum, remOve Stücke des Schädels unter Verwendung einer gebogenen Pinzette. Nach dem Schädel entfernt wird, Extrahieren des Gehirns durch einen flachen Spatel mit dem Gehirn anzuheben, bei dem Cerebellum ausgehend und das Gehirn auf einer Petrischale legen. Entfernen Sie das Cerebellum aus dem Gehirn mit einer Rasierklinge.
  5. Bei Verwendung gehen eine ganze Gehirn für Schlag Indentationstests auf frischem Gewebe, Transfer Gehirn in einen Rundbodenrohr mit CO 2 -unabhängigen Nährmedium für adulte neurale Gewebe auf Eis und fahren Sie mit Abschnitt 4. Ansonsten 1.6 für das Schneiden von Verfahren zu Schritt.
  6. Stellen Sie die Vibratom Einstellungen auf eine Geschwindigkeit von 0,7 mm / sec, einer Schwingungsfrequenz von 70 Hz und einer Schichtdicke von 350 um. Umgeben die Vibratom Schale mit Eis. Platzieren Sie einen Klecks Sekundenkleber auf die Vibratom Platte und montieren Gehirn, so dass koronalen Scheiben geschnitten werden kann, mit dem Gehirn zuerst zu schneiden durch die dorsale Seite orientiert.
  7. Füllen Sie das Vibratom Schale mit genug Dulbecco phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) nur das Gehirn versenken. Erziehendas Gericht auf der Vibratom so dass Klinge in der DPBS gerade eingetaucht ist.
  8. Drücken Sie beginnen Abschnitte schneiden koronalen Hirn 350 um dick zu beginnen.
  9. Mit Pinseln Schädigung des Gewebes zu vermeiden, übertragen Sie die Hirnschnitten aus dem Vibratom DPBS Bad und in einem Rundhalsrohr mit CO 2 -unabhängigen Nährmedium für adulte neurale Gewebe auf Eis und führen Messungen an frischem Gewebe innerhalb von 48 Stunden. Um AFM-fähige Vertiefung Experimente beginnen, gehen Sie zu Abschnitt 3.

2. Schwein Hirngewebe Acquisition Verfahren (für Rheologie)

  1. Besorgen Sie sich eine sagittal geschnittenen Schweine halben Gehirn innerhalb von ~ 1 Stunde des Opfers von einem lokalen Metzger. Legen Sie die Hälfte des Gehirns in CO 2 -unabhängigen Nährmedium für erwachsene Nervengewebe, und speichern Sie auf dem Eis.
  2. Verwenden einer Rasierklinge oder einem Skalpell eine ca. 5 mm dicke koronale Gehirn in Scheiben schneiden und lagern in CO 2 -unabhängigen Nährmedium für erwachsene Nervengewebe zu machen. Stellen Sie sicher, dass die Scheibe surface ist so flach wie möglich. Verwenden Sie vorsichtig seitliche Bewegungen mit Rasiermesser / Skalpell während des Schneidens.
  3. Shop Schwein Hirngewebe in CO 2 -unabhängigen Nährmedium für adulte neurale Gewebe auf Eis und rheometry Messungen (Abschnitt 5) auf frischem Gewebe innerhalb von 48 Stunden durchzuführen.

3. Atomkraftmikroskop-fähigen Einrückungen

  1. Bereiten Sie 60 mm Durchmesser Petri (P60) Gerichte mit Muschel abgeleitet bioadhäsiven gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    1. Bereiten Sie eine Bestandsaufnahme der neutralen Pufferlösung von 0,1 M Natriumbicarbonat in sterilem Wasser mit einem optimalen pH-Wert von 8,0 aus. Filter-sterilisieren (0,2 Mikron) das Natrium-Bikarbonat-Puffer und lagern bei 4 ° C.
    2. In einer laminaren Strömungshaube, eine Lösung von 6,25% mussel abgeleitetes bioadhäsiven und 3,125% NaOH in dem Puffer Natriumbicarbonat mischen.
    3. Pipette 100 ul der Bio-Klebelösung von 3.1.2 auf eine 60 mm-Durchmesser Petri (P60) Schale und die Verwendung Pipettenspitze Sol zu verbreitenUTION in einen 3-5 cm Durchmesser-Kreis.
    4. Lassen Sie P60 in Laminarströmungsabzug offenen Speisen und lassen Lösung trocken (~ 30 min). Geschirr spülen 1x mit PBS und 2x mit sterilem Wasser. Lassen Sie Gerichte der Luft trocknen in Laminar-Flow-Haube und lagern in einem verschlossenen Plastikbeutel bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
  2. Kalibrieren Sie die AFM und Set-up Gehirnprobe in der AFM.
    Hinweis: Folgen Sie AFM Kalibrieranweisungen gemäß den Hersteller.
    1. eine AFM-Sonde mit einer Nennfederkonstante von 0,03 N / m und 20 & mgr; m Durchmesser Borosilikat Wulst in den Sondenhalter vorsichtig laden.
    2. Kalibrieren Sie die Federkonstante und inverse optische Hebel Empfindlichkeit (InvOLS) des AFM Cantilever die thermische tune Methode 15,16 verwenden.
      HINWEIS: Wenn die Federkonstante für eine AFM-Sonde berechnet wird, es sollte bei wiederholter Anwendung konstant bleiben. Allerdings müssen die Ausleger InvOLS jedes Mal neu kalibriert werden der Laser mit dem Cantilever neu ausgerichtet wird. Zusätzlich Kalibrierungsollte steifer als der Ausleger, wie beispielsweise Polystyrol gegenüber einem Substrat mehrere Grßenordnung durchgeführt werden.
    3. Schalten Sie auf der Bühne montierten Heizung und Solltemperatur auf 37 ° C.
    4. Montieren Sie den Hirnschnitt auf die P60 Gerichte in Abschnitt vorbereitet 3.1.
      1. Gießen Sie vorsichtig mit einem 350 & mgr; m dicken Hirnschnitten, sowie die CO 2 -unabhängigen Medium aus dem Rundkolben in eine P60 Schale mit dem Muschel abgeleitet bioadhäsiven beschichtet.
      2. Durch die sanft die P60 Schüssel kippen, positionieren Sie den Hirnschnitt in der Mitte der Schale. Falls erforderlich, Pipette langsam Medium von einem manuellen Pipettierer ein Hirnschnitt zu entfalten, die auf sich selbst gefaltet hat oder besser in der Lage, das Gehirn in Scheiben schneiden in der Mitte der Schale.
      3. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Medien einen P1000 Pipettierer verwenden (ohne Vakuum nicht verwenden).
      4. Setzen Sie Deckel auf P60 Teller und lassen das Gehirn Scheibe für 20 Minuten einzuhalten.
    5. Entfernen Sie die AFM-Kopf, legen Sie den Hirnschnitt in der P60 montiertGericht auf der AFM - Bühne, und fügen Sie ~ 2 ml CO 2 -unabhängigen Medium vorgewärmt.
    6. Sorgfältig fügen Spannung einen Tropfen Medium auf die AFM-Sonde es bricht aufgrund schützen Oberfläche, wenn es in die Medien umgebenden Hirnschnitt verringert wird.
    7. Positionieren Sie die AFM-Kopf auf die Bühne und beginnen, den Kopf gesenkt, bis es in die Medien eingetaucht ist.
    8. Mit Hilfe der Draufsicht CCD-Kamera, die Position des Lasers auf dem Ausleger.
      HINWEIS: Die Ausrichtung des Lasers auf dem Cantilever wird leicht aufgrund des Unterschieds im Brechungsindex von Luft und Medium gewechselt.
    9. Warten Sie 5 Minuten für die Ausleger einzustellen in einer warmen Flüssigkeit eingetaucht ist, dann setzen Sie die Spiegelausrichtung auf eine freie Ablenkung von 0 V.
    10. Führen Sie einen thermischen Spektrum auf der AFM - Sonde gemäß den Anweisungen des Herstellers 16. Verwenden Sie den Sitz des ersten thermischen Spitzen neu zu berechnen die InvOLS der AFM-Sonde in den Medien.
    11. Mit dem optischen Mikroskop,Bewegen Sie den Probentisch, so dass die Hirnregion von Interesse unter der AFM-Sonde.
      HINWEIS: Das Corpus callosum dunkel erscheinen wird, wie es undurchsichtiger als die umgebende graue Substanz ist. Die Rinde ist besser als das Corpus callosum.
    12. Setzen Sie die Spiegelausrichtung auf eine freie Ablenkung von 0 V.
    13. Auf der Summe und Ablenkung Meter in der AFM-Software, klicken Sie auf "Engage", um die AFM Kopf engagieren.
    14. Mit der Position Einstellrad auf der AFM-Kopf, senken Sie den Kopf, bis der Kontakt zwischen dem Cantilever und Probe hergestellt wird.
  3. (Optional) Falls gewünscht, messen den Elastizitätsmodul der Probe, wie zuvor beschrieben 4,17,18.
  4. Führen Kriechcompliance Experimente.
    1. Konstruieren Sie eine aufgebrachte Kraft Funktion im Funktionseditor der Software. Die Kraft-Funktion besteht aus einer 0,1 sec Rampe auf einen Sollwert von 5 nN und halten Sie ihn für 20 Sekunden, gefolgt von einer 1 sec auf eine angelegte Kraft von 0 nN nach unten Rampe.
      1. Auf dem Einrücken Master Panel unter dem Einkerbungsverfahren, wählen Sie "Load" für Indenter-Modus; "N" für Einheiten; und "Funktionseditor" für Indenter Funktion.
      2. Im Funktionseditor, auf dem Segment Parms-Panel, erstellen Sie eine aufgebrachte Kraft Funktion Segment, das bei 0 nN beginnt, endet bei 5 nN, mit einer Zeit von 0,1 Sekunden. Klicken Sie auf "Einfügen ->".
      3. Für das nächste Segment auf 5 nN, Ende bis 5 nN, und die Zeit bis 20 Sekunden starten. Klicken Sie auf "Einfügen ->."
      4. Für das letzte Segment auf 5 nN, Ende auf 0 nN, und die Zeit bis 1 s starten. Klicken Sie auf "Zeichnen" und die Funktion Editor-Fenster zu schließen.
    2. An der Kraft-Vorsprung des Master-Panel, überprüfen Sie "Indenter Rampe nach Trigger" und die ausgeübte Kraft Funktion einstellen, nach Erreichen eines Triggerpunkt von 0,1 V auslösen
    3. Klicken Sie auf "Einzelkraft" auf der Unterseite des Kraft Tab des Master-Panel, das die konstruierten angelegten Kraftfunktion für Kriechcompliance auslösen.
    4. Nach demEinzelkraft Vertiefung beendet ist, heben Sie den AFM-Kopf, so dass er aus dem Kontakt mit der Probe ist, und dann den Kopf wieder einrasten und wieder Null frei Ablenkung.
    5. Positionieren Sie die Probenbühne einen neuen Bereich von Interesse zu suchen, und die AFM-Kopf senken Kontakt zu machen. HINWEIS: Die AFM-Kopf muss von der Probenoberfläche zurückgezogen werden, wenn der Probentisch bewegt wird. Geschieht dies nicht, kann es zu Schäden an den empfindlichen AFM Cantilever führen.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.3-3.4.5, bis die gewünschte Menge an Daten gesammelt wurden.
  5. Führen Kraft Relaxationsexperimente.
    1. Konstruieren Sie eine angelegte Vertiefung Funktion im Funktionseditor der Software. Die Vertiefung Funktion besteht aus einer 0,1 sec Rampe auf einen Sollwert von 3 um und halten Sie ihn für 20 Sekunden, gefolgt von einer 1 sec zu einer Eindringtiefe von 0 & mgr; m Rampe ab.
      1. Auf dem Einrücken Master Panel unter dem Einkerbungsverfahren, wählen Sie "Einrücken" für Indenter-Modus; "M" für Einheiten; und "; Funktionseditor "für Indenter Funktion.
      2. Im Funktionseditor, auf dem Segment Parms-Panel, erstellen Sie eine aufgebrachte Kraft Funktion Segment, das bei 0 & mgr; m beginnt, endet bei 3 & mgr; m, mit einer Zeit von 0,1 Sekunden. Klicken Sie auf "Einfügen ->".
      3. Für das nächste Segment, auf 3 & mgr; m, Ende bis 3 um, und die Zeit bis 20 sec starten. Klicken Sie auf "Einfügen ->."
      4. Für das letzte Segment auf 3 & mgr; m, Ende auf 0 & mgr; m, und die Zeit bis 1 sec starten. Klicken Sie auf "Zeichnen" und die Funktion Editor-Fenster zu schließen.
    2. An der Kraft-Vorsprung des Master-Panel, überprüfen Sie "Indenter Rampe nach Trigger" und die ausgeübte Kraft Funktion einstellen, nach Erreichen eines Triggerpunkt von 0,1 V auslösen
    3. Klicken Sie auf "Einzelkraft" auf der Unterseite des Kraft Tab des Master-Panel, das die konstruierten angelegten Einbuchtung Funktion für Kraft Entspannung auslösen.
    4. Nachdem die einzige Kraft Einzug beendet ist, heben Sie den Kopf AFM, so dass esaus dem Kontakt mit der Probe und anschließend wieder einzurücken den Kopf und Wiedernulldurchbiegung.
    5. Positionieren Sie die Bühne einen neuen Bereich von Interesse zu suchen, und den Kopf senken, um Kontakt herzustellen.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 5,3-5,5, bis die gewünschte Menge an Daten gesammelt wurden.
  6. Beschließen Experimente und clean-up.
    1. Nach Experimenten Abschluss der AFM Kopf zu heben und es aus der Probe zu entfernen.
    2. Verwenden Sie ein Labor Gewebe vorsichtig überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, ohne den Ausleger zu berühren.
    3. Reinigen Sie den AFM Cantileverhalters eine geringe Menge an Ethanol. Sie nicht die empfindliche Elektronik auf dem Cantileverhalters zu Ethanol aus. Entfernen Sie die AFM-Cantilever und in einen Vorratsbehälter.
    4. Entsorgen Sie das Gehirn Gewebeprobe durch geeignete Biosicherheit Protokolle folgen.
  7. Mit MATLAB Kriechcompliance berechnen und Entspannung moduli zwingen Eindringkörpergeometrie verwenden, nach der Lösung abgeleitet von Lee und Radok 1960 19.
    1. Berechnen Kraft F und Eindringtiefe Gleichung 1 von Daten auf der Cantilever - Position z, Ablenkung d, und die Federkonstante k c

      Gleichung 1 und Gleichung 1 .
    2. Suchen Sie den Kontaktpunkt entlang der Eindringtiefen - Kurve des Algorithmus in Lin beschriebenen et al. 20.
    3. Definieren Sie ein Fenster von Interesse für die Datenanalyse. Das Fenster von Interesse ist die Region , in der entweder Kraft (für Kriechcompliance) oder Eindringtiefe (für Kraft Entspannung) auf einem Sollwert gehalten (dh Region 3 wie in 1C, D gezeigt).
    4. Zur Einhaltung Experimente Kriechen, berechnen die experimentellen Kriechnachgiebigkeit Modulus, J c (t), in Reaktion auf einen Schritt Lastn 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      Gleichung 1 .
      wobei H (t) die Sprungfunktion Heaviside und R der Radius der sphärischen Sonde.
    5. Zur Kraft Relaxationsexperimente, berechnen die experimentelle Kraft Relaxationsmodul, G R (t), als Reaktion auf eine Tiefe Schritt Vertiefung Gleichung 1 :
      Gleichung 1 .

4. Auswirkungen Einrückungen

  1. Kalibrieren Sie den instrumentierten Nanoindentor und stellen Standardeinstellungen dynamische Auswirkungen Experimente auf hydratisierte Hirngewebe zu ermöglichen, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    1. Montieren Sie eine kugelförmige Sonde, indem sie auf das Pendel Gleiten mit einer Pinzette.
    2. Klebe ein Quarzglasprobe auf die Proben Post, die in die Translationseingeschraubt istStufe.
    3. Gehen Sie auf die Kalibrierungsmenü und wählen Sie "Liquid Cell." Folgen Sie den Anweisungen des Software-Kontakt mit dem Quarzglas-Probe zu machen.
    4. Wählen Sie "Normal" für den Indenter Typ und den Standardwert von 0,05 mN für die Indenter laden. Klicken Sie auf "Weiter", um die Kalibrierung für die normale Eindringkörper Konfiguration durchführen.
    5. Bewegen Sie den Probentisch zurück von mindestens 5 mm. Montieren Sie den Hebelarm, der die Sonde in die Flüssigkeit Zelle abgesenkt werden kann, und wiederholen Sie die Flüssigkeit Zellenkalibrierung in der neuen Konfiguration von "Liquid Cell" für den Indenter Typ auswählen. Klicken Sie auf "Weiter", um die Flüssigkeitszelle Kalibrierungsfaktor erhalten.
    6. Aktivieren Sie die Flüssigkeitszelle Software-Option von dem Experiment Menü gehen und die Auswahl von "Spezielle Optionen." Verwenden Sie die neueste Kalibrierungswert.
    7. Erhöhen Sie die Kondensatorplattenabstand, da dies zu einer größeren maximal messbare Tiefe führen wird, die notwendig ist, wenn hig Prüfunghly-konformen Materialien.
      1. Unter dem System-Menü wählen Sie "Nicht kopiergeschützte Einstellungen" und "Maschinenparameter", um die Pendeltest Lastrate ändern, Nulllast-Rate und Standby bis 0,5 mN / sec Offset Rampe, 0,1 mN / s und 3 V sind.
      2. Mit einem Schraubenschlüssel, drehen Sie die drei Muttern, die den Kondensatorplattenabstand im Uhrzeigersinn in kleinen Schritten zu steuern.
      3. Nach jeder vollen Umdrehung im Uhrzeigersinn, wählen Sie "Brücken-Box-Einstellung" unter dem Menü Wartung und erhalten Test ein gutes Pendel, das die Gegenausgleichsgewicht weg von dem Pendel bewegen erfordert.
      4. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.7.2-4.1.7.3, bis die ungefähre Tiefe Kalibrierung einen Wert von 70.000 nm / V oder höher liest.
    8. Positionieren Sie einen neuen Anschlag am unteren Rand des Pendels, das Ein- und Ausschalten über eine Stromversorgung umgeschaltet werden kann. Ziehen Sie die Original-Anschlag hinter dem Pendel sitzt ein potenzielles Hindernis der Pendelbewegung zu entfernen und ermöglichen höhereAufprallgeschwindigkeiten sowie höhere Eindringtiefen in den Anforderungen entsprechenden Proben.
    9. Lassen Sie das Gerät ein thermisches Gleichgewicht zu erreichen (ca. 1 Stunde).
    10. Während das Kabinett ausgleicht, zum Systemmenü zurück und "Nicht kopiergeschützte Einstellungen" und wählen Sie "Maschinen-Parameter." Stellen Sie die Tiefenkalibrierung (DCAL) Kontaktgeschwindigkeit bis 1 & mgr; m / sec, die primäre Vertiefung Kontaktgeschwindigkeit bis 3 & mgr; m / sec, und die extrem niedrigen Lastkontaktgeschwindigkeit auf 1 & mgr; m / sec.
    11. Unter dem Menü Kalibrierung, führen Sie eine Standardtiefe Kalibrierung in dieser neuen Konfiguration.
    12. Schalten Sie die Stromversorgung für den Elektromagneten und setzen Sie ihn auf 10 V. Zum Experiment Menü und wählen Sie "Impact" und "Adjust Impulse Verschiebung." Folgen Sie den Anweisungen der Software (automatische Ansagen), um die Schaukel Abstand des Pendels zu kalibrieren.
  2. Montieren Sie die Maus Hirngewebe in der Flüssigzelle.
    1. Nachdem das gesamte Gehirn aus ste Erntep 1.5, lagern Sie ihn sofort in CO 2 -unabhängigen Nährmedium für erwachsene Nervengewebe Medien auf Eis.
    2. Wenn die Auswirkungen Vertiefung Setup vollständig abgeschlossen ist, sorgfältig das Gehirn in eine Petrischale übertragen zusammen mit CO 2 -unabhängigen Medium. Schneiden Sie das Gehirn in 6 mm dicke Abschnitte mit ebenen Flächen auf beiden Seiten.
    3. Halten Sie die in Scheiben geschnittenen Gewebes auf die Aluminiumprobe Post mit einer dünnen Schicht aus Cyanacrylat-Klebstoff.
    4. Schieben Sie die Flüssigkeit Zelle über den zweiten O-Ring auf der Probe Post, und füllen Sie die Flüssigkeit Zelle mit 5 ml CO 2 -unabhängigen Medium vollständig in das Gewebe einzutauchen. Diese Probe Post wird dann auf die Translationsstufe innerhalb des instrumentierten Nanoindentor sorgfältig montiert.
  3. Messung der Auswirkungen Antwort des Hirngewebes.
    1. Entfernen Sie ggf. die sphärische Sonde und ersetzen Sie es mit der Sonde von Interesse, ohne den Hebelarm zu entfernen.
    2. Unter dem Menüsystem wählen Sie "Nicht kopiergeschützteEinstellungen "und" Maschinen-Parameter. "Ändern Sie die primäre Auswirkung Kontaktgeschwindigkeit bis 5 & mgr; m / sec.
    3. Mit der Probe Bades niedrig (-Z-Richtung) und weit entfernt von dem Pendel (+ x-Richtung), in der -x-Richtung bewegt, bis die Spitze am Hebelarm richtig über dem Bad befindet. Bewegen Sie sich in der + z-Richtung, bis die Spitze vollständig im Bad und vor der Probe eingetaucht ist.
    4. Mit dem Probentisch Kontrollfenster, stellen Kontakt sorgfältig und dann die Bühne weg von etwa 30 & mgr; m von der Probenoberfläche zurück.
    5. Unter dem Experiment Klicken Sie im Menü "Impact" einen Einfluss Experiment einzurichten. Wählen Sie eine bestimmte Impulsbelastung, die direkt auf die resultierende Aufprallgeschwindigkeit basierend auf der Schaukel Abstand Kalibrierung beziehen wird. Führen Sie das geplante Experiment.
    6. Wenn das Pendel zurück schwingt und die Probenoberfläche weiter zur Messebene zu bewegen, drehen Sie den unteren Anschlag Schalter aus.
    7. Beobachten Sie, wie das Pendel schwingt forward die Probe zu beeinflussen. Die Verschiebung der Sonde als Funktion der Zeit wird von der Software erfasst werden.
    8. Wenn das xyz Bühne Fenster erscheint, den Anschlag Schalter auf der Rückseite.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 3,4-3,8 so viele unterschiedliche Belastungen und Standorte zu testen, wie gebraucht.
  4. Analysieren der erfassten Verschiebung vs. Zeitverhalten des Pendels mit angepassten MATLAB - Skripte die maximale Eindringtiefe x max, Energiedissipation Kapazität K und Verlustqualitätsfaktor Q zu bestimmen. 11
    1. Gehen Sie auf die Menü Analyse und exportieren Sie die Daten in einer Textdatei.
    2. Nehmen der zeitlichen Ableitung des Verschiebungsgeschwindigkeitsprofil als Funktion der Zeit zu erhalten. Nullpunktverschiebung als Kontaktstelle x o1.
      HINWEIS: Die Aufprallgeschwindigkeit v in die maximale Geschwindigkeit unmittelbar vor dem Kontakt x max der Verformung entspricht , bei dem die Sonde.Geschwindigkeit zuerst auf Null abnimmt. x o2, die x r äquivalent ist, ist die Position , zu reinitiieren Kontakt mit dem verformten Probe in dem nächsten Zyklus erforderlich. Rückprallgeschwindigkeit v out ist die Geschwindigkeit , mit der Verschiebung x r.
    3. Definieren K (ohne Einheit) als die Energie , die von der Probe dissipiert normiert durch die Summe der wiedergewonnen und abgeführt Probenenergien während des ersten Schlagzyklus. Berechnen K auf der Basis der intrinsischen Eigenschaften des Pendels 21 (wie beispielsweise Drehsteifigkeit und Dämpfungskoeffizient), x o1, x max, x r, v in und v out.
      HINWEIS: Für weitere Informationen kann man die Arbeit von Kalcioglu konsultieren et al, 2011..
    4. Da Verschiebung als gedämpften harmonischen Schwingungsbewegung beschrieben werden kann, passt eine exponentielle Abklingfunktion auf die Maxima der disPlatzierung-Zeit-Kurve.
    5. Berechnen Q (ohne Einheit) als π durch die Anzahl der Zyklen multipliziert , die für die Schwingungsamplitude um einen Faktor von e zu verringern. Ein höherer Q - Wert bedeutet einen geringeren Energieverlustrate.

5. Rheologie

  1. Set-up und Kalibrieren des Rheometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    1. Initialisieren Sie das Rheometer durch das Gerät / Bedienfeld zu öffnen. Auf dem Bedienfeld Registerkarte klicken Sie auf "initialisieren."
    2. Montieren Sie den 25 mm-Durchmesser-Messplatte (PP25) und das thermische System.
    3. (Optional) Zur Reduzierung der Schlupf zwischen Rheometer Platten und dem Gewebe, ausschneiden Klebstoff Schleifpapier Scheiben, die die Form des oberen Rheometerplatte übereinstimmen und das Schleifpapier an der oberen und unteren Platte haften.
    4. Nehmen Sie Kontakt zwischen der oberen und der unteren Platte, indem Sie auf "Null gesetzt Lücke" auf dem Bedienfeld.
    5. Null, um die normalen Kraftaufnehmer durch clicking "Normalkraft zurück."
    6. Führen Sie einen Trägheitstest durch die Registerkarte Dienst auf dem Bedienfeld zu öffnen, klicken Sie auf "Messsystem" und dann auf "Trägheitstest". Notieren Sie sich die alte und neue Trägheit. Stellen Sie sicher, dass die Trägheit der Sonde innerhalb der zulässigen Grenze liegt, wie vom Hersteller angegeben.
  2. Legen Sie die Probe in Rheometer.
    1. Nachdem das Gewebe Ernte und einen koronalen Segment des Schweins Gehirn zu ~ 5 mm Dicke, speichern Sie es auf Eis in CO 2 -unabhängigen Medium schneiden.
    2. Legen Sie das Gehirn zwischen den beiden Platten. Entfernen Sie große Wassertropfen von der oberen und unteren Oberfläche der Probe ein Verrutschen zu verhindern, aber nicht austrocknen die Probe.
    3. Langsam die Messplatte absenken, bis die Platte mit der oberen Oberfläche des Gewebes und der gemessenen Normalkraft steht im Einklang mit 0,01 mN nach 5-10 min Ruhepause in Vollkontakt ist.
      1. In der Systemsteuerung, geben Sie nacheinander niedrigere Höhen in die Messposition und klicken Sie auf "Messposition", um langsam die Messplatte senken.
      2. Wenn innerhalb eines Millimeters des Kontaktes mit dem Gewebe, in Schritten von 0,1 mm der Messplatte absenken, bis die Platte mit der oberen Oberfläche des Gewebes vollständig in Kontakt steht. Stellen Sie sicher, dass die gemessene-Normalkraft konstant bei 0,01 mN nach 5-10 min Ruhepause.
      3. Notieren Sie sich die anfänglich gemessenen Normalkraft. Wiederholte Messungen sollten bei den gleichen Druckspannungen / Stämme eingenommen werden.
    4. Schneiden Sie die Probe mit einer Plastikklinge, wenn die Probe den Durchmesser der Platte überschreitet. Pipette ein kleines Volumen (~ 1-2 ml) von Medien an den Rändern der Probe um das Gewebe zu hydratisieren.
    5. (Optional) Senken Sie die thermische Haube. Auf dem Bedienfeld, stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C und klicken Sie auf "Set".
  3. Führen Sie eine Amplitudensweep des linearen viskoelastischen Bereich des Materials zu schaffen (dh die ScherStämme , bei denen G 'und G' 'konstant sind) mit Frequenzen von Interesse (zB 1 rad / sec).
    1. Wählen Sie "Datei / Neu". Unter dem Gel wählen Sie die Registerkarte "Amplitude Sweep: LVE-Bereich." Wählen Sie Fenster und klicken Sie auf "Messung. 1: Amplitude sweep" Klicken Sie doppelt auf das Schwingungsfeld. Geben Sie den Anfangs- und End - Stamm (beispielsweise 0,01 bis 105), die Frequenz (beispielsweise 1 rad / sec) und die Anzahl von Punkten pro Dekade (zB 6 Punkte / DEC). Wählen Sie "OK" und klicken Sie auf Start. "
    2. Wiederholen Sie diesen Vorgang für mehrere Scheiben mit wiederholten Versuchen Konsistenz des linearen elastischen Bereich zu gewährleisten. Die axiale Kompression der Probe sollte zwischen den Proben konstant bleiben.
  4. Führen Sie eine Frequenz - Sweep des Gewebes bei einer Dehnung im linearen viskoelastischen Bereich des Gewebes (zB 1% Dehnung) 22 und in einem Frequenzbereich von Interesse (zB 0,1 bis 100 rad / sec).
    1. Klicken "Datei / Neu" und unter dem Gel Registerkarte "Frequenz-Sweep" aus. Klicken Sie auf Fenster / Messung 1: Frequenz-Sweep. Klicken Sie doppelt auf das Schwingungsfeld. Geben Sie den Frequenzbereich (zB 0,1 bis 100 rad / s), die Belastung (zB 1% Dehnung) und die Anzahl der Punkte pro Dekade (zB 6 Punkte / Dezember). Wählen Sie "OK" und klicken Sie auf "Start", um die Frequenz-Sweep initiieren.
  5. Wiederholen Frequenz-Sweep (Schritt 5.4) in Duplikaten oder dreifacher Ausführung.
  6. Überprüfen Sie die Daten, die von dem Rheometer automatisch berechnet und exportiert werden: G 'und G "als Funktion der Frequenz (Frequenz - Sweep) oder Scherspannung (Amplitude Sweep) . HINWEIS: G' und G '' sind aus der Stichprobe des (maximal berechnet ) T '0 und Drehverschiebungswinkel (oder Ablenkwinkel) Reaktions - Drehmoment Amplitude Gleichung 1 Und PhasenverzögerungGleichung 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, der Reaktion der Probe auf die angelegte oszillierende Belastung (Abbildung 3):
    Gleichung 1
    Gleichung 1
    wobei R und h sind der Radius und der Höhe der Probe.

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Representative Results

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Abbildung 4 zeigt repräsentative Vertiefung und Kraft gegenüber der Zeit Antworten (4B, E) für Kriechcompliance und Relaxationsexperimente zwingen, da eine angelegte Kraft oder Eindringtiefe (4A, D) sind. Unter Verwendung dieser Daten und der Geometrie des Systems, die Kriechnachgiebigkeit J c (t) und Entspannungs Moduli Kraft G R (t) für unterschiedliche Regionen des Gehirns (4C, F) berechnet werden. Während frühere Studien haben einen Unterschied zwischen den Elastizitätsmoduln der verschiedenen Bereiche des Gehirns 23, die viskoelastischen Eigenschaften auf diese Weise für Maus - Gehirngewebe Scheiben zeigen inter Variation nicht innerhalb eines gegebenen Gewebeschnitt gemessen gezeigt.

Schlag Einbuchtung misst die mechanischen Eigenschaften des Gewebes bei hohen Raten von räumlich und zeitlich concentrated Laden. Die Ergebnisse dieser Experimente liefern Informationen darüber, wie das Gewebe mit einer Operation verbunden sind Energie in Reaktion auf traumatische Verletzungen oder vorsätzliche Verformung abführt. Die gedämpfte Schwingbewegung der Auswirkungen Vertiefung Sonde (2B) liefert Informationen , um die maximale Eindringtiefe x max (5A), Energieableitungskapazität K (5B) und Energiedissipationsrate Q (5C) des Gewebes zu berechnen. Eindringtiefe misst die Verformungswiderstand, die stark mit dem Gewebe des Elastizitätsmodul korreliert: steifer Gewebe für eine bestimmte Aufprallgeschwindigkeit und Aufprallenergie kleinere Eindringtiefen aufweisen. Energiedissipation Kapazität ist ein einheitsloses Maß für das Ausmaß, in dem das Gewebe während der ersten Schlagzyklus, um die Aufprallenergie abführt. Dissipation Qualitätsfaktor misst, wie viele Zyklen auftreten, bevor die Schwingungen von impact erheblich bedämpft - dies bezieht sich direkt auf die Rate der Energieabgabe, obwohl dies nicht in Zeiteinheiten ausgedrückt wird. Diese drei Stoßantwortparameter können bei unterschiedlichen Aufprallgeschwindigkeiten quantifiziert werden, was ein Mittel bereitstellt, um die geschwindigkeitsabhängigen Eigenschaften des Gewebes zu untersuchen.

6 zeigt makroskopischen G 'und G "für Frequenzen im Bereich von 0,1 rad / sec bis 50 rad / sec. Der Speichermodul ist fast eine Größenordnung größer als der Verlustmodul bei niedrigen Frequenzen. Um jedoch das Verhältnis zwischen den Speicher- und Verlustmoduln sinkt mit zunehmender Frequenz. Dies zeigt, dass elastische Eigenschaften, das Verhalten des Hirngewebes dominieren, da das Speichermodul beschreibt elastischen Eigenschaften und der Verlust beschreibt Modulus viskosen Verluste des Materials. bei einer ausreichend hohen Belastungsfrequenz, wird der Speicher- und Verlustmoduln gleichzusetzen, Angabe der Stelle, an derdas Material beginnt (dh viskosen Eigenschaften , das Verhalten der Probe dominieren) zu fließen. Für den Fall von Hirngewebe, wie dargestellt, gemessen hierin physikalischen Grenzen der Instrumente erlauben uns nicht, Materialeigenschaften bei höheren Frequenzen zu messen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Abbildung der AFM-fähigen Kriechcompliance und zwingen Relaxationsexperimente. (A) AFM-fähigen Vertiefung wird unter Verwendung eines flexiblen Ausleger mit einem kugelförmigen Wulst von Nano- bis Mikroradius zum freien Ende angebracht werden. (B) Während der Einbuchtung Cantileverauslenkung gemessen wird unter Verwendung eines Lasers das Ende des Auslegers reflektiert und auf eine Photodiode. (C) Kraft Relaxationsexperimente werden durch Einrücken der Ausleger auf einen konstanten angelegten Tiefe durchgeführt, während die Kraft Zerfall mit respect zu Zeit gemessen. (D) Creep Compliance - Maßnahmen die sich verändernde Eindringtiefe des Auslegers mit einer konstanten angelegten Kraft. (C) und (D) wurden in fünf Regionen (grüner Text) unterteilt: (1) Anfahren der AFM-Sonde zur Probenoberfläche, (2) Kontakt mit der Probe und Rampe bis zu einer Soll-Einzug / Kraft, (3) Aufrechterhaltung der Soll Vertiefung / Kraft, (4) Rampe nach unten und (5) Zurückziehen der AFM - Sonde von der Probenoberfläche. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Abbildung der Auswirkungen Vertiefung Experimenten. (A) Schematische Darstellung der Auswirkungen Vertiefung ist , welche die Fähigkeit Experimente in vollhydratisierte Bedingungen durchzuführen. (B) Repres entative Sondenverschiebungsprofil als Funktion der Zeit von einer Mausgehirn-Scheibe und die entsprechende Geschwindigkeitsprofil gesammelt. Key gemessene Verschiebung und berechneten Geschwindigkeitsparameter zur Energieableitung zu quantifizieren sind angezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Abbildung der parallelen Platte Rheometer Experimenten. (A) Schematische Darstellung der parallelen Platte Rheometerexperiment und Definitionen der angelegten oszillierenden Scherdehnung bezogen. (B) Repräsentative ausgeübten Verformung und daraus resultierende Spannung als Funktion der Zeit. Scherspeichermodul G 'und Verlustmodul G "werden über die Dehnungsamplitude berechnet54201 / 54201eq12.jpg "/>, Drehmoment Amplitude T '0, Phasenverzögerung Gleichung 1 , Sonde und Probe Radius R und Probenhöhe h. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Repräsentative Daten aus Kriechcompliance und zwingen Relaxationsexperimente. (A, B) Von den Rohdaten in Abbildung 1, eine Region von Interesse für Kriechcompliance definiert als die Zeit ist , wo Kraft ausgeübt konstant bleibt (A) während der Eindringtiefe gemessen wird (B). Der Einschub in (A) zeigt Daten aus einem erfolglosen Experiment , bei dem die AFM - Piezo war nicht in der Lagedie aufgebrachte Kraft und die Einfügung in (B) zeigt die entsprechende Einbuchtung Antwort zu erhalten, die zu den Daten eines erfolgreichen Versuchs qualitativ ähnlich ist , in (B) gezeigt. (C) mit Daten aus der aufgebrachten Kraft, gemessen Einbuchtung, und die Kenntnis der Geometrie der Sonde Kriechnachgiebigkeit J c (t) berechnet. (D, E) In Kraft Entspannung, Eindringtiefe konstant (D) gehalten, während Kraft gegen die Zeit gemessen wird (E). (F) Mit Hilfe dieser Daten Kraft Relaxationsmodul G R (t) berechnet werden. Kriechnachgiebigkeit und Kraftrelaxation Experimente können auf anatomisch unterschiedlichen Regionen des Gehirns, wie dem Corpus callosum (rot) und Kortex (blau) durchgeführt werden. Daten in (C, F) sind ein Durchschnitt der Messungen von n = 5 Mäuse. Bitte click hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Repräsentative Daten aus schlagzäh Vertiefung Experimenten. Maximale Eindringtiefe x max, Energieableitungskapazität K und Verlustgütefaktor Q von Maus - Hirngewebe werden aus rohen Verschiebung Profile berechnet bei unterschiedlichen Aufprallgeschwindigkeiten erhalten. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt (n = 18 Wiederholungsmessungen pro Punkt). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Repräsentative Daten aus rheometry Experimenten. Speicher G 'undVerlust G '' E - Module von koronalen Scheiben Schweine Gehirne. Die Menge tan & delta; ist definiert als Verhältnis von Verlustmodul zu Speicher berechnet. Die Daten werden dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 4 Wiederholungsmessungen pro Punkt). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Jede Technik, die in diesem Papier misst verschiedene Facetten der mechanischen Eigenschaften des Hirngewebes. Kriechnachgiebigkeit und Spannungsrelaxation Moduli sind ein Maß für zeitabhängige mechanische Eigenschaften. Die Speicher- und Verlustmodul repräsentieren geschwindigkeitsabhängigen mechanischen Eigenschaften. Schlag Einbuchtung misst auch geschwindigkeitsabhängigen mechanischen Eigenschaften, sondern im Rahmen der Energiedissipation. Wenn Gewebe mechanische Eigenschaften zu charakterisieren, sowohl AFM-fähige Vertiefung und Rheologie werden Methoden verwendet. AFM-fähigen Einbuchtung ist besonders nützlich , weil zusätzlich zu zeitabhängigen Materialeigenschaften Bereitstellung verschiedenen experimentellen Parameter verwendet werden können , Zell- und Gewebeelastizitätsmodul 4 und auch frequenzabhängige Eigenschaften 24, zu messen , wie zuvor beschrieben. Allerdings kann eine genaue Interpretation der Daten und das Design von Experimenten für konform, hydrierten Gewebe eine Herausforderung sein. Während rheometry Maßnahmen bulk ordnungsgemäßeBindungen des Gewebes, AFM-fähigen Vertiefung Sonden mikroskaligen Volumen relevant Mikro 'Zellen. Schlag Einbuchtung stellt ein Mittel spezifisch zu quantifizieren, wie ein Material verformt sich im Zusammenhang mit einer konzentrierten, dynamischen Stoßbelastung, die in Anwendungen wie dem Studium traumatische Hirnverletzung verursacht durch fokale Wirkung nützlich ist. Während die Ergebnisse von jeder Technik nicht direkt vergleichbar sind, folgen die Energieableitungseigenschaften über Auswirkungen Vertiefung gemessen, um die gleichen Trends wie der Scherverlustmodul über Rheologie gemessen, wie unten diskutiert.

In der AFM-fähigen Vertiefung des Hirngewebes hierin dargestellt, gemessen wir viskoelastischen Eigenschaften Kriechcompliance verwenden und Entspannung erzwingen. Wegen der kleinen Maßstab der AFM - Sonde kann diese Technik die mechanischen Eigenschaften von anatomisch unterschiedlichen Bereichen des Gehirns, wie der weißen und grauen Substanz Regionen des Corpus callosum und cortex messen jeweils (Fig. 4

Wir fanden , dass das viskoelastische Verhalten des Gehirns auf diese Weise gemessen Gewebe qualitativ ähnlich ist bisher berichteten Ergebnisse von Elkin & Morrison 26. Während die Größe der gemessenen Werte für Relaxationsmodul nicht übereinstimmen, ist dies in experimentellen Bedingungen der Differenz wahrscheinlich zurückzuführen. Elkin & Morrison verwenden, um eine 250 & mgr; m Durchmesser flach Stempel, im Vergleich zu unserem 20 & mgr; m Durchmesser Kugel. Zusätzlich Elkin & Morrison führen Messungen an Hirngewebe von Ratten, während wir Messungen an Hirngewebe von Mäusen erhalten wurden durchgeführt. Trotz dieser Unterschiede beide Techniken measheterogenen mechanischen Eigenschaften im Hirngewebe ured, oder genauer gesagt, dass die weiße Substanz des Corpus callosum einen niedrigeren Relaxationsmodul als die graue Substanz des Kortex in der koronalen Ebene zeigt.

Es ist wichtig zu beachten, daß, während wir die Kriechnachgiebigkeit und Kraftrelaxation Moduli in Reaktion auf ein angefordertes Schritt Last oder Schritt Einbuchtung berechnet jeweils die experimentell aufgebrachten Last und Einbuchtung sind nicht ideal (unverzögert) Stufenfunktionen. Lasten und Vertiefungen sind über kurze Zeiträume angelegt (<1 sec), und diese Belastungshistorien können die gemessenen Kriechen und Relaxation Antworten 7,25 beeinflussen. Genauer gesagt, ein angelegtes Schritt Vertiefung führt zu leichten Unterschätzung des Relaxationsmodul unter der Annahme, während ein angelegtes Schritt Belastung führt zu leichten Überschätzung des Compliance-Modul Kriechen unter der Annahme. Die Diskrepanzen zwischen den tatsächlichen und berechneten Elastizitätsmodul als die Rampenraten verringernder aufgebrachten Lasten und Einrückungen zu erhöhen.

Ein Schlüsselschritt Last Entspannung bei der Durchführung ist die Wahl der richtigen Größe der Kraft aufrechterhalten (dh der Sollwert auf die Photodiode Spannung entspricht , die direkt auf die angelegte Kraft bezieht). Die Sollkraft für Kriechcompliance muss so gewählt werden: (1) die Antwort ist groß genug, um leicht meßbaren Veränderungen in der Eindringtiefe zu erzeugen; und (2) klein genug, dass die Eindringtiefe erforderlich, um die Sollkraft zu halten nicht so groß werden, als außerhalb des Bereichs des AFM piezoelektrischen Aktor zu treiben, die die vertikale Position des AFM Cantilever-Basis moduliert. In dem vorgestellten Protokoll haben wir eine Sollkraft von 5 nN vorgeschlagen, die für unsere experimentellen Aufbau gut funktioniert. Wenn jedoch die AFM Piezo nicht in der Lage ist , diese Kraft aufgrund seiner begrenzten Bewegungsbereich zu halten (siehe Abb. 4A, Einschub), kann dieser Wert gesenkt werden. Diese experimentelle Frage ist nicht encountEred mit Kraft Relaxationsexperimente, die eine konstante, berechnete Eindringtiefe durch eine Rückkopplungsschleife aufrechtzuerhalten.

Im Gegensatz zur quasistatischen AFM-fähigen Einbuchtung am Nanonewton (nN) maßstäblich Kräfte und um angelegte Tiefen gilt Schlag Einbuchtung eine konzentrierte dynamische Belastung mN angelegten Kräfte und misst die Deformationsantwort Probe bis zu einer Tiefe nähert sich der Millimeterskala. Wir haben zuvor Auswirkungen Einrückung verwendet , um das Verhalten des Herzens und der Leber 9,11,12 und beobachteten eine ähnliche Abhängigkeit der Energiedissipation Reaktion auf Belastungsrate für Gewebe dieser Organe zu quantifizieren.

Auswirkungen Einbuchtung Sonde Radien im Bereich von um bis mm aufzunehmen. Darüber hinaus können Versuche Auswirkungen Einbuchtung in vollständig eingetaucht Umgebungen durchgeführt werden, die für die mechanische Charakterisierung von hydratisiertem Gewebe 21 ermöglicht. Wenn hochnachgiebige Proben zu testen, wie Hirngewebe, important Überlegungen müssen berücksichtigt werden. Erstens ist die maximale meßbare Tiefe in das Material etwa 1 mm, eine Begrenzung der Längenskalen des Instruments eingestellt selbst; weiter Pendelauslenkungsdetektor physikalisch durch die Kollision zwischen der elektromagnetischen Spule angeordnet an der Spitze des Pendels und der stationären Magnetplatte angehalten wird. Für Hirngewebe begrenzt dies die höchste Schlaggeschwindigkeit, die erfolgreich auf ca. 5 mm / sec angewendet werden kann. Man beachte , dass , während die Aufprallgeschwindigkeiten in der Größenordnung mm / s sind, sind die entsprechenden Dehnungsenergiedichten in der Größenordnung von kJ / m 3, die 11 ballistische Bedingungen, aufgrund der geringen Abmessungen des Sondenradius annähert. Zweitens kann es möglicherweise schwierig werden, für die das Gerät den Kontakt zwischen der Sonde und der Gewebeoberfläche zu erfassen. Da der Probentisch in Richtung der Sonde bewegt, Kontakt erfasst wird, wenn das Pendel durch das sich bewegende Probe zurückgeschoben wird. Jedoch für sehr compliant Proben kann das Pendel nicht detektierbar abgelenkt werden, während die Sonde in die Probe eindringt.

Um dieses Problem zu lösen, können wir die Geschwindigkeit erhöhen, mit der der Probentisch so bewegt, dass es eine größere Dynamik bei Kontakt sein, das Pendel zurück zu fahren. Die Probe sollte auch so flach wie möglich sein, um weitere Fehler zu minimieren in die richtige Anlaufstelle zu erkennen. Schließlich beachten, dass die Stoßbelastung nicht um eine echte Impulsbelastung ist, daß der elektromagnetische Strom am Pendel oben um eine Antriebskraft für die Penetration nach der ersten Aufprallereignis zu liefern fortgesetzt. Als Ergebnis kann bei den höheren Belastungsbedingungen auftreten, Kriechen vor allem, die Analyse der Energieableitungseigenschaften erschwert. Weitere Arbeiten zu diesem Verfahren kann die Zeitantwort von der Stoßantwort beinhalten entkoppeln, Temperaturregelung Einführung Studien bei Körpertemperatur zu ermöglichen, und auch die Visualisierung der Gewebeprobenfläche über eine microscope kompatibel mit der flüssigen Zelle.

Rheometrie misst die frequenzabhängigen mechanischen Eigenschaften von viskoelastischen Feststoffe auf der makroskaligen Ebene. Die Schermodule Komponenten, Lagerung G 'und Verlust G "kann in der Frequenz gemessen werden , typischerweise im Bereich Spanning 0,001-0,1 rad / sec bis 10-100 rad / sec, je nach Gerät, Sondengeometrie und Probe 13. Für eine genaue Messung eine Amplitudensweep, sollte vor einer Frequenz - Sweep durchgeführt werden , um den linearen elastischen Bereich des Materials zu bestimmen, das ist der Bereich des Stammes ist , für die G 'und G' bleiben '14,27 konstante , die die Scherbeanspruchung für die Frequenz gewählt. Sweep sollte so hoch wie möglich innerhalb des linearen viskoelastischen Grenze liegen (typischerweise 1-2% Scherbeanspruchung), so daß ein ausreichendes Drehmoment bei der Messung erreicht wird. Das Drehmoment während der Messungen immer in dem zulässigen Bereich vom Hersteller bereitgestellt werden sollte, um sicherzustellen, wieufficient Signal-Rausch-Verhältnis.

Zusätzlich verwendet die Rheometrie Sonde sollte so groß wie möglich sein , um das Drehmoment zu maximieren, aber mit der Probe vollständig 13 überlagern muß. Bei der Herstellung der Probe sollte das Gewebe so flach wie möglich geschnitten werden, um Spannungsgradienten zu minimieren, wenn der Kontakt zwischen den Platten hergestellt wird. Bei Kontakt mit der Probe durchgeführt wird, haben die Gewebe sollten keine Wassertropfen auf sie an dieser Grenzfläche Schlupf zu minimieren. Aber auch das Gewebe darf nicht auf oder während der Messung ausgetrocknet werden , bevor , da dies die Gewebestruktur 13 abgebaut wird. Das Gewebe sollte vollständig mit den Medien nach dem Kontakt zwischen den beiden Platten mit Feuchtigkeit versorgt werden. Klebstoff kann wasserdicht Schmirgelpapier auch an den Platten angebracht werden Schlupf 28 zu minimieren. Zusätzlich axiale Kompression wurde 29 die Größe G 'des Hirngewebes zu verändern gezeigt. Da Rheologie Proben sind in der Regel dünn (~ 5 mm), kleine Änderungen in der Höhe (~ 500& mgr; m) können große Druckspannungen (zB ~ 10%), und damit wesentliche Änderungen in der Schubmodul erzeugen. Außerdem ist , wie die Probe viskoelastischen ist, wird das Material Spannungsrelaxation durch axiale Kompression 28, unterzogen werden, die Messungen beeinflussen können. Somit sollte wiederholten Messungen bei ähnlichen Betriebs axialen Dehnungen durchgeführt werden, und die Probe erlaubt werden sollte , sich zu entspannen (beispielsweise 5-10 min) vor der Messung. Fehler bei diesen Phänomenen verbunden ist, ist eine Begrenzung der Technik. Andere Einschränkungen der Rheometrie umfassen die Annahme , dass das Material homogen und isotrop ist, die oft in Gewebeproben 13 nicht wahr ist. Zusätzlich sollten Temperatur unter physiologischen Bedingungen aufrechterhalten werden , wie es G beeinflussen 'und G "22. Im Hirngewebe speziell erhöhte Temperatur wurde sowohl G verringern gezeigt' und G '' bescheiden , ohne das Potenzgesetz beha WechselVior mit der Frequenz, folgt damit dem Zeit-Temperatur - Überlagerung Haupt 22,30. Unsere Daten sind in guter Übereinstimmung mit früheren Studien 22,27 in Schweinehirn, die ähnliche Größen von G 'und G' 'beobachtet, sowie eine schwache Potenzgesetz Frequenzabhängigkeit sowohl G' und G ".

Das berechnete Verhältnis tan & dgr; = G "/ G '(Abb. 6) eine Basis eines Vergleichs zwischen rheometry und Auswirkungen Einzug bereitstellt. In Auswirkungen Einzug, fanden wir , dass die Energieverlustleistung bei erhöhter Belastung Raten erhöht das Hirngewebe. Mit rheometry fanden wir , dass wie Frequenz erhöht, tan & dgr; auch. mit anderen Worten erhöht, wobei das Material bei höheren Frequenzen mehr ableitende war. Darüber hinaus, während Messungen Auswirkungen Einbuchtung nicht einen Elastizitätsmodul direkt zu quantifizieren, die Eindringtiefen x max Abnahme direkt mit increasing Elastizitätsmodul.

Zusammen bilden die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren auf der Mikro-, Meso- und Makrolängenskalen, und bei unterschiedlichen Belastungsgeschwindigkeiten die mechanische Charakterisierung von Hirngewebe ermöglichen. Die Verfahren hierin präsentierten können auf einer Anzahl von nachgiebigen Materialien verwendet werden, einschließlich sowohl biologischen Geweben und konstruiert Hydrogelen. Mit einer eingehenden Verständnis der Multiskalen-viskoelastischen Eigenschaften des Hirngewebes, können wir Design Materialien entwickelt, besser ist die mechanische Reaktion des Gehirns nachzuahmen. Diese Gewebe simulant Materialien können Vorhersage von mechanischen Beschädigungen und Engineering von Schutzstrategien erleichtern. Zusätzlich können die Materialeigenschaften des Gehirns verwendet werden bioinspirierter Materialien für in vitro zu konstruieren und in vivo Studien besseres Wachstum und Konnektivität von Zellen in das zentrale Nervensystem zu verstehen, insbesondere im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen wie Autismus und Multiple Sklerose.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine Lloyd Laboratoried perscription drug
Ketamine AnaSed Injections perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome) Leica VT1200
Hibernate-A Medium Gibco A1247501 CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO Asylum Research -
Petri Dish Heater Asylum Research -
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere Novascan PT.GS
Cell-Tak Corning 354240 mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N Sigma-Aldrich 59223C alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage Micro Materials Ltd. - probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell Micro Materials Ltd. -
Parallel Plate Rheometer MCR501 Anton-Parr -
PP25  Anton-Parr - 25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper McMaster-Carr 4184A48 alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive Henkel 20268 alternate suppliers can be used

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References

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Charakterisieren Multiskalige Mechanische Eigenschaften von Gehirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Schlag Einrückungen und Rheometrie
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Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).More

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).

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