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Neuroscience

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

doi: 10.3791/54201 Published: September 6, 2016

Abstract

機械的な模擬または組織再生研究のためかどうか、脳の性質に触発された材料を設計エンジニアには、脳組織自体がよく、様々な長さと時間スケールで特徴づけされなければなりません。多くの生物学的組織のように、脳組織は、複雑な階層構造を示します。しかし、大部分の他の組織とは対照的に、脳はPaで数百のオーダーのヤング弾性率をEと、非常に低い機械的剛性のものである。この低剛性は、キーの機械的特性の実験的特性評価に課題を提示することができます。ここでは、異なる長さスケールおよび負荷速度で、例えば、脳組織などの水和、コンプライアントの生物学的材料の弾性および粘弾性特性を測定するように適応されているいくつかの機械的特性評価技術を実証します。マイクロスケールで、我々は原子間力顕微鏡対応のインデントを使用して、クリープコンプライアンスと力緩和実験を行います。 mesosでCALEは、我々は振り子ベースのインストルメント圧子を使用して、衝撃インデント実験を行います。マクロスケールで、我々は周波数に依存するせん断弾性率を定量化するために平行プレートレオメトリーを行っています。また、それぞれの方法に伴う課題や制限について説明します。一緒にこれらの技術は、より良い脳の構造を理解するために、バイオ風の材料を操作するために使用することができます脳組織の徹底的な機械的特性評価を可能にします。

Introduction

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生物学的器官を含むほとんどの軟組織石灰化した骨または工学材料と比較して機械的及び構造的に複雑な、低剛性であり、非線形および時間依存の変形を示します。体内の他の組織と比較して、脳組織は1Paで数百程度の弾性率をEと、格段に準拠しています。脳組織は、異なるとの構造的不均一性を示し、また、機能的に異なるグレーと白質領域を互いにかみ合っ。脳組織の力学を理解することは、傷害の間に脳の応答を模倣する材料と計算モデルの設計に役立つ機械的損傷の予測を容易にし、保護戦略の設計を可能にします。さらに、このような情報は、組織再生のための設計目標を考慮するために使用することができ、より良好な多発性硬化症や自閉症などの疾患と関連している脳組織の構造的変化を理解します。 HERE、我々はメソ、ミクロで、脳組織を含む機械的に準拠した組織の粘弾性特性を特徴づけるために利用可能ないくつかの実験的アプローチ、およびマクロスケールを説明し、実証します。

マイクロスケールで、我々はクリープコンプライアンスを行い、原子間力顕微鏡(AFM)対応のインデントを使用して緩和実験を強制します。典型的に、AFM対応くぼみは、試料2-4の弾性率(または瞬間剛性)を推定するために使用されます。しかし、同一の器具はまた特性5-10(タイムまたはレートに依存)マイクロ粘弾性を測定することができます。 図1に示すこれらの実験の原理は、時間の経過とともに、脳組織内にプローブを片持ちAFMをインデント力や押し込み深さの特定の大きさを維持し、それぞれ押し込み深さと力の対応する変化を測定することです。これらのデータを用いて、クリープCOMPを算出することができますそれぞれliance J Cと緩和弾性率G R、。

メソスケールで、我々は振り子ベースのインストルメントナノインデンターを使用して、組織構造と水和レベルを維持する流体に浸漬条件における衝撃インデントの実験を行いました。実験は、 図2に示されている。振り子が組織と接触するように揺動するように、振動振り子が組織内に静止するまでの変位を時間の関数として記録されているプローブ。プローブの結果として生じる減衰高調波振動運動から、我々は、組織11,12の(エネルギー散逸率に関する)の最大侵入x MAX、エネルギー散逸能力K、及び散逸品質係数Qを算出することができます。

マクロスケールで、我々は、周波数依存のせん断弾性率を定量化するために、平行平板レオメーターを使用しました。組織の貯蔵弾性率G '及び損失弾性率G "を 、と呼ばれるレオメトリーのこのタイプでは、高調波角度歪みを適用する(剪断歪みに対応する)既知の振幅と周波数で及びreactionalトルクを測定(及びせん断応力に対応します) 図3に示すように、測定されたトルクの結果として得られる振幅と位相遅れおよびシステムの幾何学的な変数から、我々は興味13,14の印加周波数で"G '及びGを計算することができます。

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Protocol

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倫理声明:すべての実験プロトコルは、ボストン小児病院の動物研究委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に準拠していました。

1.マウスの脳組織取得の手続(AFM-有効インデントとインパクトのインデント用)

  1. マウスを麻酔するためにケタミン/キシラジン混合物を準備します。 5 mlのケタミン(500 mg / mlで)を1 mlのキシラジン(20 mg / mlで)0.9%食塩水7mlのを組み合わせます。
  2. マウス(品種:; SYN-Creを、TSC1をPLP-EGFP;年齢:P21;性別:男性または女性)を注入ケタミン/キシラジン液のグラム体重あたり7μlの。
  3. マウスが完全に麻酔したら、つま先と尾ピンチへの応答の欠如によって示されるように、大規模な解剖ハサミを使用して、断頭によりマウスを安楽死させます。
  4. 小さい解剖ハサミを使用して中央を切り下げることで頭蓋骨を削除します。小脳で開始し、レム曲がったピンセットを用いて頭蓋骨のオベ枚。頭蓋骨を除去した後、小脳から始まる、脳を持ち上げる平坦スパチュラを使用して、脳を抽出し、ペトリ皿に脳を置きます。カミソリの刃を使用して、脳から小脳を削除します。
  5. 新鮮な組織に影響押込試験のために、脳全体を使用している場合、それ以外の場合は手順をスライスするために1.6に進み氷上の成体神経組織のためのCO 2非依存性栄養培地を用いて丸底チューブに脳を転送し、セクション4に進みます。
  6. 0.7ミリメートル/秒の速度、70ヘルツの振動周波数、および350ミクロンのスライス厚にビブラトーム設定を調整します。氷でビブラトーム皿を囲みます。ビブラプレート上に瞬間接着剤のDABを置き、冠状スライスを切ることができるように、脳が最初の背側を切断するように配向して、脳をマウントします。
  7. ただ脳を沈めるために十分なダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)でビブラトーム皿を埋めます。レイズブレードがちょうどDPBS中に浸されるようにビブラトーム上の一品。
  8. 押して、350ミクロン厚の冠状脳切片をスライス開始し始めます。
  9. 、組織への損傷を避けるためビブラトームDPBS浴から、氷上で成体神経組織のためのCO 2非依存性栄養培地で丸底チューブに脳スライスを転送し、48時間以内に新鮮な組織上で測定を実行するために絵筆を使用しました。 AFM-有効インデント実験を開始するには、セクション3に進んでください。

2.ブタの脳組織取得の手続(レオロジー用)

  1. 地元の肉屋から犠牲の〜1時間以内に矢状にスライスされたブタの半分の脳を取得します。成体神経組織のためのCO 2非依存性栄養培地中で半分の脳を配置し、氷上で保存します。
  2. 成体神経組織のためのCO 2非依存性の栄養培地中で〜5ミリメートル厚の冠状脳切片と店舗を作るためにカミソリの刃またはメスを使用してください。ことを確認し、スライスsurfaceはできるだけ平坦です。セクショニング中にカミソリ/メスで慎重に横方向の動きを使用してください。
  3. 氷上の成体神経組織のためのCO 2非依存性の栄養培地中でストアブタの脳組織および48時間以内の新鮮な組織上のレオメーター測定(第5節)を行います。

3.原子間力顕微鏡対応のインデント

  1. 製造元の指示に従って、イガイ由来の生体接着性と60ミリメートル直径のペトリ(P60)の料理を準備します。
    1. 8.0の最適pHを有する滅菌水に0.1 M炭酸水素ナトリウムからなる中性緩衝液のストックを準備します。フィルター滅菌(0.2ミクロン)、4℃で炭酸水素ナトリウム緩衝液とストア。
    2. 層流フード中で、重炭酸ナトリウム緩衝液中の6.25%のイガイ由来の生体接着3.125%のNaOHの溶液を混合します。
    3. ゾルを広めるために60ミリメートル直径のペトリ(P60)ディッシュと利用ピペットチップ上に3.1.2からの生体接着剤溶液のピペット100μlの3〜5センチメートル直径の円形にution。
    4. (30分〜)の乾燥ソリューション層流フードで明らかになったP60ディッシュのままにしてみましょう。洗浄皿をPBSと滅菌水で2倍と1倍。 1ヶ月まで4℃で密封されたビニール袋での層流フードとストア内の食器の空気が乾燥してみましょう。
  2. AFMにおけるAFMとセットアップ脳試料を調整します。
    注:メーカーごとにAFMキャリブレーション手順に従ってください。
    1. 慎重にプローブホルダに0.03 N / mおよび20μmの直径ホウケイ酸ビーズの公称ばね定数とAFMプローブをロードします。
    2. 熱調整方法15,16を用いたAFMカンチレバーのバネ定数と逆光てこ感度(InvOLS)を調整します。
      注:AFMプローブのばね定数が計算されると、それは、繰り返し使用に一定のままであるべきです。しかし、カンチレバーInvOLSは、レーザがカンチレバーに再編されるたびに再較正する必要があります。また、キャリブレーションポリスチレン等のカンチレバー、より硬めの大きさの基板いくつかの順序に対して実行する必要があります。
    3. 37°Cまでのステージに取り付けられたヒーターと温度設定をオンにします。
    4. セクション3.1で調製したP60皿に脳スライスをマウントします。
      1. ゆっくりイガイ由来の生体接着でコーティングされたP60皿に丸底フラスコから350μmの厚さの脳切片、ならびにCO 2非依存培地を注ぎます。
      2. 優しくP60皿を傾けることによって、皿の中央に脳スライスを配置します。必要であれば、ゆっくりと皿の中央に脳切片をそれ自体の上に折り畳まれたまたはより良い位置している脳スライスを展開するには、手動ピペッターから培地をピペット。
      3. 慎重に(真空を使用しない)P1000ピペッターを使用して余分なメディアを取り出します。
      4. P60皿にカバーを置き、脳切片を20分間付着させます。
    5. AFMヘッドを取り外し、P60に搭載された脳切片を配置AFMステージ上皿、およびCO 2非依存培地予め加温し〜2ミリリットルを追加します。
    6. 慎重にそれは脳切片を周囲の媒体に低下した場合に表面張力によって破壊から保護するためにAFMプローブにメディアのドロップを追加します。
    7. ステージ上にAFMヘッドの位置を変え、それがメディアに浸漬されるまで頭を下げ始めます。
    8. トップビューのCCDカメラを使用して、カンチレバーにレーザーを再配置します。
      注:カンチレバー上のレーザの位置合わせは、空気と媒質の屈折率の差に若干変更されています。
    9. カンチレバーが暖かい液体に沈めさに調整するために5分待ってから、0 Vの自由たわみにミラーの位置合わせをリセット
    10. 製造元の指示16に係るAFMプローブの熱スペクトルを実行します。メディアにAFMプローブのInvOLSを再計算する第1の熱ピークのフィットを使用してください。
    11. 光学顕微鏡を用いて、試料ステージを移動させるようにAFMプローブ下の関心の脳領域。
      注:それは周囲灰白質よりも不透明であるとして脳梁は暗く表示されます。皮質は脳梁に優れています。
    12. 0 Vの自由たわみにミラーの位置合わせをリセット
    13. AFMソフトウェアの合計とたわみメーターで、AFMヘッドに係合するように、「エンゲージ」をクリックします。
    14. カンチレバーと試料との間の接触が行われるまで、AFMヘッドに位置ダイヤルを使用して、頭を下げます。
  3. 以前4,17,18記載されているように(オプション)必要に応じて、試料の弾性率を測定します。
  4. クリープコンプライアンスの実験を行います。
    1. ソフトウェアの機能エディタで加えられた力の関数を構築します。強制機能は、5 nNのセットポイントに0.1秒ランプで構成され、0のNN加えられた力にランプダウン1秒に続いて、20秒のためにそれを保持します。
      1. インデントマスターP上anelは、インデンテーション法の下で、圧子モードの「ロード」を選択します。ユニットの「N」。圧子関数のと「関数エディタ」。
      2. 機能エディタでは、セグメントPARMSパネルに、0 nNので始まり、加えられた力の機能セグメントを作成し、0.1秒の時間で、5 nNので終了。 " - >挿入」をクリックしてください。
      3. 次のセグメントについては、20秒に5 nNの、5 NNに終わり、時間に開始設定。 " - >挿入します。」をクリックします
      4. 最後のセグメントについては、1秒に5 nNの、0 NNに終わり、時間に開始設定。 「ドロー」と機能エディタウィンドウを閉じる]をクリックします。
    2. マスターパネルのフォース]タブで、「トリガ後の圧子のランプ」をチェックし、0.1 Vのトリガーポイントに到達した後にトリガするために加えられた力の機能を設定します
    3. クリープコンプライアンスのために構築され、加えられた力の関数をトリガする、マスターパネルの力タブの下部にある「シングル・フォース」をクリックしてください。
    4. 後に単一の力インデントが終了し、ヘッドを-従事直し、再ゼロフリーのたわみを、それがサンプルと接触しないように、AFMヘッドを上げて。
    5. 関心の新たな領域を見つけ、接触を作るためにAFMヘッドを下げるために試料ステージの位置を変更します。注:試料ステージが移動したときAFMヘッドが試料表面から後退しなければなりません。これを怠ると、繊細なAFMカンチレバーに損傷を与えることができます。
    6. 反復ステップ3.4.3-3.4.5データの所望の量が収集されるまで。
  5. 力緩和実験を行います。
    1. ソフトウェアの機能エディタで適用するインデント機能を構築します。インデント機能が3μmのセットポイントに0.1秒ランプで構成され、0ミクロンの押し込み深さまで下降1秒に続いて、20秒のためにそれを保持します。
      1. インデントマスターパネルでは、インデンテーション法の下で、圧子モードの「インデント」を選択します。単位は「メートル」。そして、 ";圧子の機能の機能エディタ」。
      2. 機能エディタでは、セグメントPARMSパネルに、0.1秒の時間で、3ミクロンで終了、0ミクロンから始まり、加えられた力の機能セグメントを作成します。 " - >挿入」をクリックしてください。
      3. 次のセグメントについては、3以上3μm以下、最後に起動して設定し、20秒までの時間。 " - >挿入します。」をクリックします
      4. 最後のセグメントについては、0以上3μm以下、最後に起動して設定され、1秒までの時間。 「ドロー」と機能エディタウィンドウを閉じる]をクリックします。
    2. マスターパネルのフォース]タブで、「トリガ後の圧子のランプ」をチェックし、0.1 Vのトリガーポイントに到達した後にトリガするために加えられた力の機能を設定します
    3. 力の緩和のために構築・適用するインデント機能をトリガする、マスターパネルの力タブの下部にある「シングル・フォース」をクリックしてください。
    4. 単一の力インデントが終了された後になるように、AFMヘッドを上げますサンプルおよび再度従事ヘッドおよび再ゼロたわみとの接触のうち。
    5. 関心の新たな領域を特定するために、ステージの位置を変えて、接触を作るために頭を下げます。
    6. データの所望の量が収集されるまで繰り返して、5.3から5.5を繰り返します。
  6. 実験とクリーンアップを締結。
    1. 実験を終了した後、AFMヘッドを上げ、サンプルから削除します。
    2. 慎重にカンチレバーに触れることなく、過剰な液体を除去するために、ラボの組織を使用してください。
    3. 慎重に少量のエタノールを使用したAFMカンチレバーホルダーを清掃してください。エタノールへのカンチレバーホルダにデリケートな電子機器を置かないでください。貯蔵容器内のAFMカンチレバーと場所を削除してください。
    4. 適切なバイオセーフティプロトコルに従うことによって、脳組織試料を処分。
  7. LeeとRadok、1960によって誘導された解決策によれば、MATLABは、クリープコンプライアンスを計算し、圧子の幾何学的形状を使用して、緩和弾性率を強制的に使用して、 19。
    1. Fと押し込み深さを計算します式(1)カンチレバーの位置zのデータ、偏向D、およびバネ定数k cから

      式(1)そして式(1)
    2. Linら 20に記載されたアルゴリズムを使用して押込み曲線に沿って接触点の位置を確認します。
    3. データ分析のための目的のウィンドウを定義します。関心のウィンドウ( 図1C、Dに示すように、すなわち 、リージョン3)(力の緩和のため)(クリープコンプライアンスのための)力あるいは押し込み深さのいずれかが設定値に維持される領域です。
    4. クリープコンプライアンス実験のために、実験的なクリープコンプライアンス係数を計算し、J cの(トン)、ステップ負荷に応じて、nは1 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      式(1)
      H(t)は Heavysideステップ関数であり、そしてRは、球形プローブの半径です。
    5. 力緩和実験のために、ステップ押込み深さに応じて、実験的な力緩和弾性率、G R(t)を計算します式(1)
      式(1)

4.インパクトインデント

  1. インストルメントナノインデンターを校正し、製造元の指示に従って、水和脳組織に動的衝撃実験を可能にするために、デフォルトの設定を調整します。
    1. ピンセットを使用して、振り子の上にスライドさせて球状プローブをマウントします。
    2. 翻訳にねじ込まれているサンプルポスト、上に溶融石英サンプルを接着ステージ。
    3. キャリブレーション]メニューに移動し、選択 "液体セルを。」溶融石英サンプルと接触するためにソフトウェアの指示に従ってください。
    4. 圧子の種類は、「ノーマル」を選択し、圧子の負荷のために0.05 MNのデフォルト値を使用します。通常の圧子構成のためのキャリブレーションを実行するには、「続行」をクリックします。
    5. 少なくとも5ミリメートルバック試料ステージを移動します。プローブは、液晶セル内に下降することを可能にするレバーアームを、マウントし、圧子の種類については、「液晶セル」を選択して、新しい構成で液晶セルのキャリブレーションを繰り返します。液体セル校正係数を得るために、「続行」をクリックします。
    6. 実験メニューに移動し、選択することにより、液晶セルのソフトウェアオプションを有効にし、「特別なオプションを。 "最新の校正値を使用します。
    7. これはHIGをテストする際に必要となる大きな測定可能な最大深さ、につながるように、キャパシタプレートの間隔を増やしますHLY準拠材料。
      1. システムメニューの下で、それぞれ0.5 MN /秒、0.1 MN /秒、および3 Vにオフセット振り子テスト負荷率、ゼロ負荷率、およびスタンバイランプを変更するには「非保護の設定」および「マシンパラメータ」を選択します。
      2. レンチで、少しずつ時計回りに間隔コンデンサプレートを制御する3つのナットを回します。
      3. 各完全な時計回りのターンの後、メンテナンスメニューの「ブリッジボックスの調整」を選択し、離れて振り子からのカウンターバランスウエイトを移動する必要があります良い振り子試験を、取得します。
      4. 手順を繰り返します4.1.7.2-4.1.7.3おおよその深さ校正7万NM / V以上の値を読み込むまで。
    8. 電源を経由してオンとオフを切り替えることができます振り子の下部に新たなリミットストップを置きます。振り子運動の潜在的な障害物を除去し、高いを可能にするために、振り子の後ろに座って、元の限界停止を撤回衝突速度と同様に準拠したサンプルへの侵入深さが高いです。
    9. キャビネットが熱平衡に到達させる(約1時間かかります)。
    10. キャビネットが平衡する一方で、システムメニューに戻り、「非保護設定」を選択し、「マシンのパラメータを。」 1ミクロン/秒に深さ校正(DCAL)接触速度を設定し、3ミクロン/秒に一次インデントの接触速度、および1ミクロン/秒の超低負荷接触速度。
    11. キャリブレーションメニューでは、この新しい構成では、標準的な深さのキャリブレーションを行います。
    12. ソレノイド用の電源をオンにして、実験メニューに移動し、選択し、「インパクト」と10 Vに設定された「インパルス変位を調整します。」振り子のスイング距離を較正するためにソフトウェア命令(自動プロンプトに)従ってください。
  2. 液晶セル内のマウスの脳組織をマウントします。
    1. STEから全脳を採取した後、P 1.5は、氷の上の成体神経組織のメディアのためのCO 2非依存性栄養培地中で、すぐにそれを格納します。
    2. インパクトのインデントの設定が完全に完了したら、慎重にCO 2非依存培地と共にペトリ皿に脳を転送します。いずれかの側の平らな面を持つ6ミリメートルの厚さの切片に脳をスライス。
    3. シアノアクリレート接着剤の薄層でアルミニウム試料ポストにスライスした組織を接着します。
    4. サンプルポストに第2のOリングを介して液晶セルをスライドさせ、完全に組織を浸漬するCO 2非依存培地5mlで液体セルを埋めます。このサンプル・ポストは、その後慎重にインストルメントナノインデンター内部並進ステージ上に搭載されています。
  3. 脳組織の衝撃応答を測定します。
    1. 必要であれば、球状プローブを除去し、レバーアームを取り外すことなく、目的のプローブと交換してください。
    2. システムメニューの下で、非が保護」を選択します設定」および「マシンのパラメータ。 "/秒5μmの一次衝突接触速度を変更します。
    3. レバーアームの先端が適切にバスの上に位置されるまで遠く振り子(+ x方向)からのサンプルの低浴(-z方向)とすると、-x方向に移動します。チップが完全に浴に、試料の前に浸漬されるまで、+ z方向に移動します。
    4. サンプルステージ制御ウィンドウを使用して、慎重に接触し、その後、約30μmにより試料表面から離れてステージをバックアップ。
    5. 実験メニューで、衝撃実験を設定するには、「インパクト」をクリックします。スイング距離校正に基づいて生じた衝突速度に直接関係する特定の衝撃荷重を選択してください。スケジュールされた実験を実行します。
    6. 振り子が戻ってスイングすると、試料表面を測定面に移動し続けると、下限停止スイッチをオフにします。
    7. 振り子がFORWスイングするように観察しますサンプルに影響を与えるARD。時間の関数としてのプローブの変位は、ソフトウェアによって記録されます。
    8. XYZステージウィンドウが表示されたら、背面の限界停止スイッチをオンにします。
    9. 繰り返しますが、必要な数の異なる負荷と場所をテストするために、3.4から3.8を繰り返します。
  4. 最大侵入x MAX、エネルギー散逸能力K、及び散逸品質係数Qを決定するためにカスタマイズされたMATLABスクリプトを使用して、振り子の時間応答対取得した変位を分析する。11
    1. Analysisメニューに移動し、テキストフ​​ァイルにデータをエクスポートします。
    2. 時間の関数としての速度を得るために、変位プロファイルの時間微分を取ります。接触点x O1としてゼロ変位を設定します。
      注:インパクト速度vは連絡する直前の最大速度であり、X maxでプローブの変形に対応しています。速度が最初にゼロに減少する。X O 2、X rに相当する、次のサイクルにおける変形試料との接触を再開するために必要な位置です。反発速度V outは、変位x rにおける速度です。
    3. 最初の衝撃サイクル中に回収され、散逸サンプルエネルギーの和によって正規化サンプルによって消費されるエネルギーとしてK(無単位)を定義します。 (このような回転剛性や減衰係数など)振り子21の固有の特性に基づいて、Kを計算 、X O1、 最大 で、x r X、V IN、及びv アウト
      詳細については、1がKalcioglu ら、2011年の仕事を協議することができます
    4. 変位が減衰高調波振動運動として記述することができるので、DISの最大値まで指数関数的減衰関数をフィット対時間曲線配置。
    5. Eの要因によって減少し発振振幅に必要なサイクル数を乗じたπとしてQ(単位なし)を算出します。高いQ値は、より低いエネルギー散逸率を意味します。

5.レオロジー

  1. アップを設定し、製造業者の指示に従ってレオメーターを校正。
    1. デバイス/コントロールパネルを開いて、レオメーターを初期化します。コントロールパネル]タブで、「初期化」をクリックします。
    2. 25ミリメートル径の測定プレート(PP25)と熱システムをマウントします。
    3. (オプション)、レオメータープレートと組織との間のスリップを軽減トップレオメータープレートの形状に合わせた接着剤紙やすりスライスを切り出し、上部と底板に紙やすりを接着します。
    4. コントロールパネルの「ゼロギャップを設定する」をクリックするだけで、トップと底板との間の接触を作ります。
    5. ゼロCLIによる通常の力変換器「垂直力をリセットします。 "弄ぶ天使
    6. 「測定システム」をクリックし、コントロールパネルのサービス]タブを開いて、「慣性テスト」をクリックすることで、慣性試験を行​​います。新旧の慣性を記録します。メーカーによって記載されている慣性は、プローブの許容限度内であることを確認します。
  2. レオメーターにロードしたサンプル。
    1. 組織を採取し、〜5ミリメートルの厚さに豚の脳の冠状セグメントをスライスした後、CO 2非依存培地中の氷の上に保管します。
    2. 二つのプレートの間に脳を置きます。滑りを防止するために、サンプルの上下面から大きな水滴を削除しますが、サンプルを乾燥させません。
    3. プレートは、組織の表面と完全に接触しており、測定された垂直力は5〜10分の緩和期間の後に0.01ミネソタ一貫した状態になるまでゆっくりと測定プレートを下げます。
      1. コントロールパネルで、私は順次低い高さを入力します。nは測定位置ボックスとゆっくりと測定プレートを下げるために、「測定位置」をクリックします。
      2. プレートが完全に組織の表面に接触するまで、組織との接触のミリメートル以内に0.1ミリメートル単位で測定プレートを低下します。測定-通常の力は5〜10分の緩和期間の後に0.01 mNとで一貫していることを確認してください。
      3. 初期測定された垂直力を記録します。反復測定は、同一の圧縮応力/歪みで取られるべきです。
    4. サンプルプレートの直径を超えた場合、プラスチックの刃で試料をトリミング。組織を水和するために、試料のエッジ上のメディアの少量(〜1〜2ミリリットル)をピペット。
    5. (オプション)サーマルフードを下げます。コントロールパネルで、37℃に温度を設定し、「設定」をクリックします。
  3. 材料の線形粘弾性範囲( すなわち、せん断を確立するために、振幅スイープを実行します関心( 例えば、1ラジアン/秒)の周波数でのG 'およびG' 'が一定であるで株)。
    1. 「ファイル/新しい」を選択します。ゲルタブで「振幅スイープ:LVE-範囲」を選択してください。ウィンドウを選択し、クリックして「測定1:振幅スイープ "発振ボックスをダブルクリックします。最初と最後の歪みを入力します( 例えば、105から0.01)、周波数( 例えば、1ラジアン/秒)とディケードあたりのポイント数( 例えば、6点/ 12月)。 「OK」を選択し、スタートをクリックします。」
    2. 線形弾性範囲の一貫性を確保するために、繰り返し試験で数のスライスについて、この手順を繰り返します。サンプルの軸方向の圧縮は、サンプル間で一定のままであるべきです。
  4. 組織の線形粘弾性範囲( 例えば、1%の歪み)22であり、関心の周波数範囲( 例えば 、0.1から100ラジアン/秒)で歪みで組織の周波数掃引を行っています。
    1. クリック 「ファイル/新しい」とゲルタブの下には、「周波数掃引」を選択します。周波数スイープ:ウィンドウ/計測1]をクリックします。発振ボックスをダブルクリックします。周波数範囲( 例えば 、0.1から100ラジアン/秒)、歪み( 例えば 、1%の歪み)とディケードあたりのポイント数を入力します( 例えば 、6点/ 12月)。 「OK」を選択し、周波数掃引を開始するために、「開始」をクリックします。
  5. 重複または三連で繰り返し周波数スイープ(ステップ5.4)。
  6. G 'およびG "周波数の関数(周波数掃引)やせん断ひずみ(振幅スイープ)注:。G'およびG ''は 、サンプルの(最大値から計算され、自動的にレオメーターによって計算され、エクスポートされたデータを確認します)reactionalトルク振幅T '0、回転変位角(または偏向角) 式(1) 、及び位相遅れ印加された振動ひずみに対するサンプルの応答( 3)の式1 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>、:
    式(1)
    式(1)
    R hは 、試料の半径と高さです。

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Representative Results

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図4は 、それぞれ適用された力あるいは押し込み深さ( 図4A、D)、与えられた、クリープコンプライアンスのための時間応答( 図4B、E)対代表インデントと力を示し、リラクゼーション実験を強制します。これらのデータおよびシステムの幾何学的形状を使用して、クリープコンプライアンスJの C(t)と緩和弾性率G R(t)を強制することは、脳の異なる領域( 図4C、F)について計算することができます。以前の研究は、脳23の異なる領域の弾性率の差を示しているが、粘弾性特性は、所与の組織切片内の地域間変動を示していないマウスの脳組織切片のためにこのようにして測定しました。

インパクトのインデントは、空間的および時間的にconcentraの高速で組織の機械的特性を測定しますテッド・ロード。これらの実験の結果は、組織が外傷や手術に伴う意図的な変形に応じてエネルギーを消費する方法についての情報を提供します。衝撃押込みプローブの減衰振動運動( 図2B)は、最大浸透x MAX( 図5A)、エネルギー散逸能力K( 図5B)と組織のエネルギー散逸率Q( 図5C)を計算するための情報を提供します。侵入深さが強く、組織の弾性率と相関変形抵抗を測定する:硬い組織が与えられた衝突速度や衝突エネルギーより小さい侵入深さを示します。エネルギー散逸能力組織は、最初の衝撃サイクルの間に衝撃エネルギーを散逸する程度の単位のない尺度です。散逸品質係数の測定サイクル数Iからの振動の前に発生しますMPACTは著しく減衰される - これは、時間の単位で表されていないが、これは、エネルギー散逸の速度に直接関係します。これら三つの衝撃応答パラメータは、組織の速度に依存する特性を研究するための手段を提供する、別の衝撃速度で定量することができます。

図6は、0.1ラジアン/秒から50ラジアン/秒までの範囲の周波数に対してマクロスケールのG 'G "を示している。貯蔵弾性率がほぼ低周波数での損失弾性率よりも大きい大きさのオーダーである。しかし、貯蔵弾性率および損失弾性率との比を周波数が増加するにつれて減少する。これは、貯蔵弾性率は、弾性特性を説明し、損失弾性率は材料の粘性損失を説明するので、弾性特性は、脳組織の挙動を支配することを示している。十分に高い負荷周波数で、貯蔵弾性率および損失弾性率を同一視し、点を示すれます材料は、( すなわち 、粘性特性はサンプルの挙動を支配する)流れ始めます。本明細書に示されるように測定された脳組織の場合には、計測器の物理的な限界は、私たちは、より高い周波数での材料特性を測定することはできません。

図1
AFM対応のクリープコンプライアンスの 図1. イラストや緩和実験を強制します。(A)AFM-有効インデントは自由端に取り付けられたマイクロスケール半径にナノの球状ビーズで柔軟なカンチレバーを用いて行われます。 (B)インデントの間、カンチレバーのたわみは、レーザを用いて測定されるカンチレバーの端からフォトダイオードへ反射されます。 (C)フォース緩和実験は、一定の印加深さにカンチレバーをインデントによって行われ、一方のresと力崩壊時間にPECTが測定されます。 (D)クリープコンプライアンスは一定の印加力でカンチレバーの変更押し込み深さを測定します。 (C)及び(D)は、5つの領域(緑のテキスト)に分割されている:試料表面のAFMプローブ(1)アプローチ、(2)試料と接触し、設定値のインデント/力まで上昇、(3)設定値のインデント/力の維持、(4)ランプダウンと試料表面からのAFMプローブの(5)後退。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
インパクトのインデント実験の 図2. イラスト。インパクトのインデントの(A)の回路図、完全に水和条件で実験を行う能力を示します。 (B)Represマウス脳切片および対応する速度プロファイルから収集し、時間の関数としてentativeプローブ変位プロファイル。主な測定変位と示されているエネルギー散逸を定量化するために使用され算出された速度パラメータを設定します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
平行板レオメーター実験の図3.イラスト。平行板レオメーター実験と適用された振動剪断ひずみに関連した定義の(A)の回路図。 (B)代表は、時間の関数としてのひずみと結果のストレスを適用しました。せん断貯蔵弾性率G '及びせん断損失弾性率G "は歪み振幅を介して計算されます54201 / 54201eq12.jpg "/>、トルク振幅T '0、位相遅れ式(1) 、探針と試料の半径R、およびサンプルの高さh。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図クリープコンプライアンスから4.代表的なデータとリラクゼーション実験を強制します。(A、B)は、 図1中の生データからは、関心領域は、加えられた力は押し込み深さながら、(A)一定のまま時間としてクリープコンプライアンスのために定義されています(B)測定されます。 (A)の挿入図は、AFMピエゾができませんでした失敗した実験からのデータを示しています加えられた力と、(B)の挿入図を維持するためには、(B)に示す成功実験のデータと定性的に類似している対応する凹み応答を示しています。加えられた力からのデータを、測定インデント、およびプローブの幾何学の知識と(C)は 、クリープコンプライアンスJ c (t)が計算されます。時間に対する力を測定しながら(D、E) 、力緩和は、押し込み深さ(E)、(D)一定に保持されます。これらのデータを使用して(F)は 、力の緩和弾性率G R(t)を計算することができます。クリープコンプライアンスと強制緩和実験は、このような脳梁(赤)および皮質(青)などの脳の解剖学的に別個の領域、に行うことができます。 (C、F)のデータは、n = 5匹のマウスからの測定値の平均である。 CLICくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをk個。

図5
図衝撃押込み実験から5の代表的なデータ、最大浸透x MAX、エネルギー散逸能力K、およびマウス脳組織の損失品質係数Qは、異なる衝撃速度で得られた生変位プロファイルから計算されます。データは。平均値±標準偏差として表された(n =ポイント当たり18反復測定)されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
レオメトリー実験から図6の代表的なデータ。ストレージG 'と損失G ''豚の脳の冠状切片からの弾性率。量のtanδは、貯蔵弾性率に対する損失の比として計算されます。データは。平均値±標準偏差として表された(n =ポイント当たり4反復測定)されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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本論文で各技術は、脳組織の機械的性質の異なる側面を測定します。クリープコンプライアンスと応力緩和弾性率は時間に依存する機械的特性の尺度です。貯蔵弾性率および損失弾性率は、速度に依存する機械的特性を表します。インパクトインデントも速度に依存する機械的特性を測定したが、エネルギー散逸のコンテキストインチ組織の機械的特性を特徴づけるとき、両方のAFM対応インデントおよびレオロジーは、通常の方法を使用しています。前述のように時間に依存する材料特性を提供することに加えて、種々の実験パラメータは、細胞および組織の弾性率4、さらに周波数依存特性24を測定するために使用することができるので、AFM対応インデントは特に有用です。しかし、実験のデータと設計の正確な解釈は準拠して、水和した組織のために挑戦することができます。レオメトリー対策が適切一括ながら組織、AFM-有効インデントの絆は、細胞の微小環境に関連するマイクロスケールのボリュームを検査します。インパクトのインデントは、材料が焦点衝撃による外傷性脳損傷を研究するような用途において有用である濃厚、動的衝撃荷重の文脈に変形する方法を具体的に定量化する手段を提供します。各手法の結果を直接比較することはできませんしながら、以下に説明するように、インパクトのインデントを介して測定エネルギー散逸特性は、レオロジーを介して測定せん断損失弾性率と同じ傾向をたどります。

本明細書に示さ脳組織のAFM対応のインデントでは、クリープコンプライアンスと力の緩和を使用して粘弾性特性を測定しました。そのため、AFMプローブの小規模のため、この技術は、それぞれ、脳梁および皮質( の白と灰白質領域としての脳の解剖学的に異なる領域の機械的特性を測定することができます。4

我々は、このように測定された脳組織の粘弾性挙動が以前エルキン・モリソン26で結果を報告と定性的に類似していることを見出しました。緩和弾性率の測定値の大きさが一致していないが、これは、実験条件の違いによる可能性があります。エルキン&モリソンは、当社の直径20μmの球に比べて、直径250μmのフラットパンチを使用しています。我々はマウスから得られた脳組織の測定を実施しながら、さらに、エルキン&モリソンは、ラットの脳組織上で測定を行います。これらの違い、両方の技術のMEASにもかかわらず、脳梁の白質が前頭面における皮質の灰白質よりも低い緩和弾性率を示すことが、より具体的に脳組織内の異種の機械的特性をured、または。

我々がクリープコンプライアンスを計算し、要求されたステップ負荷またはステップのくぼみに応じて緩和弾性率を強制しながら、それぞれ、実験的に作用する荷重とインデントが理想的(瞬時)ステップ関数ではないことに注意することが重要です。ロードおよびくぼみは、短い時間スケール(<1秒)の上に適用され、これらの荷重履歴を測定し、クリープと弛緩反応7,25に影響与えることができます。クリープコンプライアンス弾性率のわずかな過大評価で適用されるステップ負荷結果を想定しながら具体的に、過小評価緩和弾性率のわずかに適用されるステップインデント結果を仮定。実際と計算された弾性率との間に不一致がランプ速度として減少しますかかる荷重とインデントの増加。

負荷の緩和を行う上で重要なステップは、( すなわち 、設定値は、加えられた力に直接関係のフォトダイオード電圧に相当)が維持力の適切な大きさを選択します。クリープコンプライアンスのセットポイント力が選択されな​​ければならないように:(1)応答が押し込み深さで容易に測定可能な変化を生じさせるのに十分な大きさです。 (2)設定値の力を維持するのに必要な押し込み深さをAFMカンチレバーのベースの垂直位置を調節するAFMの圧電アクチュエータの範囲の外にドリフトするほど大きくならないように十分に小さいです。提示されたプロトコルでは、我々は我々の実験のためによく働いた5 nNの、の設定値の力を示唆しています。 AFMピエゾが原因で動き、その制限された範囲( 図4A、挿入図を参照)、その力を維持することができない場合には、その値を下げることができます。この実験的な問題はencountではありませんフィードバックループを介して、安定した計算された押し込み深さを維持する力緩和実験でered。

nanoNewton(NN)規模の部隊とミクロンスケールの深さでの準静的AFM対応インデントとは対照的に、インパクトのインデントは、MN-規模部隊の濃縮動的負荷を適用し、ミリスケールに近づい深さまで試料の変形応答を測定します。我々は以前、心臓や肝臓9,11,12の挙動を定量化するために、衝撃のインデントを使用し、それらの器官からの組織のための負荷速度でのエネルギー散逸応答の同様の依存性を観察しています。

インパクトのインデントはミクロンからミリメートルまでのプローブ半径を収容することができます。さらに、衝撃押込み実験は、水和した組織21の機械的な特徴付けを可能にする完全に浸漬した環境で行うことができます。このような脳組織として非常に準拠したサンプルをテストする場合、インプortant考慮事項が考慮されなければなりません。まず、材料への最大測定深度は約1mm、器具自体の長さスケールで設定された制限です。任意の更なる振り子の変位が物理的に振り子と固定磁性板の上部に位置する電磁コイルとの間の衝突によって停止されます。脳組織の場合、これは正常に約5mm /秒にも適用することができる最高の衝撃速度を制限します。衝突速度 ​​が注文ミリメートル/秒であるが、対応するひずみエネルギー密度が原因でプローブ半径11の小さな寸法に、弾道条件に近づくkJの/ m 3で、程度であることに注意してください。器具は、プローブと組織表面との接触を検出するための第二に、潜在的に困難になることができます。試料ステージは、プローブに向かうように振り子が移動する試料によって押し戻されると、接触が検出されます。しかし、のために非常にcomplianプローブがサンプルに浸透しつつトンのサンプルは、振り子が検出可能に偏向されない場合があります。

この問題に対処するために、我々は、試料ステージバック振り子を駆動するための接触時に大きな勢いが存在することになるように移動する速度を増加させることができます。サンプルはまた、適切な接触点を検出するエラーを最小限に抑えるために、できるだけ平坦であるべきです。最後に、振り子の上部に電磁電流が第1の衝突事故後の浸透のための駆動力を供給し続けることに衝撃荷重が、真のインパルス負荷ではないことに注意してください。その結果、クリープは、エネルギー散逸特性の解析を複雑にする、より高い負荷条件下で特に起こり得ます。この技術のさらなる研究は、顕微鏡を介して組織サンプル表面の視覚化を体温での研究を可能にするように温度制御を導入すること、を含む、衝撃応答からクリープ応答を切り離す含むことができます液晶セルとの互換性電子。

レオメトリーは、マクロスケールレベルでの粘弾性固体の周波数依存の機械的特性を測定します。せん断弾性率成分、貯蔵G '及び損失G」は 、典型的には、機器、プローブジオメトリ、及び試料13に応じて、10〜100ラジアン/秒に0.001ラジアン/秒にわたる範囲の周波数で測定することができる。正確な測定のために、振幅スイープは、材料の線形弾性範囲を決定する前に、周波数掃引に行われるべきである。これは、G 'およびG' ' 14,27一定に保たれるひずみの範囲で周波数のために選択されたせん断ひずみ。掃引は、十分なトルクが測定中に達成されるような線形粘弾性限界(典型的には1~2%のせん断ひずみ)内で可能な限り高くあるべきである。測定時のトルクが常に確実にするために、製造業者によって提供される許容範囲内にあるべきです対雑音比ufficient信号。

さらに、使用レオメトリープローブは、トルクを最大にするために、できるだけ大きくなければならないが、完全に13サンプルとオーバーレイしなければなりません。試料を調製する際に、組織接触は、プレート間で行われたときの応力勾配を最小限に抑えるために、できるだけ平らにスライスされるべきです。接触がサンプルで作られた場合、組織は、そのインターフェイスでのスリップを最小限に抑えるために、その上に任意の水滴を持つべきではありません。これは組織構造13を劣化させるようしかし、組織はまた、前または測定中に乾燥させてはいけません。組織が完全に両プレート間の接触後にメディアで水和する必要があります。接着剤、防水紙やすりもスリップ28を最小化するためにプレートに取り付けられてもよいです。さらに、軸方向の圧縮は、脳組織29G 'の大きさを変化させることが示されています。レオロジーサンプルは典型的に(約5 mm)の薄膜であるため、高さの小さな変化は、(500〜μm)は大きな圧縮株( 例えば 、〜10%)、および剪断弾性率で、したがって重要な変化を生成することができます。サンプルは粘弾性であるとしてさらに、物質が原因の測定値に影響を与える可能性が軸方向圧縮28に応力緩和を受けます。このように、繰り返し測定は、同様に動作し、軸方向ひずみで行われるべきであり、サンプルは、測定前に( 例えば、5〜10分)をリラックスさせるべきです。これらの現象に関連したエラーは、技術の限界です。レオのその他の制限は、多くの場合、組織サンプル13で真実ではない材料が均質で等方性であるという仮定が含まれます。さらに、温度は、それがGに影響するように、生理学的条件下で維持されるべきでべき乗則behaを変更することなく、適度とG ''G "22。脳組織において特異的に、温度上昇は、両方のGを減少させることが示されています[このように時間-温度重ね合わせプリンシパル22,30を以下の周波数でvior、。我々のデータは、G 'およびG' 'の同様の大きさだけでなく、両方のG'G "に弱いパワー則周波数依存性を観察したブタの脳内の以前の研究22,27、とよく一致しています。

算出された比率のtanδ= G "/ G '( 図6)は、レオメトリー衝撃くぼみの間の比較の基礎を提供する。衝撃インデントでは、脳組織のエネルギー消費容量を大きく負荷率とともに増加することを見出した。レオメトリーを使用して、我々はことを発見しました周波数が増加すると、tanδはまた、換言すれば、材料は、より高い周波数でより多く電力を消費した。増加した。また、衝撃押込測定は直接弾性率を定量化していないが、直接侵入深さX最大減少increasinとグラム弾性率。

一緒に、この論文に記載された方法は、マイクロ、メソ、およびマクロの長さスケールでの脳組織の機械的特性評価を可能にし、異なる負荷率で。本明細書に提示される方法は、生物学的組織および操作ヒドロゲルの両方を含むコンプライアント材料の数を使用することができます。脳組織のマルチスケール粘弾性特性の深い理解では、我々は脳の機械的応答を模倣するように設計設計資料をより良くすることができます。これらの組織模擬材料は、機械的損傷、保護戦略のエンジニアリングの予測を容易にすることができます。さらに、脳の材料特性が良く、特にそのような自閉症および多発性硬化症などの神経疾患の文脈において、中枢神経系における細胞の増殖および接続性を理解するために、インビトロおよびインビボ研究におけるバイオインスパイアード材料を設計することができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine Lloyd Laboratoried perscription drug
Ketamine AnaSed Injections perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome) Leica VT1200
Hibernate-A Medium Gibco A1247501 CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO Asylum Research -
Petri Dish Heater Asylum Research -
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere Novascan PT.GS
Cell-Tak Corning 354240 mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N Sigma-Aldrich 59223C alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage Micro Materials Ltd. - probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell Micro Materials Ltd. -
Parallel Plate Rheometer MCR501 Anton-Parr -
PP25  Anton-Parr - 25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper McMaster-Carr 4184A48 alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive Henkel 20268 alternate suppliers can be used

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References

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原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます
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Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).More

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).

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